MITTEILUNGEN DES BERUFSVERBANDES DER ÄRZTE FÜR MIKROBIOLOGIE UND INFEKTIONSEPIDEMIOLOGIE E.V. 15. Jahrgang, Heft 6 Dezember

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1 DER MIKROBIOLOGE MITTEILUNGEN DES BERUFSVERBANDES DER ÄRZTE FÜR MIKROBIOLOGIE UND INFEKTIONSEPIDEMIOLOGIE E.V. 15. Jahrgang, Heft 6 Dezember Seite EDITORIAL VERANSTALTUNGSHINWEIS 15. Frühjahrstagung des Berufsverbandes der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie Donnerstag, 06. April bis Samstag, 08. April 2006, im Kongresszentrum der Ostdeutschen Sparkassenakademie, Potsdam DIAGNOSTIK Bettina Wilske und Volker Fingerle, München Lyme-Borreliose Diagnostik Wolfgang Witte und Christa Cuny, Wernigerode Neuere Methoden der Diagnostik von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus Martin Altwegg, Luzern Mikrobiologische Diagnostik von nur schwierig kultivierbaren bakteriellen Infektionserregern Das komplette Inhaltsverzeichnis finden Sie auf der nächsten Seite

2 INHALTSVERZEICHNIS EDITORIAL VERANSTALTUNGSHINWEIS 15. Frühjahrstagung des Berufsverbandes der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie Donnerstag, 06. April bis Samstag, 08. April 2006, im Kongresszentrum der Ostdeutschen Sparkassenakademie, Potsdam DIAGNOSTIK Bettina Wilske und Volker Fingerle, München Lyme-Borreliose Diagnostik Wolfgang Witte und Christa Cuny, Wernigerode Neuere Methoden der Diagnostik von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus Martin Altwegg, Luzern Mikrobiologische Diagnostik von nur schwierig kultivierbaren bakteriellen Infektionserregern BUCHBESPRECHUNGEN , 230 ÜBERSICHT Christian Tauchnitz und Werner Handrick, Leipzig Alkohol und Infektionen LESERZUSCHRIFT Rudolf Raßhofer, München zum Artikel Workshop zum MRSA-Screening am in Hannover von Herrn Dr. Axel Kola et.al., MIKROBIOLOGE, 2005; 15: AUS DER DDG DEUTSCHE DIAGNOSTIKA GRUPPE E.V. Kurzprotokoll 44. Mitgliederversammlung der Deutschen Diagnostika Gruppe e. V., , Berlin FORTBILDUNGSVERANSTALTUNGEN ZEITSCHRIFTENREFERAT Therapeutic opportunities TAGUNGSKALENDER BEZUGSQUELLEN IMPRESSUM... dritte Umschlagseite

3 EDITORIAL Liebe Kolleginnen und Kollegen, je älter man wird, desto schneller läuft die Zeit ein alter Spruch, aber leider doch wohl wahr. So bleibt mir nichts Anderes übrig als das Jahres-Abschluss-Editorial zu schreiben und Bilanz zu ziehen über Erfreuliches und weniger Erfreuliches. Lassen Sie mich mit den positiven Dingen beginnen: ganz im Vordergrund steht dabei für mich unsere sehr erfolgreiche Frühjahrstagung in Banz, die gezeigt hat, wie groß das Interesse und die Notwendigkeit für eine breit angelegte Fortbildung ist. Dies spiegelt sich auch wieder in Fortbildungen, die von den Landesgruppen veranstaltet wurden. Hervorheben möchte ich dabei die brandenburgische Herbsttagung, die von Herrn Berthold mit einem ausgezeichneten Programm organisiert wurde. In ähnlicher Weise der Fortbildung verpflichtet, übersteigt unsere Zeitschrift Der Mikrobiologe mit einem sehr breiten und qualitativ hochstehenden Themenspektrum bei weitem das Niveau eines reinen Mitteilungsblattes. Herrn Spencker sind wir ob seiner Leistung uneingeschränkt zu Dank verpflichtet: ohne seine treibende Kraft und ständigem Nachbohren bei potentiellen Autoren wäre die Qualität der Zeitschrift sicherlich nicht so hoch. Zu den eher erfreulichen Dingen möchte ich persönlich auch meine Einladung zur Jahrestagung des Berufsverbandes Deutscher Laborärzte zählen, auch wenn ich bei den Kollegen durch einen eher provokanten Vortrag zu Qualitätsaspekten der mikrobiologischen Diagnostik in der Laboratoriumsmedizin manch heftige Reaktion hervorgerufen habe. Nichts desto trotz war ich mir mit dem Vorsitzenden des BDL, Herrn Kollegen Bobrowski, einig, dass die Interessen unserer beiden Berufsverbände mehr Gemeinsamkeiten als grundsätzliche Gegensätze aufweisen und damit eine engere Kooperation angestrebt werden sollte. Um die Diskussionen weiterzuführen, habe ich Herrn Bobrowski auch als Referenten zur nächsten Frühjahrstagung eingeladen: angesichts der Entwicklungen in Bezug auf Abrechnung Stichwort: GOÄ- bzw. EBM-Reform müssen wir unbedingt eine gemeinsame Linie finden und dürfen uns nicht auseinanderdividieren lassen. Gleiches gilt für das Problem der zunehmenden auch mikrobiologischen Untersuchungen bei niedergelassenen Ärzten (Nicht-Mikrobiologen/Labormediziner). Wenig erfreulich hat sich Situation für die Mikrobiologen für den Erwerb der Zusatzbezeichnung Infektiologie entwickelt. Mit einer einzigen Ausnahme und hier handelte es sich um ein Versehen wurden alle Anträge zur Zulassung für das Prüfungsgespräch von allen in Frage kommenden Landesärztekammern unter Bezug auf die Regelung in der WBO der Bundesärztekammer abgelehnt. Wenn auch in Bayern die Regelung der BÄK nicht wortwörtlich übernommen wurde, so erfolgte die Ablehnung der Bewerber aus dem Bereich der Mikrobiologie mit der Begründung der fehlenden klinischen Tätigkeit. In einer Reihen von Gesprächen mit den Präsidenten bzw. Vorsitzenden der DGI, PEG oder auch der Arbeitsgemeinschaft Infektiologie im Bund Deutscher Internisten habe ich versucht, Unterstützung für unser Anliegen zu gewinnen. Von allen Gesprächspartnern wurde signalisiert, dass diese Zusatzbezeichnung für klinische Mikrobiologen selbstverständlich erwerbbar sein sollte. Ich fürchte aber trotzdem, dass uns sehr wahrscheinlich nur der (lange) Weg über eine Änderung der Musterwei- MIKROBIOLOGE 15.Jg

4 terbildungsordnung durch die BÄK bleiben wird. Umso wichtiger wird es aber sein, dass die an der Infektiologie interessierten Mikrobiologen durch permanente klinische Tätigkeit am Krankenbett unseren Anspruch auf diese Zusatzbezeichnung belegen. Ein weiteres Projekt, das von Seiten des Berufsverbandes angegangen werden soll, ist die Etablierung einer Arbeitsgruppe Hochschulmedizin. Der Kahlschlag innerhalb der Medizin macht mittlerweile auch vor den Universitätskliniken nicht Halt, und es ist nicht schwer vorherzusagen, wann im Rahmen des Spardiktates an den ersten Unikliniken in ähnlicher Weise wie Küche, Wäscherei oder Reinigungsdienst die Labormedizin und die Mikrobiologie fremd vergeben werden und rudimentäre Reste mikrobiologischer Institute verbleiben, deren Aufgabe sich auf Forschung und Lehre beschränkt. Mag dies in manchen Ohren zunächst gar nicht so übel klingen, ergibt sich dennoch sehr schnell die Frage, wo die klinisch orientierte mikrobiologische Forschung dann stattfinden soll. Nur noch Grundlagenforschung kann nicht der richtige Weg sein, zumal die Drittmittel für Industrie-gesponsorte klinischmikrobiologische Studien mittlerweile ebenfalls zu einem dünnen Rinnsal werden. Deshalb ist es allerhöchste Zeit, dass die universitären mikrobiologischen Einrichtungen endlich auch berufspolitisch die Besonderheiten und die Stellung unseres Fachgebietes innerhalb der Hochschulmedizin herausstreichen und zukunftweisend agieren. Wie Sie sehen, stehen für den Berufsverband einige wichtige Aufgaben ins Haus, wobei ich Ihnen versichern darf, dass der gesamte Vorstand zusammen mit dem Beirat sich sehr intensiv mit all diesen Fragen auseinandersetzen wird und hoffentlich Einiges in Ihrer bzw. unserer allem Sinn erreichen wird. Auch im Namen aller Vorstandskollegen möchte ich Ihnen und Ihren Familien eine ruhige und beschauliche Weihnachtszeit und eine friedlichen Jahreswechsel wünschen. Mit besten Wünschen, Ihr H. K. Geiss 206 MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

5 15. Frühjahrstagung des Berufsverbandes der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie Donnerstag, 06. April bis Samstag, 08. April 2006 Kongresszentrum der Ostdeutschen Sparkassenakademie, Potsdam Programm Donnerstag, 06. April 2006 Vorsitz: Prof. Dr. H. K. Geiss 19:00 19:30 Dr. A. Bobrowski, Lübeck Laboratoriumsmedizin und Mikrobiologie: Gibt es eine gemeinsame Zukunft? 19:45 20:30 Prof. Dr. H. Hahn, Berlin Die Geschichte der Berliner Mikrobiologischen Gesellschaft Freitag, 7 April 2006 Vorsitz: Prof. Dr. G. Mauff Prof. Dr. U. Gross, Göttingen Mikrosporidien Prof. Dr. J. Heesemann, München Anaerobe P.aeruginosa Prof. Dr. W. Solbach, Lübeck Granulozyten als Regulatoren der angeborenen Immunantwort P A U S E Vorsitz: Prof. Dr. D. Neumann-Haefelin Fr. Dr. B. Schweiger, Berlin Influenza State of the Art Fr. Prof. S. Modrow, Regensburg Parvovirus B19 kleiner Erreger, vielfältige Erkrankungen M I T T A G S P A U S E Vorsitz: Fr. Dr. W. Römmler Dr. K. Oberdorfer, Heidelberg MRSA rationale und rationelle Diagnostik Dr. G. Werner, Wernigerode VRE diagnostische Verfahren Dr. M. Frey, Heidelberg Pyrosequencing: Schnelle Differenzierung und Resistenztestung M I T G L I E D E R V E R S A M M L U N G Samstag, 08. April 2006 Vorsitz: Dr. A. Hartinger Dr. B. Kunz, Erlangen Infektionsrisiken und Hygiene bei Piercing und Tätowieren Fr. PD Dr. C. Wendt, Heidelberg Trinkbrunnen im Krankenhaus P A U S E Vorsitz: Prof. H. K. Geiss Prof. Dr. L. Zöller, Koblenz Mikrobiologische Versorgung der Bundeswehr in Afghanistan und Kosovo Prof. Dr. S. Suerbaum, Hannover Ringversuche, Bakteriologie Prof. Dr. H. K. Geiss, Heidelberg Schriftliche Evaluation MIKROBIOLOGE 15.Jg

6 A N M E L D E B O G E N: Büro-, Verlags- und Tagungsservice Dagmar Strebel Belfortstraße Karlsruhe Fax: T A G U N G S G E B Ü H R E N: Bei Anmeldung bis 01. März ab dem 01. März 2006 Für einen Tag, inkl. einem Mittag- und einem Abendessen EUR 140,00 EUR 160,00 Für zwei Tage, inkl. zwei Mittag- und zwei Abendessen EUR 170,00 EUR 190,00 Begleitpersonen, die nicht selbst an der Tagung teilnehmen, können auf eigene Kosten an den gemeinsamen Mahlzeiten teilnehmen. Dies ist vor Ort buchbar. Hiermit melde ich mich verbindlich für die 15. Frühjahrstagung des Berufsverbandes der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie im Kongresszentrum der Ostdeutschen Sparkassenakademie, Potsdam, vom April 2006 an. ZIMMERRESERVIERUNG: Hiermit buche(n) ich/wir im Kongresszentrum der Ostdeutschen Sparkassenakademie, Potsdam: Einzelzimmer, Dusche/WC: EUR 54,00 pro Nacht Übernachtung für eine Person im Einzelzimmer, inkl. reichhaltigem Frühstücksbüfett Doppelzimmer/Appartement, Dusche/WC EUR 75,00 pro Nacht Übernachtung für zwei Personen im Doppelzimmer, inkl. reichhaltigem Frühstücksbüfett (2 Personen) 06. / 07. April / 08. April 2006 Ich/Wir sind an der Teilnahme am Kulturprogramm in Potsdam und in Sanssouci interessiert (noch in der Planung für Samstag im Anschluss an das Mittagessen) Ich/Wir sind an einer anschließenden zusätzlichen Übernachtung interessiert. Herr Frau Prof. PD Dr..... Name Vorname... Adresse/ Institut Straße, Nr.... PLZ Ort... Tel.: Fax:......!! Bitte geben Sie uns für weitere schnelle Informationen Ihre -Adresse an:!!... Sie bekommen bis spätestens drei Wochen nach Anmeldung eine Anmeldebestätigung zugeschickt. Sollten Sie keine Anmeldebestätigung erhalten, so melden Sie sich bitte bei Frau Strebel per Fax: oder bvt-dagmar-strebel@t-online.de Bitte überweisen Sie die Tagungsgebühr und auf das Konto-Nr bei der Deutschen Apotheker- und Ärztebank München (BLZ ). Ihre Logiskosten bezahlen Sie bitte bei der Abreise im Hotel. 208 MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

7 DIAGNOSTIK Lyme-Borreliose Diagnostik Vortrag auf der 13. Frühjahrstagung der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie (Potsdam 2004) Vortrag auf der 14. Frühjahrstagung der Ärzte für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie (Kloster Banz 2005) Bettina Wilske und Volker Fingerle Max von Pettenkofer-Institut, LMU München, Nationales Referenzzentrum für Borrelien, München Zusammenfassung In Europa wird die Lyme-Borreliose durch mindestens die drei verschiedenen Spezies B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii und B. garinii verursacht. Daher muss bei der Diagnostik der Lyme-Borreliose in Europa die Heterogenität des Erregers bei der Entwicklung diagnostischer Methoden wie PCR und Serologie berücksichtigt werden. Nach Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie (MiQ12 Lyme-Borreliose) soll die Serodiagnostik dem Prinzip der Stufendiagnostik folgen. Als Suchtest wird ein sensitiver ELISA, der IgG - und IgM - Antikörper differenziert, empfohlen. Bei reaktivem ELISA soll als 2. Stufe der Immunoblot folgen. Reaktive diagnostische Blot-Banden müssen eindeutig identifiziert werden können. Dies gelingt am besten, wenn rekombinante Antigene für den Immunoblot verwendet werden. Sensitivität und Standardisierung konnten durch die Verwendung rekombinanter Antigene erheblich verbessert werden. Insbesondere der Einsatz rekombinanter Proteine, die von den Borrelien primär in vivo aber nicht in Kultur exprimiert werden (z.b. VlsE) und die Kombination homologer Proteine von verschiedenen Borrelien- Stämmen. (z.b. DbpA) konnten die Sensitivität des Immunoblot entscheidend verbessern. Auch für den ELISA erscheint es vielversprechend, rekombinante Proteine (DbpA, VlsE, andere) oder hier auch synthetische Peptide (z.b. das von VlsE hergeleitete C6 Peptid) als Antigene einzusetzen. Derzeit liegen die Detektionsraten für Antikörper bei 20-50% im Stadium I, 70-90% im Stadium II und nahe 100% im Stadium III. Das Hauptziel für die Zukunft ist die Spezifität im allgemeinen und die Sensitivität bei den Frühmanifestationen (Stadium I und II) zu erhöhen. Der Erregernachweis soll auf spezielle Indikationen beschränkt werden und nur in Speziallaboratorien durchgeführt werden. Geeignete Proben sind Hautbiopsien, Liquor und Gelenkpunktate oder -biopsien. Die besten Ergebnisse werden mit Hautbiopsien (50-70% mit Kultur oder PCR) und Gelenkpunktaten oder -biopsien (50-70% mit PCR) erzielt. Liquorproben sind nur bei 10-30% der Patienten positiv. Nicht empfohlen werden folgende Methoden für die Diagnostik: Antigenteste in Körperflüssigkeiten, PCR aus Urin und Blut/Serum sowie der Lymphozytentransformationstest. Es wird auch abgeraten, vom Menschen entfernte Zecken auf Borrelien zu untersuchen, um daraus Indikationen zur Antibiotika-Prophylaxe herzuleiten. Einleitung Die Lyme-Borreliose ist die häufigste zeckenübertragene Erkrankung in der nördlichen Hemisphäre, sie kommt auf der südlichen Halbkugel nicht vor. Sie ist eine Multisystemerkrankung, die zahlreiche Organe betreffen kann, z.b. die Haut, das Nervensystem, die Gelenke und das Herz (Steere et al. 1989, Pfister et al. 1994). Wegen der Vielzahl der Symptome gehört der Antikörpernachweis gegen Borrelien zu den am häufigsten angeforderten serologischen Testen im mikrobiologischen Labor. Bei der mikrobiologischen Diagnostik der Lyme-Borreliose in Europa muss die Heterogenität der europäischen Stämme berücksichtigt werden. Heterogenität des Erregers der Lyme-Borreliose und die Bedeutung für die Diagnostik In Europa wird die Lyme-Borreliose durch mindestens die drei verschiedenen Spezies Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. afzelii und B. garinii verursacht. Dagegen ist B. burgdorferi sensu stricto die einzige humanpathogene Spezies in den USA (Wang et al. al 1999b). Die drei humanpathogenen Spezies umfassen mindestens 7 OspA- Serotypen in Europa (Abb. 1) (Wilske et al. 1993c). Hautisolate gehören ganz vorwiegend der Spezies B. afzelii (OspA-Typ 2) an, speziell solche von Patienten mit Acrodermatitis chronica atrophicans, die im Übrigen nicht in den USA vorkommt (Canica et al. 1993, Ohlenbusch et al. 1996, Wilske et al. 1993c) (s. auch Legende von Abb. 1). Isolate von Liquor und Zecken sind heterogen mit Dominanz von B. garinii (Eiffert et al. 1995, van Dam et al. 1993, Wilske et al. 1996, Wilske et al. 1993c). Sequenzanalysen von polymerase chain reaction (PCR) ospa Amplicons von Gelenkpunktaten von Patienten mit Lyme- Arthritis zeigten eine deutliche Heterogenität (Eiffert et al. 1998, Vasiliu et al. 1998), in anderen PCR-Studien fand sich überwiegend B. burgdorferi s.s. (5S/23S rrna intergenic spacer PCR, Lünemann et al oder Flagellin- PCR, Jaulhac et al und 2000). In Europa sind B. afzelii und B. garinii am häufigsten; dabei ist die dritthäufigste Spezies B. burgdorferi s.s. in Osteuropa besonders selten (s. Übersicht von Hubalek et al. 1997). Selbst in eng begrenzten Gebieten können die Borrelienstämme sehr heterogen sein (Eiffert et al. 1995, Gern et al. 1999, Michel et al. 2004, Rauter et al. 2002, Rijpkema et al. 1996), auf der anderen Seite hat man ausgesprochene regionale Häufungen bestimmter Spezies MIKROBIOLOGE 15.Jg

8 Liquor (n=43) Zecken (n=90) Haut (n=68) Typ 6 23% Typ 7 5% Typ 1 19% Typ 7 3% Typ 1 20% Typ 5 1% Typ 4 3% Typ 6 6% Typ 1 6% 1 Typ 2 12% Typ 2 9% Typ 5 7% Typ 4 28% Typ 3 7% Typ 6 53% Typ 5 3% Typ 3 12% Typ 2 84% Synovialflüssigkeit (n=32) Typ 5 n=4 (19%) Typ 6 n=3 (14%) Typ 1 n=7 (33%) Liquor Zecken Haut B. burgdorferi s.s. 19% 20% 6% B. afzelii 12% 9% 84% B. garinii 69% 71% 10% Syn.Fl. 33% 29% 38% Typ 4 n=1 (5%) Typ 2 n=6 (29%) Abb. 1. Heterogenität von Borrelia Spezies und OspA-Serotypen in Europa. Die Daten für Haut, Liquor cerebrospinalis und Zecken basieren auf Kulturisolaten, die Daten für die Gelenkflüssigkeit auf der Analyse von ospa PCR-Amplikons; bei 46 der Patienten mit Hautproben ist die Diagnose bekannt (30 Fälle mit Erythema migrans, davon waren 1, 26, 1 und 2 Fälle mit jeweils den OspA-Typen 1, 2, 4 und 6 infiziert; sowie 16 Fälle mit ACA, davon waren 1 und 15 Fälle mit jeweils den OspA- Typen 1 und 2 infiziert) (nach Abb. 5. und 6, Referenz Wilske et al., 2002, mit Erlaubnis des Verlags). oder Subspezies beobachtet (Michel et al. 2002, Peter et al. 1995). Auch über Mehrfachinfektionen von Zecken (s. Übersicht von Hubalek et al. 1997) und seltener auch in Patientenproben (Demaerschalck et al. 1995, Vasiliu et al. 1998, Wilske et al. 1996b) wurde berichtet. Die Heterogenität des Erregers (Abb. 1) macht die Diagnostik der Lyme-Borreliose in Europa deutlich schwieriger als in den USA und muss für die Entwicklung diagnostischer Reagenzien wie z.b. PCR-Primer und Antigene unbedingt berücksichtigt werden. So ist es bei der häufig durchgeführten OspA-PCR wichtig, dass nicht nur Repräsentanten der drei Spezies sondern auch die verschiedenen OspA- Typen der heterogenen B. garinii - Gruppe erkannt werden (Eiffert et al. 1995). Des weiteren soll die PCR B. valaisiana und die vor kurzem entdeckte Genospezies A14S erfassen, da beide möglicherweise humanpathogen sind, wie einige wenige PCR- und Kulturergebnisse nahe legen (Rijpkema et al. 1997, Wang et al. 1999a, Wilske et al. 2002). Mittlerweile haben wir Genospezies A14S viermal (alle von Patienten mit Erythema migrans) nach Analyse von 242 europäischen Patienten-Isolaten gefunden (Fingerle und Wilske, unveröffentlicht). Wir haben vor kurzem eine leistungsfähige OspA-PCR zum Nachweis und zur Differenzierung der verschiedenen europäischen Spezies und OspA-Subtypen entwickelt (Michel et al. 2004). Die Heterogenität der Stämme hat auch eine große Bedeutung für die Serodiagnostik, da einige wichtige diagnostische Proteine ausgesprochen heterogen sind. Aminosäure-Sequenzidentitäten sind z.b. nur 40-44% für DbpA (Osp17) und 54-68% für OspC zwischen repräsentativen Stämmen von B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii und B. garinii (B31, PKo und PBi) (Tabelle 1). Beson- Tablelle 1: Sequenz Identitäten für DNA- und Aminosäuresequenzen bei immundominanten Proteinen der drei humanpathogenen Spezies von B. burgdorferi sensu lato (Vergleich der Stämme B31, PKo und PBi) Protein DNA-Sequenzen Bereich (in %) Aminosäure-Sequenzen Bereich (in %) DbpA OspC OspA BmpA (p39) p flagellin p83/ MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

9 ders DbpA hat eine sehr viel höhere Aminosäuresequenz- Heterogenität im Vergleich zur DNA-Heterogenität, was auf Immunselektion hinweist. Interessanterweise können aber sehr heterogene Proteine auch hochkonservierte immunogene Epitope aufweisen (z.b. das C6 Peptid von VlsE) (Liang et al.1999, Liang et al. 2000). Richtlinien für die mikrobiologische Diagnose der Lyme-Borreliose Die Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) hat Richtlinien für Diagnose der Lyme- Borreliose publiziert, die von einem Expertenkomitee verfasst wurden (MiQ 12 Lyme-Borreliose) (Wilske et al. 2000). Die englische Version ist über Internet kostenlos zugänglich ( Außer im Falle der pathognomonischen klinischen Manifestation des Erythema migrans erfordert die Diagnose der Lyme-Borreliose in der Regel die Bestätigung durch mikrobiologische Teste. Zu diesem Zweck wird vor allem der Antikörpernachweis verwendet, während der Erregernachweis (mittels Kultur oder PCR) auf spezielle Fälle beschränkt ist, z.b. bei unklaren serologischen Testergebnissen oder schwierigen klinischen Fällen. Dabei soll der Erregernachweis nur in dafür spezialisierten Laboratorien durchgeführt werden. Proben für die mikrobiologische Diagnose Am besten ist B. burgdorferi aus Hautbiopsien sowohl mittels Kultur als auch PCR nachweisbar. Generell ist dagegen der Erreger in Körperflüssigkeiten schlecht nachweisbar mit Ausnahme des Nachweises mittels PCR aus Gelenkflüssigkeit. Der Nachweis aus Urin (PCR, Antigennachweis) wird nicht empfohlen, ebenso nicht der Borrelien-Nachweis (PCR oder IFA) in Zecken, die von Patienten entfernt wurden, um eine Indikation zur Antibiotika-Prophylaxe zu stellen (Brettschneider et al. 1998, Kaiser et al. 1998, Klempner et al. 2001, Wilske et al. 2000, Wilske und Schriefer 2003, Wilske 2003). Zeckenuntersuchungen sollten nur für epidemiologische oder andere wissenschaftliche Untersuchungen durchgeführt werden. Zum Antikörpernachweis kann Serum oder Liquor untersucht werden. Die Liquoruntersuchung muss immer gleichzeitig mit einer Serumuntersuchung erfolgen (Bestimmung des Liquor/Serum-Index). Erregernachweis Kultur. B. burgdorferi kann in modifiziertem Kelly Medium (Preac-Mursic et al. 1991, Wilske and Schriefer 2003) angezüchtet werden. Diese Methode ist allerdings sehr zeitaufwendig (Generationszeit von B. burgdorferi 7 20 h) und ist charakterisiert durch geringe Sensitivität, insbesondere in Körperflüssigkeiten (Arnez et al. 2001, Åsbrink et al. 1985, Karlsson et al. 1990, Strle et al. 1999, Zore et al. 2002) (Tabelle 2). Die Kultur kann in speziellen Fällen hilfreich sein, in denen der klinische Befund trotz negativer Serologie eine Lyme-Borreliose nahe legt (seronegative Lyme-Borreliose), z.b. bei atypischem E- rythema migrans, V. a. akute Neuroborreliose ohne Nachweis intrathekaler Antikörper insbesondere bei kurzer Krankheitsdauer oder bei Patienten mit Immundefizienz. Tabelle 2: Sensitivität von Kultur und PCR für den Erregernachweis Probe Haut (Erythema migrans, Acrodermatitis) Liquor (Akute Neuroborreliose) Gelenkflüssigkeit * (Lyme-Arthritis) Sensitivität 50-70% mit Kultur oder PCR 10-30% mit Kultur oder PCR 50-70% mit PCR (Kultur ist extrem selten positiv) * höhere Sensitivität mit Synovialbiopsie im Vergleich zu Gelenkflüssigkeit PCR. Bisher stehen keine standardisierten Verfahren für die Probenvorbereitung sowie die PCR selbst zur Verfügung. In spezialisierten Laboratorien wurden verschiedene Target-Sequenzen für die DNA-Amplifikation unter experimentellen Bedingungen verwendet, z.b. Plasmidassoziierte Gene wie ospa und ospb, oder chromosomale Gene wie das Gen des Flagellins oder des Proteins p66 (clone 2H1), oder Gen-Segmente der 16S rrna oder der 5S/23S rrna intergenischen Spacer-Region (Übersicht bei Schmidt et al. 1997). Die Borrelien-PCR soll die Diagnose der Borrelia-Spezies ermöglichen, d.h. der Untersuchungsbericht soll die Information, welche humanpathogene Spezies gefunden wurde, enthalten. Die diagnostische Sensitivität der PCR entspricht in etwa derjenigen der Kultur, wobei Borrelien deutlich besser im Gewebe als in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden können (Arnez et al. 2001, Jaulhac et al. 1996, Karlsson et al. 1990). Nur die PCR aus Gelenkflüssigkeit ist der Kultur deutlich überlegen (Nocton et al. 1994). Sensitivität von Kultur und PCR. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Sensitivität des Erregernachweises in klinischen Proben. Kultur und PCR haben die höchsten Detektionsraten (50-70%) aus Hautbiopsien von Patienten mit Erythema migrans oder Acrodermatitis chronica atrophicans (Åsbrink et al. 1985a, van Dam et al. 1993, von Stedingk et al. 1995, Weber et al. 1990, Zore et al. 2002). Im Gegensatz dazu sind Borrelien mittels PCR oder Kultur im Liquor nur bei 10-30% der Patienten mit Neuroborreliose nachweisbar (Eiffert et al. 1995, Karlsson et al. 1990, Wilske and Preac-Mursic 1993b). Borrelien wurden am häufigsten von Patienten mit kurzer Krankheitsdauer isoliert (Karlsson et al. 1990). Entsprechend war auch in einer weiteren Studie die PCR aus Liquor in etwa 50% der Patienten mit einer Krankheitsdauer unter 2 Wochen positiv gegenüber nur 13% bei Patienten mit einer längeren Krankheitsdauer (Lebech et al. 2000). Überraschenderweise konnten Borrelien mit der PCR in 50-70% der Gelenkflüssigkeiten von Patienten mit Lyme- Arthritis nachgewiesen werden, während der kulturelle Nachweis hier extrem selten gelingt (Eiffert et al. 1998, Vassiliu et al. 1998). Noch bessere PCR-Ergebnisse werden aus Synovial-Gewebe erzielt (Jaulhac et al. 1996). MIKROBIOLOGE 15.Jg

10 Antikörpernachweis Es ist generell akzeptiert, dass die serologische Untersuchung dem Prinzip der Stufendiagnostik folgt (Centers for Disease Control and Prevention 1995, Johnson et al. 1996, Wilske et al. 2000, Wilske und Schriefer 2002): 1. Ein serologischer Suchtest und im Falle eines reaktiven Suchtestes 2. ein Bestätigungstest. Dafür wird ein sensitiver ELISA empfohlen, der im Falle der Reaktivität durch einen Immunoblot bestätigt werden soll. ELISA. Als ELISA soll mindestens ein Zweitgenerationstest verwendet werden (Wilske et al. 2000), der im Hinblick auf mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien verbessert wurde (z.b. Extrakt-Antigen mit Reitertreponemen.-Absorption) (Wilske et al. 1993a) oder gereinigte Flagellen als Antigen (Hansen et al. 1988)). Die als Antigenquelle verwendeten Stämme sollten OspC, das immundominante Antigen der IgM-Antwort, und DbpA, das immundominante Antigen der IgG-Antwort, exprimieren. (Wilske et al. 2000). Vor kurzem wurden spezifische rekombinante Antigene (z.b. VlsE) oder synthetische Peptide (z.b. das von VlsE abgeleitete C6 Peptid) mit Erfolg bei amerikanischen Patienten (Bacon et al. 2003, Lawrenz et al. 1999, Liang et al. 1999) und europäischen Patienten verwendet (Liang et al. 2000, Fingerle et al. 2002, Panelius 2003). Weiterhin erwies sich auch DbpA, das in Kultur von Borrelien oft schlecht exprimiert wird, als sensitives ELISA-Antigen (Panelius 2003). Immunoblot. Als Bestätigungstest muss der Immunoblot eine hohe Spezifität haben (mindestens 95%). Wenn ein Ganzzell-Lysat als Antigen verwendet wird, müssen die diagnostischen Banden mittels monoklonaler Antikörper identifiziert werden (Abb. 2). Bei Verwendung rekombinanter Antigene ist die Identifikation diagnostischer Banden viel einfacher. Für den Ganzzell-Lysat Blot müssen Borrelienstämme verwendet werden, die wichtige in Kultur variable Antigene exprimieren (z.b. Stamm PKo, der OspC und DbpA in Kultur exprimiert) (Wilske et al. 2000). Diagnostische Banden für IgG p100 p58 p43 p39 p30 OspC MAK gegen p100 p75 p60 p58 p41 p39 p35 OspA p30 OspC p21 p19 Osp17 = DbpA Osp17 = DbpA p14 G M kreuzreaktiv spezifisch kreuzreaktiv spezifisch Abb. 2. Standardisierung des Ganzzell-Lysat-Immunoblots mit monoklonalen Antikörpern (Antigen, B. afzelii Stamm PKo; Konrollseren, G=IgG, M=IgM; monoklonale Antikörper (1-11). Eng benachbarte Proteine, die schwer zu differenzieren sind, sind eingerahmt. (modifiziert nach Abb. 3 in Referenz Wilske et al mit Erlaubnis des Verlags). PKa2 PKo PBi PKa2 PKo PBi PKa2 PKo PBi PKa2 PKo PBi MW p100/83 p p p30 p Osp17 p14 Chronische Neuroborreliose Arthritis Frühe Neuroborreliose Arthritis Abb. 3. Heterogene IgG-Reaktivität von Seren von Lyme-Borreliose-Patienten mit verschiedenen Stämmen von B. burgdorferi s.l als Antigen. Stamm PKa2 ist B. burgdorferi s.s., Stamm PKo ist B. afzelii und Stamm PBi ist B. garinii (modifiziert nach Abb. 2 in Referenz Hauser et al mit Erlaubnis des Verlags) 212 MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

11 Die Immunoblot-Kriterien, die vom Center of Disease Control (CDC) für die USA empfohlen werden, können nicht in Europa verwendet werden (Hauser et al. 1997, Hauser et al. 1998, Robertson et al. 2000). Dressler et al. (1994) haben gezeigt, dass die Immunantwort bei europäischen Patienten auf ein deutlich engeres Spektrum von Borrelien-Proteinen beschränkt ist als bei amerikanischen Patienten. In einer Studie mit Seren aus Deutschland und einer weiteren Studie mit Seren aus verschiedenen europäischen Ländern haben Hauser et al. gezeigt, dass Stammspezifische Interpretationskriterien definiert werden müssen (Hauser et al. 1997, Hauser et al. 1998) (s. auch Abb. 3 in der gezeigt wird, dass die Reaktivitätsmuster mit Stammunterschieden erheblich variieren). Es müssen also unterschiedliche Interpretationsregeln etabliert werden, um gleiche Sensitivität und Spezifität bei Verwendung unterschiedlicher Borrelien-Stämme für Immunoblot- Antigene zu erzielen. Interpretationskriterien für den Immunoblot, die von der DGHM empfohlen werden, sind in der MiQ 12 Lyme- Borreliose (Wilske et al. 2000) publiziert. Diese sind, wenn B. afzelii Stamm PKo als Antigen verwendet wird, die folgenden: Der IgG-Blot ist positiv, wenn 2 Banden der folgenden vorhanden sind: p83/100, p58, p43, p39, p30, OspC, p21, Osp17, p14; der IgM-Blot ist positiv, wenn 1 Banden der folgenden vorhanden sind: p41 (stark), p39, OspC, DbpA (Osp17) (weitere Interpretationskriterien, z.b. andere Stämme s. Internet cname=miq). Ein fraglicher Befund wird mitgeteilt, wenn diagnostische Banden sichtbar sind, aber die Kriterien für einen positiven Befund nicht erfüllt sind. Beispiele für IgM- und IgG Immunoblots sind in Abb. 4 dargestellt. Patienten mit Frühmanifestationen haben eine nur auf wenige Proteine beschränkte Immunantwort, Patienten mit Spätmanifestationen (Acrodermatitis oder Arthritis) haben IgG-Antikörper gegen ein breites Spektrum von Antigenen. Frühe Neuroborreliose Acrodermatitis IgM IgG IgG Diagnostische Banden Diagnostische Banden p83/100 p83/100 Diagnostische Banden p41 p39 p58 p43 p39 p58 p43 p39 p30 p30 OspC Osp17 OspC p21 Osp17 OspC p21 Osp17 p14 p Seren: +, Referenzserum (IgG); 1-7, Seren von Patienten Antigen: B. afzelii (Stamm PKo) Abb. 4. Ganzzell-Lysat-Immunoblot: IgM- und IgG-Immunantwort bei Patienten mit Neuroborreliose (Streifen 1-7), IgG-Immunantwort bei Patienten mit Acrodermatitis. (Streifen 1-7) Streifen mit + sind IgG-Blots mit einem breiten Panel von diagnostischen Banden (modifiziert nach Abb. 4 in Referenz Wilske et al mit Erlaubnis des Verlags). MIKROBIOLOGE 15.Jg

12 Die Verwendung rekombinanter Antigene hat einige Vorteile gegenüber der Verwendung von Ganzzell-Lysat- Antigenen.: (a) spezifische Antigene können selektioniert werden (z.b. p83/100, BmpA), (b) homologe Antigene verschiedener Stämme können kombiniert werden (z.b. DbpA (Osp17), OspC, BmpA), (c) trunkierte Antigene mit höherer Spezifität können hergestellt werden (internes Flagellin-Fragment) und (d) Antigene, die primär in vivo exprimiert werden aber nicht in Kultur, stehen zur Verfügung (z.b. DbpA und vor allem VlsE) (Heikkilä et al. 2002, Schulte-Spechtel et al. 2002, Wilske et al. 1999). Kommerzielle rekombinante Blots können besser standardisiert werden als Ganzzell-Lysat Blots. Wenn ein breites Panel rekombinanter Antigene (einschließlich des vor kurzem beschriebenen VlsE) verwendet wird, ist der rekombinante Western Blot mindestens so sensitiv wie der Sonikat-Western Blot. Ein rekombinanter in house IgG-Immunoblot (Wilske et al. 1999) konnte durch Zugabe von VlsE und einem weiteren DbpA- Homolog signifikant verbessert werden (Schulte-Spechtel et al.2003). Durch Zugabe von VlsE und des DbpA Homologs nahm die Sensitivität von 52.7% auf 86.1% bei 36 Fällen von Neuroborreliose Stadium II zu, während die Spezifität unverändert blieb. Die Sensitivität war auch höher (allerdings nicht signifikant) im Vergleich zum Ganzzell-Lysat Blot (86.1% versus 63.8%) (Tabelle 4). Die Sensitivität des Immunoblot konnte noch weiter durch Etablierung des Line-Immunoblots verbessert werden (Tabelle 5, Abb. 5 und 6). Es konnte nun erstmals eine signifikant höhere Sensitivität eines rekombinanten Immunoblots im Vergleich zum Ganzzell-Lysat-Blot gezeigt werden (Tabelle 5). Die Sensitivitätssteigerung beim Line- Blot gegenüber dem vorherigen rekombinanten Western Blot lag zum einen an der Testung zusätzlicher Antigene zum andern an der Line-Blot-Technologie, die erlaubt, Immunreaktivitäten gegen Proteine mit gleichem Molekulargewicht separat zu erfassen (Tabelle 5 und 6). Für die IgM-Diagnostik erwies sich neben dem Hauptantigen OspC insbesondere VlsE des Stammes PBi als gut reaktiv (Abb. 6). Tabelle 3: Sensitivität des Antikörpernachweises bei Lyme- Borreliose Stadium Sensitivität Antikörperklasse I 20-50% Prädominanz von IgM II 70-90% Bei kurzer Krankheitsdauer Prädominanz von IgM, bei langer Krankheitsdauer Prädominanz von IgG III nahezu 100% In der Regel nur IgG* * Die Präsenz von IgM Antikörpern ohne IgG Antikörper ist nicht diagnostisch für Spätmanifestationen Tabelle 4: Vergleich des neuen rekombinanten IgG-Lineblot mit dem früheren rekombinanten IgG-Westernblot und dem IgG-Ganzzell-Lysat-Blot (Göttner et al. 2005) Anzahl der Seren Ganzzell-Lysat-Blot Anzahl (%) positiver Seren rekombinanter Westernblot rekombinanter Lineblot akute Neuroborreliose (63.8) 31 (86.1) 33 (91.7) Kontrollen* 67 2 (3.0) 0 (0.0) 0 (0.0) * Gesunde Kontrollpersonen (n = 49), Patienten mit Syphilis (n = 8), Patienten mit positivem Rheumafaktor (n = 10) Tabelle 5: Gruppe Vergleich des neuen rekombinanten IgG-Lineblot (Göttner et al. 2005) mit dem früheren rekombinanten IgG-Westernblot (Schulte-Spechtel et al. 2003) Anzahl der Seren rekombinanter- Westernblot Anzahl (%) positiver Seren rekombinanter Lineblot * Lineblot mit zusätzlichen Antigenen EM a 15 5 (33.3) 7 (46.7) 8 (53.3) NB b (72.0) 43 (86.0) 44 (88.0) ACA c 10 9 (90.0) 10 (100.0) 10 (100.0) AT d (100.0) 9 (90.0) 10 (100.0) alle LB e Fälle (70.6) 69 (81.2) 72 (84.7) Kontrollen f (0.9) 0 (0.0) 1 (0.9) a Erythema migrans; b Neuroborreliosis (Stadium II); c Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III); d Lyme-Arthritis (Stadium III); e Lyme-Borreliose; f gesunde Kontrollen (n = 60), Patienten mit Syphilis (n = 10), Patienten mit positivem Rheumafaktor (n = 10), Patienten mit Fieber unklarer Ursache (n = 30); *nur Antigene aus dem früheren rekombinanten IgG-Westernblot ausgewertet 214 MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

13 Tabelle 6: Gruppe Vergleich des neuen rekombinanten IgM-Lineblot (Göttner et al. 2005) mit dem früheren rekombinanten IgG-Westernblot (Schulte-Spechtel et al. 2003) Anzahl der Seren Rekombinanter Westernblot Anzahl (%) positiver Seren Rekombinanter Lineblot * Lineblot mit zusätzlichen Antigenen EM a 15 6 (40.0) 11 (73.3) 13 (86.7) NB b (40.0) 23 (46.0) 35 (70.0) ACA c 10 4 (40.0) 5 (50.0) 6 (60.0) AT d 10 4 (40.0) 4 (40.0) 8 (80.0) alle frühen LB e Fälle (40.0) 34 (52.3) 48 (73.8) Kontrollen f (1.8) 1 (0.9) 2 (1.8) a b c d Erythema migrans; Neuroborreliosis (Stadium II); Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III); Lyme-Arthritis (Stadium III); e f Lyme-Borreliose; gesunde Kontrollen (n = 60), Patienten mit Syphilis (n = 10), Patienten mit positivem Rheumafaktor (n = 10), Patienten mit Fieber unklarer Ursache (n = 30); *nur Antigene aus dem früheren rekombinanten IgM-Westernblot ausgewertet Antigen (Stamm) p100 (PKo) EM NB späte LB Kontrollen p58 (PBi) (B31) BmpA (PKo) (PBi) VlsE (PKa2) (PKo)* (PBi)* (B31) (PKo) OspC (PBi) (20047) (PKo) p41i (PBi) (B31)* DbpA (PKo) (PBr) (PBi)* Abb. 5. IgG Line-Immunoblot. Die Borrelienstämme gehören folgenden Spezies an: B31 und PKa2 B. burgdorferi s.s., PKo B. afzelii, PBr B. garinii OspA-Typ 3, PBi B. garinii OspA-Typ 4, und B. garinii unbekannter OspA-Typ. Die Seren stammen von Patienten mit Erythema migrans (EM), früher Neuroborreliose (NB), Acrodermatitis chronica atrophicans oder Lyme Arthritis (späte LB) und Kontrollpersonen. Die rekombinante Immunoblot-Technologie ist ein wesentlicher Schritt für die Standardisierung und die Erhöhung der Sensitivität, da homologe Antigene verschiedener Stämme (speziell solcher mit niedriger Sequenzidentität wie DbpA) und nur in vivo exprimierte Proteine (VlsE) verwendet werden können. Bestimmung des Liquor/Serum-Index. Methoden, welche Störungen der Blut/Liquor-Schranke berücksichtigen, sind geeignet, die intrathekale Antikörper-Produktion zu bestimmen (Wilske et al. 1986, Hansen et al. 1990, Hansen et al. 1991). Die Bestimmung des Liquor/Serum-Index soll durchgeführt werden, wenn Verdacht auf eine Neuroborreliose besteht. Er kann in einigen Fällen schon positiv sein, wenn der Serum-Antikörper-Test noch im negativen oder grenzwertigen Bereich ist, insbesondere dann, wenn die neurologischen Symptome erst kurz bestehen (Wilske et al. 2000). Abhängig von der Zeitspanne seit dem Auftreten der ersten neurologischen Symptome ist der IgG Liquor/Serum-Index bei 80-90% der Patienten (8-41 Tage nach Auftreten der Symptome) bis zu 100% der Patienten (> 41 Tage nach Auftreten der Symptome) positiv (Hansen et al. 1991). Der Nachweis intrathekal produzierter IgM-Antikörper weist eine hohe Sensitivität bei Neuroborreliose mit kurzer Krankheitsdauer auf und dies insbesondere bei Kindern (Christen et al. 1993, Hansen et al. 1991). Die Bestimmung des Liquor/Serum-Index ist besonders wichtig für die Diagnose der chronischen Neuroborreliose. Ein positiver IgG Liquor/Serum Index ist essentiell für die Diagnose der chronischen Borreliose des Zentralnervensystems (s. EUCALB Falldefinitionen, Stanek et al. 1996), während die chronische periphere Neuropathie gewöhnlich keine intrathekale Antikörperbildung aufweist (Kristoferitsch et al. 1993). MIKROBIOLOGE 15.Jg

14 Antigen (Stamm) p100 (PKo) EM NB Kontrollen p58 (PBi) BmpA (B31) (PKo) (PBi) VlsE OspC p41i DbpA (PKa2) (PKo)* (PBi)* (B31) (PKo) (PBi) (20047) (PKo) (PBi) (B31)* (PKo) (PBr) (PBi)* Abb. 6. IgM Line-Immunoblot. Die Borrelienstämme gehören folgenden Spezies an: B31 und PKa2 B. burgdorferi s.s., PKo B. afzelii, PBr B. garinii OspA-Typ 3, PBi B. garinii OspA-Typ 4, und B. garinii unbekannter OspA-Typ. Die Seren stammen von Patienten mit Erythema migrans (EM) und früher Neuroborreliose (NB) und Kontrollpersonen. Serologische Befunde in verschiedenen Stadien der Erkrankung. Die Interpretation serologischer Testergebnisse muss immer im Kontext mit den klinischen Befunden erfolgen (Tabelle 3). Hier sind Falldefinitionen hilfreich (Stanek et al. 1996, Wilske et al. 2000). Im Stadium I (Erythema migrans) sind nur 20-50% der Patienten seropositiv für IgM und/oder IgG Antikörper (Åsbrink et al. 1985b, Hansen and Åsbrink 1989, Weber et al. 1990). IgM Antikörper sind hier prävalent. Eine Ausnahme stellt möglicherweise die Immunantwort gegen VlsE dar. Bei amerikanischen Patienten mit Erythema migrans sind VlsE-IgG Antikörper noch vor der Borrelien-spezifischen IgM Antwort nachweisbar (bei akutem Erythema migrans in 44% versus 19%, bei convaleszentem Erythema migrans in 59% versus 43%) (Bacon et al. 2003). Bei europäischen Patienten mit Erythema migrans wurde eine frühe IgG-Antwort gegen VlsE bei 20 von 23 (87%) von Kultur-bestätigten Fällen von E. migrans beobachtet, die IgM Antwort wurde nicht untersucht (Liang et al. 2000). Im Stadium II (akute Neuroborreliose) steigt die Seropositivität (IgM und/oder IgG Antikörper) auf 70-90% (Hansen et al. 1988, Wilske et al. 1993a). Im Prinzip können Patienten mit Frühmanifestationen seronegativ sein, speziell solche mit kurzer Krankheitsdauer. Dann sollte eine serologische Verlaufskontrolle erfolgen. Sechs Wochen oder mehr nach Krankheitsbeginn sind 100% der Patienten mit Stadium II Neuroborreliose seropositiv (Hansen et al.1988). Bei Fällen mit Spätmanifestationen (Stadium III, Acrodermatis und Arthritis) waren IgG-Antikörper bei allen untersuchten Patienten vorhanden (Hansen and Åsbrink 1989, Johnson et al. 1996, Wilske et al. 1993a). Ein negativer IgG-Test spricht gegen die Diagnose einer späten Lyme-Borreliose. Daher ist auch ein positiver IgM- Test bei negativem IgG-Test nicht diagnostisch für eine späte Lyme-Borreliose (Wilske et al. 2000). Da serologische Befunde beträchtlich variieren können und Antikörper für lange Zeit auch bei erfolgreich therapierten Personen persistieren können, sind serologische Verlaufskontrollen nicht geeignet um Therapieversager zu ermitteln. Vor kurzem wurde der Rückgang VlsE-spezifischer Antikörper als ein Indikator für erfolgreiche Therapie angesehen (Philipp et al., 2003). Dieses konnte jedoch in einer europäischen Studie nicht bestätigt werden (Peltomaa et al., 2003). Die Präsenz spezifischer Antikörper beweist nicht das Vorhandensein einer klinischen Manifestation. Ein positiver Antikörpertest kann auch durch klinische oder subklinische Infektionen in der Vergangenheit bedingt sein. Je unspezifischer die Symptome des Patienten desto geringer ist der prädiktive Wert eines positiven serologischen Befundes. In der normalen gesunden Bevölkerung variiert die Seropositivität mit dem Alter und der Outdoor- Aktivität (z.b. in einer Studie aus Bayern zwischen <5% bis zu 20%) (Reimer et al. 1999). Methoden welche nicht für die mikrobiologische Diagnostik empfohlen werden. Seit kurzem werden zunehmend Methoden in kommerziell orientierten Laboratorien durchgeführt, welche für diagnostische Zwecke nicht ausreichend evaluiert sind. Darunter fallen Antigen-Teste aus Körperflüssigkeiten, PCR aus Urin oder Zecken, der Lymphozyten-Transformationstest, der Nachweis zystischer Formen sowie der Visual Contrast Sensitivity Test (VCS). Diese Teste werden nicht für die mikrobiologische Diagnose empfohlen. Sie sind unzuverlässig, und manche von ihnen sind auch noch sehr 216 MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

15 teuer, speziell wenn sie dann noch für die Therapiekontrolle verwendet werden. (Brettschneider et al. 1998, Kalish et al. 2003, Klempner et al. 2001). Im Folgenden eine Darstellung der am häufigsten eingesetzten nicht zu empfehlenden Methoden. Nachweis von Borrelien aus der vom Menschen entfernten Zecke. Die Untersuchung von Zecken auf B. burgdorferi ist nur dann sinnvoll, wenn aus dem Ergebnis eine entsprechende Konsequenz abgeleitet werden kann: (1) Bei negativem Testergebnis muss die gestochene Person mit genügender Sicherheit davon ausgehen können, dass keine Infektion mit B. burgdorferi stattgefunden hat; (2) bei positivem Testergebnis muss dagegen eine genügende Wahrscheinlichkeit für eine klinisch manifeste Infektion bestehen. Folgende Punkte müssen für eine Bewertung dieser Untersuchungsmethode berücksichtigt werden: 1. Nicht jeder Zeckenstich wird entdeckt. Ixodes ricinus- Larven und -Nymphen sind mit dem bloßen Auge kaum zu erkennen und werden daher häufig einfach mit den Fingernägeln weggekratzt. Das negative Untersuchungsergebnis kann daher zu einer falschen Sicherheit führen, da durch unbemerkte Stiche davor o- der danach doch eine Infektion mit Borrelien übertragen wurde, d.h. die falsche Zecke entdeckt und untersucht wurde. 2. Selbst bei infizierten Zecken kommt es meist nicht zur Übertragung, und auch die erfolgreiche Übertragung von Borrelien auf den Menschen führt nur in einem Teil der Fälle zu einer klinisch fassbaren Infektion (z.b. Nahimana et al. 2004: von 17 Personen mit Serokonversion erkrankten 3 an Lyme-Borreliose). 3. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität der verschiedenen Methoden ist weitgehend unklar. Als Einflussfaktoren kommen u.a. Transportzeit, DNA- Extraktion, inhibitorische Substanzen (z.b. Hämoglobin oder Rückenschild der Zecke), Laborkontaminationen oder die genetische Heterogenität von B. burgdorferi s.l. in Betracht. 4. Die überwiegende Mehrzahl der resultierenden Erkrankungen ist einfach zu diagnostizieren und effizient zu therapieren (Huppertz et al. 1999). 5. Bislang konnte durch europäische Studien nicht überzeugend gezeigt werden, dass eine Antibiotikaprophylaxe oder -Therapie nach Stich durch eine borrelieninfizierte Zecke mehr Vorteile als Nachteile aufweist. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Untersuchung von vom Menschen entfernten Zecken auf B. burgdorferi s.l. wegen niedriger Infektions- und Manifestationsrate, ungenügendem negativen und positiven Vorhersagewert der Methode, guter Prognose der Erkrankung und fehlender Evidenz für eine sinnvolle Prophylaxe derzeit nicht empfohlen werden kann. Der Lymphozyten Transformationstest (LTT) und sein Stellenwert. Der LTT misst im Prinzip die Proliferation von Lymphozyten aus Patientenblut nach Stimulation mit einem Antigen (z.b. sonifizierte Borrelien, rekombinante Borrelien-Antigene). Mit diesem Test wird also versucht, die zelluläre Immunantwort gegenüber bestimmten Antigenen zu bestimmen. Dieser Test wird von verschiedenen Laboratorien für die Diagnostik der Lyme-Borreliose angeboten u.a. mit den Argumenten, dieser Test wäre speziell im Vergleich zur Serologie sensitiver und spezifischer, nur bei aktiver Borreliose reaktiv und auch für die Therapiekontrolle geeignet. Dattwyler et al haben schon 1988 darauf hingewiesen, dass der LTT bei seronegativen chronischen Lyme- Borreliosen, die sich nach prompter Therapie einer frühen Manifestation entwickelt haben, positiv sein kann (Dattwyler et al. 1988). In der Folge publizierte Studien konnten aber keine Vorteile des LTT für die Routinediagnostik der Lyme-Boreliose im Vergleich zur Serologie aufzeigen (Bauer et al. 2001, Buechner et al. 1995, Dressler et al. 1991, Ekerfelt et al. 1999, Horowitz et al. 1994, Huppertz et al. 1996, Krause et al. 1991, Schempp et al 1993, Vaz et al. 2001). Krause et al. untersuchten 24 Patienten mit verschiedenen Manifestationen der Lyme-Borreliose, als Kontrollgruppe 30 Patienten mit Arthritis anderer Ursache und 20 gesunde Personen (Krause et al. 1991). Für den Antikörpernachweis (IFT) war die Sensitivität 83% bei einer Spezifität von 92%, für den Lymphozyten-Proliferationstest war für eine Spezifität von 92% die Sensitivität 71%, für eine Sensitivität von 83% war die Spezifität 72%. Krause nahm zum LTT vor kurzem wie folgt Stellung: Ob allerdings der LTT im klinischen Alltag zur Diagnosefindung beiträgt, scheint sehr fraglich. Außerdem ist auf Grund der geringen Spezifität des Testes die Gefahr falsch positiver Ergebnisse groß. Der LTT sollte daher zur Diagnostik einer Lyme-Borreliose nicht eingesetzt werden (Krause A. 2003). Dressler et al. untersuchten 42 Patienten mit chronischer Lyme-Borreliose und 77 Kontrollpersonen (Dressler et al. 1992). Als Antigen wurde ein sonifizierter B. burgdorferi s.s. Stamm eingesetzt. Die Sensitivität des Testes wurde mit 45% (Serologie 93%) angegeben bei einer Spezifität von 95% (Serologie: keine Angaben). Vier von neun untersuchten Labor-Mitarbeitern waren ebenfalls im LTT positiv. Huppertz et al untersuchten 55 Kinder mit Lyme- Arthritis und 48 Kontrollpatienten. Als Antigen wurden zwei verschiedene, nicht sonifizierte B. burgdorferi s.s. Stämme verwendet. Die Sensitivität des Testes war 77% bei einer Spezifität von 78%. Bei acht der Kinder mit Lyme-Arthritis war der Stimulationsindex vor Therapie negativ aber nach Therapie positiv. Die Ergebnisse der Studie zeigen nach Ansicht der Autoren, dass der Test weder für eine prognostische Aussage noch für die Verlaufskontrolle hilfreich ist. Als Schlussfolgerung schreiben die Autoren: "Rarely the lymphocyte proliferation assay may aid in finding the correct diagnosis when clinical presentation and anti-borrelial serology do not match." Zusammenfassend bleibt festzuhalten: Nach den bisherigen Studien ist dieser Test nicht standardisiert und im Vergleich zur Serologie weniger sensitiv und insbesondere weniger spezifisch. Der LTT ist daher für die Routinediagnostik der Lyme-Borreliose nicht geeignet. Mittlerweile wird auch ein ELISPOT Test (kommerziell verfügbare LTT Modifikation) auf die humane granulozytäre Ehrlichiose empfohlen, u.a. mit dem Hinweis, dass der Nachweis einer Koinfektion für Prognose und weiteren Verlauf der Borreliose erhebliche Bedeutung hätte. In diesem Zusammenhang möchten wir darauf hinweisen, dass bislang in Deutschland noch kein einziger Fall einer MIKROBIOLOGE 15.Jg

16 autochthonen humanen granulozytären Ehrlichiose publiziert wurde, und damit Einsatz dieses Testes bereits aus epidemiologischen Gründen mehr als fragwürdig erscheint. Bedeutung der zystischen Formen von B. burgdorferi. Sogenannte zystische Formen, auch als Sphäroblasten, zellwandlose- oder L-Formen bezeichnet, können in vitro durch unterschiedliche Stressfaktoren wie Serumentzug, Anzucht in Liquor cerebrospinalis, extreme Änderung des ph-wertes oder Temperaturerhöhung, induziert werden (Brorson et al. 1997, 1998, Murgia et al. 2004, Alban et al. 2000). Auch waren offensichtlich reine L-Formen für Mäuse infektiös (Gruntar et al. 2001). Ob allerdings diese Formen auch für die Pathogenese der Erkrankung oder für die Diagnostik eine Bedeutung haben, ist bislang unklar. Mittlerweile werden Teste angeboten, die angeblich spezifisch zellwandlose Formen von B. burgdorferi s.l. nachweisen sollen. Diese Teste wurden allerdings nicht entsprechend evaluiert und können für die Diagnostik der Lyme-Borreliose nicht empfohlen werden. Der VCS-Test (visual contrast sensitivity test). Der VCS-Test wird von Hartmann und Müller-Marienburg bei chronisch kranken Menschen mit unspezifischen Symptomen wie Muskelschmerzen, Muskelzucken, Gelenkschmerzen, Leistungsschwäche, Müdigkeit, Durchfall, Verstopfung und ähnlichen Symptomen empfohlen (Hartmann und Müller-Marienburg 2003). Dem Test zugrunde liegt die Hypothese, dass B. burgdorferi ein lipophiles Neurotoxin produzieren würde, welches unter anderem an den Nervus opticus binden und dort eine mit dem VCS-Test messbare Funktionsbeeinträchtigung, nämlich Defizit im Erkennen von Grautönen, hervorrufen würde (Hartmann und Müller-Marienburg 2003). Uns ist keine wissenschaftliche Publikation bekannt, welche die dem Test zugrunde liegende Vorstellung stützt. Da das lipophile Neurotoxin dem enterohepatischen Kreislauf unterliegen würde, wird empfohlen, Cholestyramin therapeutisch zur Unterbrechung des enterohepatischen Toxinkreislaufs einzusetzen. Sowohl vom Einsatz des VCS-Testes für die Diagnostik der Lyme-Borreliose als auch der abenteuerlich anmutenden Therapie mit Cholestyramin kann nur dringend abgeraten werden. Literatur Alban, PS, Johnson, PW, Nelson, DR. Serum-starvation-induced changes in protein synthesis and morphology of Borrelia burgdorferi. Microbiol 146(2000) Arnez M, Ruzic-Sabljic E, Ahcan J, Radsel-Medvescek A, Pleterski- Rigler D, Strle F. Isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato from blood of children with solitary erythema migrans. Pediatr Infect Dis J 2001; 3: Åsbrink, E, Hovmark, A. Successful cultivation of spirochetes from skin lesions of patients with erythema chronicum migrans Afzelius and acrodermatitis chronica atrophicans. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. B 1985; 93: Åsbrink, E.; Hovmark, A.; Hederstedt, B. Serologic studies of erythema chronicum migrans Afzelius and acrodermatitis chronica atrophicans with indirect immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Acta Derm Venereol 1985; 65: Bacon, RM, Biggerstaff, BJ, Schriefer, M, Gilmore, RD, Philipp, MT, Steere, A, Wormser, GP, Marques, AR, and Johnson, BJB. Improved serodiagnosis of Lyme disease by kinetic ELISAs using recombinant VlsE1 or peptide antigens of Borrelia burgdorferi compared with two-tiered testing. J Infect Dis; 2003; 187: Bauer, Y.; Hofmann, H.; Jahraus, O.; Mytilineos, J.; Simon, M. M.; Wallich, R. Prominent T cell response to a selectively in vivo expressed Borrelia burgdorferi outer surface protein (pg) in patients with Lyme disease. Eur. J. Immunol.: 31(2001) Brettschneider, S.; Bruckbauer, H.; Klugbauer, N.; Hofmann, H. Diagnostic value of PCR for detection of Borrelia burgdorferi in skin biopsy and urine samples from patients with skin borreliosis. J. Clin. Microbiol.: 36(1998) Brorson, O.; Brorson, S. H. In vitro conversion of Borrelia burgdorferi to cystic forms in spinal fluid, and transformation to mobile spirochetes by incubation in BSK-H medium. Infection: 26(1998) Brorson, O.; Brorson, S. H. A rapid method for generating cystic forms of Borrelia burgdorferi and their reversal to mobile spirochetes. APMIS 106 (1998) Buechner, S. A.; Lautenschlager, S.; Itin, P.; Bircher, A.; Erb, P. Lymphoproliferative responses to Borrelia burgdorferi in patients with erythema migrans, acrodermatitis chronica atrophicans, lymphadenosis benigna cutis, and morphea. Arch. Dermatol.: 131(1995) Canica, MM, Nato, F, Du Merle, L, Mazie, JC, Baranton, G, Postic, D. Monoclonal antibodies for identification of Borrelia afzelii sp. nov. associated with late cutaneous manifestations of Lyme borreliosis. Scand J Infect Dis 1993; 25: Centers for Disease Control and Prevention. Caution regarding testing for Lyme disease. Morbid Mortal Wkly Rprt 2005; 54:125 Centers for Disease Control and Prevention. Recommendations for Test Performance and Interpretation from the Second National Conference on Serologic Diagnosis of Lyme Disease. Morbid Mortal Wkly Rprt 1995;44:590 Christen H-J, Hanefeld F, Eiffert H, Thomssen R. Epidemiology and clinical manifestations of Lyme borreliosis in childhood. A prospective multicentre study with special regard to neuroborreliosis. Acta Paediatr 82 Suppl 1993; 386:1-76 Dattwyler, R. J.; Volkman, D. J.; Luft, B. J.; Halperin, J. J.; Thomas, J.; Golightly, M. G. Seronegative Lyme disease: Dissociation of specific T- and B-lymphocyte responses to Borrelia burgdorferi. N. Engl. J. Med.: 319(1988) Demaerschalck, I, Messaoud, AB, De Kesel, M, Hoyois, B, Lobet, Y, Hoet, P, Bigaignon, G, Bollen, A, Godfroid, E. Simultaneous presence of different Borrelia burgdorferi genospecies in biological fluids of Lyme disease patients. J Clin Microbiol: 1995; 33: Dressler, F, Natalino, H, Yoshinari, Steere, A C. The T-cell proliverative assay in the diagnosis of lyme borreliosis. Ann Int Med 115(1991) Dressler, F, Ackermann, R, Steere, AC. Antibody responses to the three genomic groups of Borrelia burgdorferi in European Lyme borreliosis. J Infect Dis 1994; 169: Eiffert, H, Karsten, A, Thomssen, R, Christen H-J. Characterization of Borrelia burgdorferi strains in Lyme arthritis. Scand J Infect Dis 1998; 30: Eiffert, H, Ohlenbusch, A, Christen, H-J, Thomssen, R, Spielman, A, Matuschka, F-R. Nondifferentiation between Lyme disease spirochetes from vector ticks and human cerebrospinal fluids. J Infect Dis 1995; 171: Ekerfelt, C.; Forsberg, P.; Svenvik, M.; Roberg, M.; Bergström, S.; Ernerudh, J. Asymptomatic Borrelia-seropositive individuals display the same incidence of Borrelia-specific interferon-gamma (IFN-y)- secreting cells in blood as patients with clinical Borrelia infection. Clin. Exp. Immunol.: 115(1999) Fingerle, V, Schulte-Spechtel, U, Wilske, B. Evaluation of an ELISA based on the C6-peptide of VlsE for diagnosis of early neuroborreliosis. Int J Med Microbiol 2002; 292 (Suppl. 34): 217. Gern, L, Hu CM, Kocianova E, Vyrestekova V, Rehacek J. Genetic diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates obtained from Ixodes ricinus ticks collected in Slovakia. Europ J Epidemiol (1999)15, Goettner, G., U. Schulte-Spechtel, R. Hillermann, G. Liegl, B. Wilske, and V. Fingerle Improvement of Lyme borreliosis serodiagnosis by a newly developed recombinant IgG and IgM line immunoblot and addition of VlsE- and DbpA homologues. J.Clin.Microbiol. in press Goossens, H A T, van den Bogaard, A E, Nohlmans, M K E. Evaluation of fifteen commercially available serological tests for diagnosis of Lyme borreliosis. Eur J Clin Microbiol. Infect Dis 1999; 18 : MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

17 Gruntar, I, Malovrh, T, Murgia, R, Cinco, M. Conversion of Borrelia garinii cystic forms to motile spirochetes in vivo. APMIS 105(2001) Hansen, K, Cruz, M, Link, H. Oligoclonal Borrelia burgdorferi-specific IgG antibodies in cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis. J Infect Dis 1990; 161: Hansen, K, Hindersson, P, Pedersen, NS. Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in Lyme disease. J Clin Microbiol 1988; 26: Hansen, K, Lebech, A-M. Lyme neuroborreliosis: a new sensitive diagnostic assay for intrathecal sythesis of Borrelia burgdorferi - specific immunoglobulin G, A, and M. Ann. Neurol.: 30(1991) Hansen, K.; Åsbrink, E. Serodiagnosis of erythema migrans and acrodermatitis chronica atrophicans by the Borrelia burgdorferi flagellum enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 1989; 27: Hartmann und Müller-Marienburg. Indirekter Neurotoxinnachweis durch den Visual Contrast Sensitivity Test bei Patienten mit chronischer Borreliose. Neurologie Hauser, U, Lehnert, G, Lobentanzer, R, Wilske, B. Interpretation criteria for standardized western blots for three european species of Borrelia burgdorferi sensu lato. J Clin Microbiol : Hauser, U, Lehnert, G, Wilske, B. Diagnostic value of proteins of three Borrelia species (Borrelia burgdorferi sensu lato) and implications for development and use of recombinant antigens for serodiagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5: Heikkilä, T, Seppälä, I, Saxen, H, Panelius, J, Yrjänäinen, H, Lahdenne, P. Speciesspecific serodiagnosis of Lyme arthritis and neuroborreliosis due to Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, and B. garinii by using decorin binding protein A. J Clin Microbiol 2002; 40: Horowitz, HW, Pavia, CS, Bittker, S, Forseter, G, Cooper, D, Nadelman, RB, Byrne, D, Johnson, RC, Wormser, GP. Sustained cellular immune response to Borrelia burgdorferi: Lack of correlation with clinical presentation and serology. Clin Diagn Lab Immunol 1(1994)4: Hubalek, Z. Halouzka, J. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur J Epidemiol 1997; 13: Huppertz, H.-I.; Mösbauer, S.; Busch, D. H.; Karch, H. Lymphoproliferative responses to Borrelia burgdorferi in the diagnosis of Lyme arthritis in children and adolescents. Eur. J. Pediatr.: 155(1996) Huppertz, H. I.; Böhme, M.; Standaert, S. M.; Karch, H.; Plotkin, S. A. Incidence of Lyme borreliosis in the Würzburg region of Germany. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.: 18(1999) Jaulhac, B, Chary-Valckenaere, I, Sibilia, J, Javier, R-M, Piemont, Y, Kuntz, J-L, Monteil, H, Pourel, J Detection of Borrelia burgdorferi by DNA amplification in synovial tissue samples from patients with Lyme arthritis. Arthritis Rheum 1996; 39: Jaulhac, B.; Heller, R.; Limbach, F. X.; Hansmann, Y.; Lipsker, D.; Monteil, H.; Sibilia, J.; Piemont, Y. Direct molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato species in synovial samples from patients with Lyme arthritis. J. Clin. Microbiol.: 38(2000) Johnson, BJB, Robbins, KE, Balley, RE, Cao, B-L, Sviat, SL. Craven R B, Mayer L W, Dennis D T: Serodiagnosis of Lyme disease: accuracy of a two-step approach using a flagella-based ELISA and immunoblotting. J Infect Dis 1996; 174: Kaiser, R. Teilnehmer der Expertenkonferenz: Frühsommermeningoenzephalitis und Lyme-Borreliose-Prävention vor und nach Zeckenstich. Dtsch med Wochenschr 1998; 123: Kalish, R S, Wood, J A, Golde, W, Bernard R, Davis L E, Grimson R C, Coyle P K, Luft B J. Human T lymphocyte response to Borrelia burgdorferi infection: no correlation between human leukocyte function antigen type 1 peptide response and clinical status. J Infect Dis 2003; 187: Karlsson, M, Hovind-Hougen, K, Svenungsson, B, Stiernstedt, G. Cultivation and characterization of spirochetes from cerebrospinal fluid of patients with Lyme borreliosis J Clin Microbiol 1990; 28: Klempner, MS, Schmid, CH, Hu, L, Steere, AC, Johnson, G, McCloud, B, Noring, R, Weinstein, A. Intralaboratory reliability of serologic and urine testing for Lyme disease. Am J Med 2001; 110: Krause, A, Brade, V, Schoerner, C, Solbach, W, Kalden, J R, Burmester, G. T cell proliferation induced by Borrelia burgdorferi in patients with lyme borreliosis. Arthr Rheum 34(1991) Krause, A. Verraten Lymphos die Borreliose? Medical Tribune 38(2003)14:26 Kristoferitsch, W. Chronical peripheral neuropathy. in: Weber, K.; Burgdorfer, W. (eds.) Aspects of Lyme borreliosis. Berlin, Heidelberg, New York, Springer(1993) Lawrenz, MB, Hardham, JM, Owens, RT, Nowakowski, J, Steere, AC, Wormser, GP, Norris, SJ. Human antibody responses to VlsE antigenic variation protein of Borrelia burgdorferi. J Clin Microbiol 1999; 37: Lebech, A. M., K. Hansen, F. Brandrup, O. Clemmensen, and L. Halkier- Sorensen Diagnostic value of PCR for detection of Borrelia burgdorferi DNA in clinical specimens from patients with erythema migrans and Lyme neuroborreliosis. Mol.Diagn. 5: Liang, FT, Aberer, E, Cinco, M, Gern, L, Hu, CM, Lobet, YN, Ruscio, M, Voet, PE, Weynants, VE, Philipp, MT. Antigenic conservation of an immunodominant invariable region of the VlsE lipoprotein among european pathogenic genospecies of Borrelia burgdorferi sl. J Infect Dis 2000; 182: Liang, FT, Alvarez, AL, Gu, Y, Nowling, JM, Ramamoorthy, R, Philipp, MT. An immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi. J Immunol 1999; 163: Lünemann, JD, Zarmas, S, Priem, S, Franz, J, Zschenderlein, R, Aberer, E, Klein, R, Schouls, L, Burmester, GR, Krause, A. Rapid typing of Borrelia burgdorferi sensu lato species in specimens from patients with different manifestations of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 2001; 39: Michel, H.; Wilske, B.; Hettche, G.; Goettner, G.; Heimerl, C.; Reischl, U.; Schulte-Spechtel, U.; Fingerle, V. An ospa-polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism-based method for sensitive detection and reliable differentiation of all European Borrelia burgdorferi sensu lato species and OspA-types. Med. Microbiol. Immunol.: 193(2004) Murgia, R.; Cinco, M. Induction of cystic forms by different stress conditions in Borrelia burgdorferi. APMIS: 112(2004)57-62 Nahimana, I.; Gern, L.; Blanc, D. S.; Praz, G.; Francioli, P.; Peter, O. Risk of Borrelia burgdorferi infection in western Switzerland following a tick bite. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.: 23(2004) Nocton, J J, Dressler, F, Rutledge, B J, Rys P N, Persing, D H, Steere, A C. Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerase chain reaction in synovial fluid from patients with Lyme arthritis. N Engl J Med 1994; 330: Ohlenbusch, A, Matuschka, F-R, Richter, D,Christen, H-J, Thomssen, R, Spielman, A, Eiffert, H. Etiology of the acrodermatitis chronica atrophicans lesion in Lyme disease. J Infect Dis 1996; 174: Panelius, J., P. Lahdenne, H. Saxen, S. A. Carlsson, T. Heikkila, M. Peltomaa, A. Lauhio, and I. Seppala Diagnosis of Lyme neuroborreliosis with antibodies to recombinant proteins DbpA, BBK32, and OspC, and VlsE IR6 peptide. J. Neurol. 250: Patel, R.; Grogg, K. L.; Edwards, W. D.; Wright, A. J.; Schwenk, N. M. Death from inappropriate therapy for Lyme disease. Clin. Infect. Dis. 31(2000) Péter, O, Bretz, A.-G., Bee, D. Occurence of different genospecies of Borrelia burgdorferi sensu lato in ixodid ticks of Valais, Switzerland. Eur J Epidemiol 1995; 11: Peltomaa,M., McHugh,G., and Steere,A.C. (2003). Persistence of the antibody response to the VlsE sixth invariant region (IR6) peptide of Borrelia burgdorferi after successful antibiotic treatment of Lyme disease. J. Infect. Dis. 187, Philipp,M.T., Marques,A.R., Fawcett,P.T., Dally,L.G., and Martin,D.S. (2003). C6 test as an indicator of therapy outcome for patients with localized or disseminated lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 41, Pfister, H-W, Wilske, B, Weber, K. Lyme borreliosis: basic science and clinical aspects. Lancet 1994; 343: Preac-Mursic, V, Wilske, B, Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. Eur J Microbiol Infect Dis. 1991; 10: Rauter, C, Oehme, R, Diterich, I, Engele, M, Hartung, T. Distribution of clinically relevant Borrelia genospecies in ticks assessed by a novel, single-run, real-time PCR. J Clin Microbiol 2002;40:36-43 Reimer, B.; Marschang, A.; Fingerle, V.; Wilske, B.; v. Sonnenburg, F.; v. Hoecke, C. Epedimiology of Lyme borreliosis in South-Eastern Bavaria (Germany). Zent. bl. Bakteriol. 1999; 289: MIKROBIOLOGE 15.Jg

18 Rijpkema S G T, Tazelaar D J, Molkenboer M J C H, Noordhoek G T, Plantinga G, Schouls L M, Schellekens J F P. Detection of Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii and group VS116 by PCR in skin biopsies of patients with erythema migrans and acrodermatitis chronica atrophicans. Clin Microbiol Infect. 1997;3: Rijpkema, S, Golubic, D, Molkenboer, M, Verbeck-De Kruif, N, Schellekens, J. Idenfication of four genomic groups of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks collected in a Lyme borreliosis endemic region of northern Croatia. Exp Appl. Acarol 1996; 20: Robertson, J, Guy, E, Andrews, N, Wilske, B, Anda, P, Granström, M, Hauser, U, Moosmann, Y, Sambri, V, Schellekens, J, Stanek, G, Gray, J. A European multicenter study of immunoblotting in serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol (2000)38: Schempp, C.; Owsianowski, M.; Lange, R.; Gollnick, H. Comparison of Borrelia burgdorferi ultrasonicate and whole B. burgdorferi cells as a stimulus for t-cell proliferation and GM-CSF secretion in vitro. Zbl. Bakt.: 279(1993) Schmidt, BL. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections. Clin Microbiol Rev 1997; 10: Schulte-Spechtel, U. Lehnert, G.; Liegl, G, Fingerle, V, Heimerl, C, Johnsson, BJB, Wilske,B. Significant improvement of the recombinant Borrelia IgG immunoblot by addition of VlsE and a DbpA homologue derived from B. garinii for the diagnosis of early Neuroborreliosis. J Clin Microbiol. 2003; 41: Stanek, G, O'Connell, S, Cimmino, M, Aberer, E, Kristoferitsch, W, Granström, M, Guy, E, Gray, J. European Union concerted action on risk assessment in Lyme borreliosis: clinical case definitions for Lyme borreliosis. Wien Klin Wochenschr 1996; 108/23: Steere, AC. Medical progress - Lyme disease. N Engl J Med 1989; 321: Strle, F.; Nadelman, R. B.; Cimperman, J.; Nowakowski, J.; Picken, R. N.; Schwartz, I.; Maraspin, V.; Aguero-Rosenfeld, M. E.; Varde, S.; Lotric-Furlan, S.; Wormser, G. P. Comparison of culture-confirmed erythema migrans caused by Borrelia burgdorferi sensu stricto in New York State and by Borrelia afzelii in Slovenia. Ann. Intern. Med.: 130(1999)32-36 Van Dam, AP, Kuiper, H, Vos, K, Widjojokusumo, A, De Jongh, BM, Spanjaard, L, Ramselaar, ACP, Kramer, MD, Dankert, J. Different genospecies of Borrelia burgdorferi are associated with distinct clinical manifestations of Lyme borreliosis. Clin Infect Dis 1993 ; 17: Vasiliu, V, Herzer, P, Rössler, D, Lehnert, G, Wilske, B. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu lato demonstrated by an ospa-typespecific PCR in synovial fluid from patients with Lyme arthritis. Med Microbiol Immunol 1998; 187: Vaz, A.; Glickstein, L.; Field, J. A.; McHugh, G.; Sikand, V. K.; Damle, N.; Steere, A. C. Cellular and humoral immune responses to Borrelia burgdorferi antigens in patients with culture-positive early Lyme disease. Infect. Immun.: 69(2001) Von Stedingk, L V, Olsson, I, Hanson, H S, Åsbrink, E, Hovmark, A. Polymerase chain reaction for detection of Borrelia burgdorferi DNA in skin lesions of early and late Lyme borreliosis. 1995; Eur J Clin Microbiol Infect. Dis 14: 1-5. Wang, G, van Dam, AP, Dankert, J. Phenotypic and genetic characterization of a novel Borrelia burgdorferi sensu lato isolate from a patient with Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 1999; 37: Wang, G, van Dam, AP, Schwartz, I, Dankert, J. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin Microbiol Rev 1999; 12: Weber, K, Preac-Mursic, V, Wilske, B, Thurmayr, R, Neubert, U, Scherwitz, C. A randomized trial of ceftriaxone versus oral penicillin for treatment of early Lyme borreliosis. Infection 1990; 18:91-96 Wilske, B. Microbiological diagnosis in Lyme borreliosis. Int. J. Med. Microbiol. 2002, 291,(Suppl.)33: Wilske, B. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis.: 3(2003) Wilske, B, Busch, U, Eiffert, H, Fingerle, V, Pfister, H-W, Rössler, D, Preac-Mursic, V. Diversity of OspA and OspC among cerebrospinal fluid isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato from patients with neuroborreliosis in Germany. Med Microbiol Immunol 1996; 184: Wilske, B, Fingerle, V, Herzer, P, Hofmann, A, Lehnert, G, Peters, H, Pfister, H-W, Preac-Mursic, V, Soutschek, E, Weber, K. Recombinant immunoblot in the serodiagnosis of Lyme borreliosis, comparison with indirect immunofluoerescence and enzyme-linked immnosorbent assay. Med Microbiol Immunol 1993; 182: Wilske, B, Habermann, C, Fingerle, V, Hillenbrand, B, Jauris-Heipke, S, Lehnert, G, Pradel, I, Rössler, D, Schulte-Spechtel, U. An improved recombinant IgG immunoblot for serodiagnosis of Lyme borreliosis. Med Microbiol Immunol 1999; 188: Wilske, B.; Preac-Mursic, V. Microbiological diagnosis of Lyme borreliosis. in: Weber, K.; Burgdorfer, W. (eds.) Aspects of Lyme borreliosis. Berlin, Heidelberg, New York, Springer(1993) Wilske, B, Preac-Mursic, V, Göbel, U B, Graf, B, Jauris-Heipke, S, Soutschek, E, Schwab, E, Zumstein, G. An OspA serotyping system for Borrelia burgdorferi based on reactivity with monoclonal antibodies and OspA sequence analysis. J Clin Microbiol 1993; 31: Wilske, B, Schierz, G, Preac-Mursic, V, von Busch, K, Kühbeck, R, Pfister, HW, Einhäupl, K. Intrathecal production of specific antibodies against Borrelia burgdorferi in patients with lymphocytic meningoradiculitis (Bannwarth's syndrome). J Infect Dis 1986; 153: Wilske, B, Schriefer, M. Borrelia. In Manual of Clinical Microbiology (8th edition). Edited by Murray, P. R.; Baron, E. J.; Jorgensen, J. H.; Pfaller, M. A.; Yolken, R. H. (eds.) Manual of Clinical Microbiology (8th edition) Volume 1. Washington, D. C., ASM Press(2003) Wilske, B, Zöller, L, Brade, V, Eiffert, M, Göbel, UB, Stanek, G unter Mitarbeit von HW Pfister. MIQ 12 Lyme-Borreliose. In Qualitätsstandards in der mikrobiologisch infektiologischen Diagnostik. Edited by Mauch H and Lütticken R; im Auftrag der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM). Urban & Fischer Verlag, München Jena; 2000 (english version: Zore, A.; Ruzic-Sabljic, E.; Maraspin, V.; Cimperman, J.; Lotric-Furlan, S.; Pikelj, A.; Jurca, T.; Logar, M.; Strle, F. Sensitivity of culture and polymerase chain reaction for the etiologic diagnosis of erythema migrans. Wien. Klin. Wochenschr.: 114(2002) Zoschke, D C, Skemp, A A, Defosse, D L. Lymphoproliferative responses to Borrelia burgdorferi in Lyme disease. Ann Intern Med 114(1991) Korrespondenzadresse: Prof. Dr. med. Bettina Wilske Max von Pettenkofer-Institut, LMU München Nationales Referenzzentrum für Borrelien D München, Pettenkofer-Strasse 9a Tel: Fax: Bettina.Wilske@mvp-bak.med.uni-muenchen.de Homepage: MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005

19 DIAGNOSTIK Neuere Methoden der Diagnostik von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus Wolfgang Witte und Christa Cuny Nationales Referenzzentrum für Staphylokokken, Robert Koch-Institut, Bereich Wernigerode, Wernigerode Nach wie vor sind Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) in den meisten Ländern ein Problem der Krankenhausinfektionen: Infektionen mit diesen Erregern sind mit erhöhter Letalität und verlängerten Krankenhausaufenthalten verbunden [1, 2]. S. aureus erwirbt Resistenz gegen Methicillin durch die Integration von SCCmec- Elementen (staphylococcal cassette chromosome mec), die u. a. das meca-gen tragen, in das Chromosom. Das meca-gen kodiert ein zusätzliches Penicillinbindeprotein, das nur eine geringe Affinität gegen β-laktamantibiotika zeigt und Staphylokokken eine Resistenz gegen alle bisher verfügbaren Vertreter dieser Substanzgruppe verleiht (Übersicht bei [3]). Auftreten und Verbreitung von MRSA in Krankenhäusern sind mit ganz bestimmten Epidemiestämmen assoziiert, von denen 8 klonale Linien zum Teil weltweit verbreitet sind. Diese Stämme gingen aus bereits erfolgreichen Subpopulationen der Species S. aureus durch Integration von SCCmec-Elementen hervor (Übersicht bei [4]). Es gibt dabei mindestens fünf verschiedene Grundtypen von SCCmec (Abb. 1 für Typen I IV [5, 6]). In den vergangenen 5 Jahren traten weitgehend unabhängig von den Hospitalstämmen und auch ohne die für Besiedlung und Infektionen mit nosokomialen MRSA bekannten Risikofaktoren [7] Infektionen außerhalb der Krankenhäuser auf, die durch community MRSA (cmrsa) verursacht werden [8, 9, 10]. Es besteht dabei durchaus die Gefahr, dass cmrsa auch in Krankenhäuser gelangen können und sich dort ausbreiten [11]. Da auch bei koagulasenegativen Staphylokokken der Methicillinresistenz nahezu immer der meca-gen kodierte Resistenzmechanismus zugrunde liegt, beinhaltet die Diagnostik von MRSA stets auch die Speciesdiagnostik von S. aureus. Dies ist bekanntermaßen durch phänotypische Merkmale (z. B. für Koagulase, Verklumpungsfaktor, hitzeresistente DNase, biochemisches Reaktionsprofil) mit hoher Spezifität möglich. Vor allem im Zusammenhang ccra1/ccrb1 meca 10 kb mec-komplex B orfx Typ I ccra2/ccrb2 Tn554 meca pub110 mec-komplex A orfx Typ II ccra3/ccrb3 meca pt181 mer Tn554 ccra2/ccrb2 meca mec-komplex A orfx Typ III mec-komplex B orfx Typ IV ccrc meca orfx Typ V Abbildung 1: Verschiedene Grundtypen I - V der bisher bei Staphylokokken nachgewiesenen SCCmec-Elemente (staphylococcal cassette chromosome mec) Sie sind characteristisch durch den cassette recombinase komplex (ccr), dem mec-komplex (meca-gen, regulatorische Elemente, bei Typ B IS1272) sowie einigen Typ-spezifischen Sequenzen in den dazwischen liegenden Regionen. Im SCCmec II ist das Transposon Tn554 (es enthält erma für Makrolid-Lincosamidin-Streptogramin-Resistenz) sowie das Plasmid pub110 integriert, in SCCmecIII außer Transposon Tn554 das Plasmid pt181 (tetk, Tetrazyklinresistenz) sowie das mer-operon (Quecksilberresistenz). MIKROBIOLOGE 15.Jg

20 mit dem Zeitgewinn, aber auch als Referenzmethoden werden in den letzten Jahren zunehmend molekulare Tests zur Speciesidentifizierung eingesetzt. Diese Tests beruhen zum einen auf Nukleotidpolymorphismen von Genen, die universell bei Bakterien vorhanden sind (house keeping Gene als Grundausstattung) wie z. B. 16S und 23S rdna, rpob (β-untereinheit der RNA Polymerase), hsp60 (Hitzeschock-Protein HSP 60), zum anderen auf Genen, deren Besitz spezifisch für die Species S. aureus ist. Der Nachweis der Polymorphismen in universell vorhandenen Genen erfordert deren Sequenzierung oder eine reverse Hybridisierung an capture probes in Makro- oder Mikroarrays. Species-spezifische Gene können hingegen bereits mit einer einfachen PCR nachgewiesen werden. Tabelle 1 zeigt dazu eine Übersicht. Bei den meisten der gegenwärtig verbreiteten MRSA wird die Resistenzeigenschaft in vitro nur bei einem kleinen Teil der Kultur ausgeprägt (Hetero-MRSA [29]). Dies stellte besondere Anforderungen an die phänotypische Empfindlichkeitsprüfung im Hinblick auf das Mitführen einer Bestätigung mittels Agar-Screen-Test (gemäß NCCLS [30]) oder auch als Bouillon-Screen-Test [31]). Die phänotypische Bestätigung der Methicillinresistenz kann von der Kultur auf der Blutagarplatte ausgehend auch durch einen Agglutinationstest erfolgen, der auf monoklonalen Antikörpern gegen PBP2a beruht und einen zusätzlichen Zeitaufwand von 3 4 Stunden erfordert [32]. Gegenüber Cefoxitin ist der Hetero-Resistenzphänotyp ganz erheblich geringer ausgeprägt als gegenüber anderen Isoxazolylpenicillinen und weiteren β-laktamantibiotika. Dies wurde zunächst dadurch erklärt, dass Cefoxitin ein sehr wirksamer Induktor von PBP2a ist [32]. Die diesbezüglichen Experimente wurden damals mit einem MRSA- Stamm durchgeführt, der ein intaktes mec-regulon (meci, mecr) besitzt. Das ist aber bei den meisten der gegenwärtig weltweit verbreiteten MRSA nicht der Fall (Insertion in mecr bzw. Deletionen), so dass wahrscheinlich noch andere Mechanismen dafür verantwortlich sind, wie z. B. negative Kontrolle durch verwandte Regulationsgene von Penicillinase-Plasmiden [33]. Bei der phänotypischen Resistenzbestimmung zeigt bereits der Agar-Diffusionstest unter Verwendung von Cefoxitin-Blättchen eine deutlich höhere Sensitivität als bei Verwendung von Oxacillin- Blättchen [35]. Es gibt dazu eine Standardisierung bezüglich der Auswertung der Hemmhofdurchmesser entsprechend der break-points gemäß CLSI [35] und EUCAST [36]. Besonderheiten der Empfindlichkeitsprüfung von cmrsa des Multi-Locus-Sequenz-Typs ST80, der in Europa am häufigsten verbreitet ist: Bei cmrsa dieses Typs wird die Methicillinresistenz in vitro nur schwach und als Heteroresistenz ausgeprägt. So lag die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Oxacillin (Mikrobouillonverdünnungstest) für 27 von 37 Isolaten bei 2 mg/l, bei 10 Isolaten bei nur 1 mg/l. Damit würden diese cmrsa bei Interpretation der MHK nach dem DIN-Standard nur teilweise und nach CLSI (vormals NCCLS, [37]) überhaupt nicht erfasst. Wenn lediglich der Agardiffusionstest für die Empfindlichkeitsprüfung eingesetzt wird, dann würden cmrsa des Typs ST80 bei Durchführung nach dem DIN-Standard ebenfalls nicht erfasst werden, bei Durchführung nach dem CLSI-Standard würden Einzelkolonien im Hemmhof bei etwa einem Drittel der Isolate einen Hinweis auf Vorliegen von Oxacillinresistenz geben. Bei Verwendung von Cefoxitin-Testblättchen (30 µg) sowie Durchführung des Tests nach CLSI würden diese cmrsa ebenfalls als empfindlich bewertet; hier sollte die Interpretation unbedingt nach den Kriterien des skandinavischen Standards (SRGA; [36]) erfolgen (konfluenter Rasen; empfindlich: 29 mm; resistent: 29 mm). Aufgrund dieser Gegebenheiten ist für die phänotypische Empfindlichkeitsprüfung für die Detektion von MRSA das Mitführen von Screeningtests parallel zum Agardiffusionstest oder zur MHK-Bestimmung (manuell oder in Automatensystemen) unverzichtbar. Dabei ist für den Test unter Verwendung von Oxacillin-Kochsalzagar nach CLSI eine Bebrütung bis zu 48 h erforderlich! Bei Verwendung des Röhrchentests (38) oder von chromogenen Selektivmedien (die Konzentration von Cefoxitin darf hier nicht höher als 4 mg/l sein!) ergibt die Ablesung nach 24 h bereits ein verlässliches Ergebnis. Bei Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration für Cefoxitin mit dem Mikrobouillonverdünnungstest sollte 4 mg als resistent gelten! Infolge der Verwendung von Cefoxitin sind auch die nachstehend erörterten Selektivnährböden (auch als Fertigplatten verfügbar) potentiell hervorragend für Bestätigungstests geeignet. Die weite Verbreitung der MRSA-Epidemiestämme zwischen Krankenhäusern, Alten- und Pflegeeinrichtungen, seltener auch aus dem häuslichen Milieu heraus erfolgt durch Patienten, die mit MRSA besiedelt oder infiziert sind. Ein möglichst rechtzeitiges Erkennen einer MRSA-Besiedlung durch Screening-Abstriche (zumindest bezüglich des nasalen Trägertums sowie von Wunden, ekzematösen Hautbereichen, Ulcera cruris) ist Voraussetzung für das Wirksamwerden geeigneter Hygienemaßnahmen. Die konventionelle bakteriologische Diagnostik von MRSA mittels phänotypischer Methoden erfordert einen Zeitaufwand von zumindest 48 Stunden, der durch die Verwendung von Selektivnährböden, die eine gramnegative Begleitflora unterdrücken und spezifisch MRSA anzeigen, wenigstens halbiert werden kann. Die bisher verwandten, klassischen Selektivnährböden wie z. B. Mannit- Kochsalz-Agar oder Baird-Parker-Agar mit Zusatz von Oxacillin sind wegen des Problems der Hetero-Resistenz nur wenig für Screening-Untersuchungen geeignet. Dies ist deutlich anders bei den gegenwärtig neu eingeführten Selektivnährböden, die für den selektiven Nachweis der Methicillinresistenz Cefoxitin enthalten. Der Nachweis von S. aureus erfolgt über chromogene Substrate (z. B. für alkalische Phosphatase, α-glucosidase), die MRSAspezifischen Kolonien eine charakteristische Färbung verleihen. Des Weiteren enthalten diese Nährböden ein weiteres Antibiotikum (z. B. Polymyxin B) zum Unterdrücken gramnegativer Bakterien. Gegenwärtig werden folgende Selektivnährböden angeboten, die auf diesem Prinzip beruhen (aufgezählt in alphabetischer Reihenfolge der Hersteller): Becton-Dickinson: Chrom MRSA; Bio Merieux: MRSA-ID; BioRad: MRSA- Select; Mast-Diagnostika: Chromagar MRSA. Es gibt noch keine umfangreichen Vergleichsstudien bezüglich der Sensitivität und Spezifität der verschiedenen chromogenen Selektivnährmedien bei der Untersuchung von Nasenabstrichen sowie von klinischem Material. Neben sehr hoher Sensitivität und Spezifität führen auch molekulare, DNA-basierte Bestätigungstests für die Methicillinresistenz zur Zeitersparnis; sie beruhen zumeist auf einer PCR-Amplifikation des meca-gens [39]. Das klassische Verfahren mit Nachweis des Amplimers 222 MIKROBIOLOGE 15.Jg. 2005