Qualitativer und quantitativer Nachweis von Antibiotika

Transkript

1 Qualitativer und quantitativer Nachweis von Antibiotika in der milchwirtschaftlichen Praxis Dr. Katrin Kloth 3. Triesdorfer Milchrunde 17. November 2011 MPR, Wolnzach

2 Problemstellung Antibiotika sind in der Milchviehhaltung unverzichtbar! Auch wenn der Einsatz von Antibiotika minimiert werden kann, so ist die Behandlung kranker Tiere ein Gebot der Menschlichkeit = praktizierter Tierschutz! Wenn Antibiotika eingesetzt werden, kann es auch bei Beachtung aller Vorsichtsmaßnahmen zu Rückständen im Lebensmittel Milch kommen.

3 Problemstellung Rückstände von Antibiotika in Milch sind unerwünscht (Allergiepotential, Resistenzbildung, toxische Effekte) EU-VO 470/2009 u.a. Rückstandskontrollen in der Milch nicht nur gesetzlich vorgeschrieben, sondern auch Frage der Verantwortung des Lebensmittelherstellers gegenüber dem Verbraucher = praktizierter Verbraucherschutz! Unter heutigen Produktionsbedingungen gilt: Hemmstoff = Rückstand eines Antibiotikums

4 Problemstellung Spätestens seit 1990 gibt es eine Diskrepanz zwischen Soll und Ist! Die EU-VO 2377/90 setzte für 42 Antibiotika MRLs in Milch fest (Maximum Residue Limits = Rückstandshöchstwerte), es gab aber und es gibt bis heute keine in der Praxis verfügbaren bzw. bezahlbaren Methoden, mit denen diese MRLs (lückenlos) überwacht werden könnten.

5 Voraussetzung für Einhaltung der MRL Identifizierung des Wirkstoffes / Rückstandes Qualifizierung Bestimmung der Konzentration / Vergleich mit MRL Quantifizierung QuaQua!

6 Aktuelle Entwicklung MilchGüV Anzahl Hemmstoffpositive Proben S P

7 Aktuelle Entwicklung MilchGüV Hemmstoffpositive Fälle sind deutlich rückläufig! Warum? MilchGüV ,14% der Lieferanten bis 06/2011 0,11% Eigenkontrolle (Selbsttests, kostenlose Tests durch Molkerei) Aufklärung/Sensibilisierung durch Molkereien, Tierärzte, MPR u.a. Neue LM-Hygiene-Recht seit 2006 (konkrete Maßnahmen in Bayern seit März 2008) jeder Hemmstofffall wird an die zuständige Behörde gemeldet Besuch durch Amtstierarzt Mehrfachtäter (innerhalb von 36 Monate mehr als 1 Hemmstofffall) zusätzlicher Besuch durch MPR-Mitarbeiter Betriebsbegehungen bis 06/ Betriebsbegehungen tägliche Probenahme Beprobung jeder Lieferung Rückstellprobe

8 Aktuelle Entwicklung MilchGüV 70 [%] Anteil 60 Tägliche Probenahme

9 Wie kommen Hemmstoffe in die Milch?

10 Wie kommen Hemmstoffe in die Milch?

11 Wie kommen Hemmstoffe in die Milch? Verschleppung durch Melkpersonal Vertretung, Unachtsamkeit Spülfehler, Melkreihenfolge, Filter kontaminiert Verschleppung durch Melkmaschine Sonstige

12 Wie kommen Hemmstoffe in die Milch? Unter Antibiotikaschutz trocken gestellt und vorzeitig abgekalbt Wirkstoff: Cloxacillin Bei einer Trockenzeit von weniger als 7 Wochen muss die Milch vor dem Inverkehrbringen zuerst auf Hemmstoff- Freiheit untersucht werden. Wartezeit nicht eingehalten

13 Wie viel Arzneimittel verursacht welchen Schaden? 600 mg Cloxacillin entspricht 1 Euterinjektor 30 mg Cloxacillin L Milch 2400 mg Cloxacillin L Milch

14 Hemmstoffe in der Milch wirtschaftliche Risiken Fehlprodukte oder Qualitätsminderung bei der Herstellung fermentierter Milcherzeugnisse gesundheitliche Risiken der Verbraucher Entwicklung von Allergien gegen Antiinfektiva Entwicklung von resistenten Keimen

15 Verfügbare Nachweissysteme mikrobiologische Tests Rezeptor-Schnelltests physikalisch-chemisch

16 Brillantschwarz Reduktionstest (BRT) Unspezifischer Test für alle Hemmstoffe Breites Nachweisspektrum relevanter Antibiotika Mikrobiologischer Test Dauer 2:00-2:30h

17 Wirkmechanismen: Schnelltestsysteme Immunologische Rezeptoren Enzymatische Reaktionen Dauer 6-10 min Substanz-spezifisch positive Ergebnisse nur bei einer bestimmten Arzneimittelgruppe, für die die eingesetzten Rezeptoren spezifisch binden! Qualifizierung der Substanz wird durch Rezeptor bestimmt!

18 Physikalisch-chemische Referenzmethode Flüssigchromatographie: HPLC, LC-MS/MS zeitaufwendige Probenvorbereitung hohe Messkosten

19 Fazit Verfügbare Nachweissysteme Spektrum Nachweis Kosten Dauer Mikrobiologischer Test ++ qualitativ + -- Schnelltest - qualitativ + + physikalisch-chemisch ++ qualitativ UND quantitativ

20 Lösung: BioSensor zum Nachweis von Antibiotika in Milch MCR 3

21 Detektionsprinzip indirekt kompetitiver ELISA

22 Aufbau des Antibiotika-Chips Polymer- Beschichtung

23 Produktion des Antibiotika-Chips Kontaktdrucken der Antibiotika Produktion des 3teiligen Milch-Chips Messung am MCR 3

24 Fotoaufnahme vom Antibiotika-Chip Kopplung von 14 Antibiotika je 1 Positiv- und Negativkontrolle 5 Lichtspots pro Antibiotikum Chips wiederverwendbar: ca. 100 Messzyklen pro Messkanal Chips haltbar bei 4 C im Kühlschrank Positivkontrolle Negativkontrolle Ceftiofur Nafcillin Enrofloxacin Tylosin Erythromycin A Gentamicin Neomycin B Cephapirin Penicillin G Ampicillin Cloxacillin Streptomycin SDA SMA

25 Aufbau des MCR

26 Aufnahme einer Kalibrierkurve 0 µ g/l 10 µ g/l 1000 µ g/l

27 Kalibrierkurve von Penicillin G TMP: 14 µg/l MRL: 4 µg/l WR: µg/l

28 Auswertung der Kalibrierdaten

29 Kalibrierdaten aller 14 Antibiotika Antibiotika MRL [µg/l] TMP [µg/l] Messbereich [µg/l] SMA SDA Streptomycin Cloxacillin Ampicillin Penicillin G Cephapirin Neomycin B Gentamicin Erythromycin A Tylosin Enrofloxacin Nafcillin Ceftiofur m = 150 CV = 25%

30 Realprobenmessungen beim MPR SMA SDA Streptomycin Cloxacillin Ampicillin Penicillin G Cephapirin Neomycin B Gentamicin MCR 3: 560 µg/l BRT: > 400 µg/l MRL: 4 µg/l Erythromycin A Tylosin Enrofloxacin Nafcillin Ceftiofur Negativkontrolle DNPEDA

31 Realprobenmessungen beim MPR 3% 4% seit Oktober 2008: 3594 Proben 6% 9% 2% 2% 68% 6% Kein Antibiotikum Ampicillin Cloxacillin Penicillin G-Streptomycin Penicillin G Cloxacillin-Ampicillin Penicillin G-Neomycin B Sonstige

32 Realprobenmessungen beim MPR Detektierte Antibiotika MRL [µg/l] MCR 3 [µg/l] BRT [µg/l] Ampicillin Ampicillin, Cloxacillin 4, 30 44, , 120 Cloxacillin Cephapirin Penicillin G Penicillin G, Neomycin B 4, , Penicillin G, Streptomycin 4, , , * Penicillin G, Streptomycin, Nafcillin 4, 200, 30 42, 37, , *, 120 Streptomycin * Ceftiofur * * Bestätigt mit Rezeptor-Schnelltest

33 Ergebnisvergleich mit Referenzanalytik Detektierte Antibiotika MRL [µg/l] BRT [µg/l] MCR 3 [µg/l] HPLC-MS [µg/l] Penicillin G 4 4 3,8 3,9 Penicillin G ,3 Penicillin G Penicillin G Penicillin G, Neomycin B 4, , 56 15, 30 Cloxacillin Cloxacillin Cloxacillin Cloxacillin Cloxacillin * Bestätigt durch ELISA

34 MCR 3 eine einmalige Chance! Durch schnelle QUAlifizierung und QUAntifizierung des Antibiotikums bereits in der Produktionskette entsteht ein Mehr an Sicherheit! Der MCR 3 ist geeignet weltweit zum ersten Mal die in der Praxis bestehende "diagnostische Lücke" in der Lebensmittelkette Milch zu schließen! Screening QuaQua

35 Fallbeispiele aus der Praxis Milchannahme Tankzug: Schnelltest positiv Molkereilabor: BRT-Hemmstofftest negativ Fragestellung in der Molkerei: Welcher Test zeigt das richtige Ergebnis? Welcher Test entscheidet? Was muss getan werden?

36 Fall 1 Aufgrund verschiedener Tests können Rückschlüsse auf die eingesetzten Medikamente gezogen werden: BRT: 1:4 P Betalaktam Charm-Test Betalaktam Wirkstoffgruppe bestätigt Charm-Test Streptomycin zweiter Wirkstoff bestätigt MCR 3: Penicillin G 45 µg/l und Streptomycin 195 µg/l Befragung des Milcherzeugers ergab den Einsatz von Horostrep (Wirkstoff: Penicillin G und Streptomycin)

37 Fall 2 Scheinbarer Widerspruch beim Ansatz mit Penicillinase BRT: 1:1 P Wirkstoff mit Penicillinase inaktivierbar MCR 3: Cloxacillin 41 µg/l Widerspruch: Cloxacillin ist NICHT mit Penicillinase inaktivierbar S Fazit: Es muss ein weiterer Wirkstoff enthalten sein! MCR 3: zusätzlich Ampicillin 9 µg/l Trockensteller-Kombination Ampicillin-Cloxacillin!

38 Ausgangssituation: Fall 3 unterschiedliche Ergebnisse: BRT negativ, Schnelltest positiv verschiedene Medikamente möglich: Excenel Wirkstoff Ceftiofur Cobactan Wirkstoff Cefquinom Terramycin Wirkstoff Tetrazyklin Ergebnisse MPR: BRT: negativ Schnelltest (Charm-Betalaktam/Betastar): positiv MCR 3: Spuren bei Ceftiofur/Kreuzreaktiv mit Cefquinom

39 Nachweisgrenzen: Fall 3 Ceftiofur (MRL: 100 µg/l) Cefquinom (MRL: 20 µg/l) BRT: Charm: Betastar: MCR 3: Arbeitsbereich bis 20 µg/l Nachweis über Ceftiofur

40 Schlussfolgerungen: Fall 3 laut Schnelltests: kein Tetrazyklin Betalaktam positiv kein Ceftiofur: MCR 3 nur Spuren BRT negativ/ Betastar positiv Fazit: Cefquinom µg/l

41 Fazit - Fallbeispiele BRT Schnelltest Schlussfolgerung + + Betalaktam Antibiotika - + Betalaktam Antibiotika + - anderes Antibiotika - - hemmstofffrei Fragestellung beachten verschiedene Testsysteme beachten Nachweisgrenzen beachten unterschiedliche Ergebnisse möglich!!!

42 Die Kombi macht s!!!

43 Kompetenzzentrum für Antibiotika in Milch

44 Partner MCR3 - Validierung Cluster Ernährung K. Kloth, R. Niessner, M. Seidel, Biosens. Bioelectron. 2009, 24, K. Kloth, R. Dietrich, E. Märtlbauer, R. Niessner, M. Seidel, Analyst 2009, 134, C. Baumgartner, K. Kloth, B. Kreis, DMZ 2010, 14, C. Baumgartner, K. Kloth, Milchpur 2011, 1, C. Baumgartner, molkerei-industrie 2011, 5, 4-7.