NEWSLETTER PUFFER IN KULTURMILIEUS. und LUFTDRUCK GRUNDPRINZIPIEN

Transkript

1 PUFFER IN KULTURMILIEUS GRUNDPRINZIPIEN und LUFTDRUCK Zur Erreichung eines konstanten, gegenüber Säure- (H + ) oder Basenüberschüssen (OH - ) resistenten Säuregehalts in Salzlösungen werden Puffer eingesetzt. Gepufferte Lösungen bestehen aus einer schwachen Säure und ihrem konjugierten basischen Salz. QUALITY IN ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIE NEWSLETTER DEUTSCHE VERSION Bei den IVF-Kulturmilieus handelt es sich um NaHCO3 und H2CO3 oder, einfacher ausgedrückt, um Natriumhydrogencarbonat (konjugiertes Salz oder Base) und H2CO3, das nichts anderes ist als ein sich unter der Einwirkung des Umgebungsluftdrucks (auf Meereshöhe größer als in den Bergen) in Wasser auflösendes Kohlendioxid (CO2), so dass eine Säure (H2CO3) entsteht. In der Praxis bedeutet dies, dass 5 % CO2 in einem IVF-Labor auf Meereshöhe eine stärkere Treibwirkung (= stärkere Auflösung) entfalten als in einem Labor auf 1500 Metern Höhe, wo der Luftdruck geringer ist. In den Bergen wird daher aufgrund des tieferen Luftdrucks empfohlen, mit einem CO2- Anteil von über 5 % zu arbeiten. ph-wert und pka-wert Es wird allzu oft vergessen, dass der ph-wert eines Puffers zunächst von einer Konstante, nämlich der Säurekonstante (pka), abhängig ist und anschließend durch das Säure-Basen-Verhältnis in der Lösung beeinflusst wird. Genau darin besteht jedoch, wie die folgende Formel

2 zeigt, das Prinzip eines Puffers: eine geringe Veränderung des ph- Wertes bei der Änderung des Säure-Basen-Verhältnisses. ph = pka+ log10[(säure)/(base)] Oder einfacher ausgedrückt: Der ph-wert entspricht der Summe eines konstanten Wertes (pka) und des Verhältnisses zwischen der Säureund der Basenkonzentration oder in den IVF-Milieus zwischen dem CO2-Prozentanteil und der NaHCO3-Konzentration. Letztere wird in den Milieus häufig aus anderen Gründen konstant gehalten, etwa wegen des Ka + /Na + -Verhältnisses, der Osmolalität. Die entsprechenden physikalisch-chemischen Gleichungen finden sich in der Literatur unter der Bezeichnung Henderson-Hasselbalch. CO2 + H2O < = > H2CO3 < => HCO3 - + H + ph = pka + log10[(hco3-)/(h + )] 760 mmhg x 0,05 (also 38 mmhg). Im Labor auf einer Höhe von 2438 Metern beträgt der Luftdruck lediglich 568 mmhg, und der Teildruck von 5 % CO2 wäre somit 568 mmhg x 0,05 (also 28,4 mmhg), was einer Abnahme um 25 % entspricht. Diese Berechnung ermöglicht eine annähernde Anpassung für den im Labor auf 2438 Metern Höhe zu verwendenden CO2-Anteil: Man kann den CO2-Anteil um 25 % erhöhen und mit 5 x 1,25 (also 6,25 %) arbeiten. Die Kulturmilieus sind nicht einfach nur Lösungen aus Natron und Kohlensäure, sondern sie enthalten mehrere Salze wie Natrium-, Magnesium-, Kalium- und Calciumchloride, Phosphate sowie eine große Anzahl an Aminosäuren. Einfache Formeln zur ph-wert-berechnung sind nicht mehr anwendbar. Am besten ist es, den ph-wert mithilfe von Geräten zur Blutgasanalyse bei Neugeborenen zu messen. Es ist auch zu beachten, dass eine Verdünnung den ph-wert einer Pufferlösung nicht beeinflusst (das Säure-Basen-Verhältnis bleibt unverändert), sondern dass die Pufferkapazität der Lösung abnimmt, so dass der Puffer durch eine Verdünnung den Säure- und Baseneinwirkungen gegenüber weniger resistent wird. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass im vorliegenden Fall Kohlendioxid eingesetzt wird, gilt es, mit Teildruck zu arbeiten. Die Formel ist somit wie folgt abzuändern: ph = pka + log10[(hco3 - )/(0,03xpCO2)] Diese Formel zeigt, dass der ph-wert bei der Abnahme des CO2- Teildrucks mit steigender Höhe zunimmt. Da man weiß, dass die Luftdruckabnahme bei steigender Höhe nur gering ist, gilt es jedoch zu relativieren: Für eine Luftdruckabnahme um 50 % müsste man auf 5600 Meter steigen. Für die in einem IVF-Labor auf Meereshöhe bei einem Luftdruck von 760 mmhg eingesetzten 5 % CO2 beträgt der Teildruck M. Van den Bergh President Quartec GmbH

3 QUALITY IN ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIE NEWSLETTER Version Française TAMPON DES MILIEUX DE CULTURE et PRESSION ATMOSPHERIQUE PRINCIPES DE BASES Pour obtenir une acidité constante dans une solution saline qui résiste aux excès d acides (H + ) ou de bases (OH - ), nous faisons appel à des «tampons». Ces solutions tamponnées sont composées d un acide faible et d un sel basique conjugué. Dans les milieux de culture pour la F.I.V., il s agit de H2CO3 et NaHCO3. Ou, en terme simple, le bicarbonate de sodium (sel conjugué ou base) et le H2CO3 qui n est rien d autre que le dioxyde de carbone (CO2) qui se dissout sous l influence de la pression atmosphérique locale (plus élevée au niveau de la mer qu en altitude) dans l eau pour constituer un acide H2CO3. Ce qui veut dire en pratique que 5% de CO2 seront poussés plus fortement (= se dissoudre plus) dans un labo de F.I.V. situé en bord de mer que dans un labo se trouvant à 1500 m d altitude où la pression atmosphérique est plus basse. Donc, en montagne, comme la pression atmosphérique est plus basse, il est conseillé de travailler avec un pourcentage de CO2 supérieur à 5%. VALEUR ph et VALEUR pka On oublie trop souvent que la valeur du ph d un tampon est d abord dépendante d une constante : la constante d acidité (pka) et ensuite, est influencée par le rapport d acide et de base dans la solution. C est là tout le principe d un tampon : peu de changement dans le ph pour

4 un changement dans le rapport acide/base. Comme l indique la formule ci-dessous : ph = pka+ log10[(acide)/(base)] Ou, en mot simple, le ph est définit par la somme d une invariable (pka) et le rapport entre la concentration de l acide et de la base. Dans les milieux de culture pour la F.I.V., le pourcentage de CO2 et la concentration de NaHCO3 sont souvent gardés constants pour d autres raisons, comme le rapport K + / Na +, l osmolalité. Les équations physico-chimiques correspondantes se trouvent dans la littérature sous les noms de «Henderson-Hasselbach». CO2 + H2O < = > H2CO3 < => HCO3 - + H + une altitude de 8000 pieds ou 2438 m, la pression atmosphérique sera seulement de 568 mmhg et la pression partielle de 5% de CO2 sera donc de 568mmHg x 0.05 = 28.4 mmhg, soit une réduction de 25%. Ce dernier calcul permet de faire une correction approximative pour le % de CO2 à utiliser pour le labo à 8000 pieds d altitude. On peut augmenter de 25% le CO2 et donc travailler à 5 x 1.25 = 6.25 %. Les milieux de culture sont plus qu une solution de bicarbonate de soude et du gaz carbonique, elles contiennent plusieurs sels comme des chlorures de Sodium, Magnésium, Potassium et Calcium des phosphates et un grand nombre d acides aminés et les formules simples pour le calcul du ph ne sont plus applicables. La meilleure chose à faire, est de mesurer le ph de préférence au moyen d appareils pour l analyse des gazes sanguins chez les nouveau-nés. Retenez aussi, qu en diluant une solution tampon, vous n influencez pas le ph car le rapport acide/ base reste inchangé. Sa capacité tamponneuse diminuera. Donc, en diluant un tampon, il sera moins résistant aux influences acides ou basiques. ph = pka + log10[(hco3 - )/(H+)] Comme nous utilisons du dioxyde de carbone, il faut travailler avec la pression partielle et changer la formule comme ci-dessous : ph = pka + log10[(hco3-)/(0.03xpco2)] Dans cette dernière formule, on voit qu avec l élévation en altitude, la pression partielle du CO2 diminue et la valeur du ph augmente. Il faut néanmoins relativiser les choses en sachant que la pression atmosphérique diminue peu avec l altitude, il faut monter à 5600 m pour obtenir une réduction de 50%. Pour les 5 % de CO2, la pression partielle au niveau de la mer ou la pression atmosphérique de 760mmHg sera de 760mmHg x 0.05 = 38 mmhg. Pour le laboratoire à M. Van den Bergh Directeur Quartec GmbH

5 BUFFERS OF CULTURE MEDIA AND ALTITUDE BASIC PRINCIPLES QUALITY IN ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIE NEWSLETTER It is commonly said that with increasing altitude the percentage of CO2 used to equilibrate the IVF culture media must be adapted. However it is never said how much altitude does affect the ph of those media. Buffers maintain the ph constant by resisting against an acid or a basic overload. Buffers are composed by a weak acid and its conjugated alkaline salt. For IVF culture media we are combining Sodium bicarbonate and the hypothetical acid H2CO3. This acid is nothing else than the CO2 dissolved in the aqueous culture medium solution. The atmospheric pressure - higher at sea level then in the mountainspushes/ dissolves the 5 % CO2 better into the solution at sea level. ENGLISH VERSION ph-value and pka- VALUE A ph value of a buffer solution is defined by 2 components: the acidity constant and the ratio between acid and base. In simple words ph is the sum of a fixed value and a variable. Because the pka is a fixed value, changes in buffers occur only when there is a change in the ratio between acid and base as seen from the formula beneath. ph = pka+ log10[(acide)/(base)]

6 The equation describing the equilibrium when CO2 dissolves in water is called the Henderson-Hasselbalch equation. The concentration of NaHCO3 - is nearly the same in all IVF media and more or less kept constant to respect, de ratio between K + and Na+ and the maintain the adequate Osmolality. CO2 + H2O < = > H2CO3 < => HCO3 - + H + values in the formula and taking a bicarbonate concentration of about 30 mm, the ph would be 0.02 units higher at 2438 m. The simplest approach to compensate this rise would be an increase of 25% of the percentage CO2 to 6.25 %. IVF culture media are complex solutions containing Sodium, Potassium, Magnesium and Calcium-chlorines and phosphates besides many amino acids. Those simple equations mentioned above are therefore no longer valid. The best way to see if the correct ph value has been reached after full equilibration is to use a blood gas analyser for neonates. ph = pka + log10[(hco3 - )/(H + )] Keep in mind that by diluting a buffer the ratio between acid and base is not affected and the ph value remains unchanged, however the buffer capacity or the strength to resist acid or alkaline overload is diminished. To calculate the real influence of the altitude on the ph value we have to replace the H + concentration by the partial gas pressure of CO2. The calculation of the ph can then be written as: ph = pka + log10[(hco3-)/(0.03xpco2)] From this transcription it is clearly seen that with decreasing partial gas pressure due to increasing altitude, the ph value will rise. To fall back to 50% of the initial atmospheric pressure an increase of 5600 meter is needed. The IVF lab using 5 % CO2 at sea level works with a partial pressure of 760 mmhg x 0.05 or 38mmHg, the one at 2438m where the atmospheric pressure is 568mmHg uses 568mmHg x 0.05 or 28.4 mmhg, a reduction of 25% in partial gas pressure. By replacing those M. Van den Bergh President Quartec GmbH Cerified Senior Clinical Embryologist