Nachweis und Bewertung von freien Aminosäuren in Geflügelfleisch während der Reifung - Auswirkungen auf die Qualität daraus hergestellter Produkte

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1 Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover Nachweis und Bewertung von freien Aminosäuren in Geflügelfleisch während der Reifung - Auswirkungen auf die Qualität daraus hergestellter Produkte INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Helga Nagengast aus Tettnang Hannover 26

2 Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz Dr. M. Kühne 1. Gutachter: Priv.-Doz Dr. M. Kühne 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. C. Gissel Tag der mündlichen Prüfung: Die Arbeit wurde aus Mitteln der Fritz-Ahrberg-Stiftung gefördert.

3 Für Heiko und unseren Sohn Luke

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literaturübersicht Fleisch Morphologie des Skelettmuskels Biochemische Funktion des Skelettmuskels Chemische Zusammensetzung des Fleisches Fleischbeschaffenheitsmerkmale ph-wert Wasserbindungsvermögen Wasser-Eiweiß-Verhältnis Proteinhydrolysate Fleischreifung Glykogenolyse Enzymatische Vorgänge Mikrobielle Faktoren Verderbniskeime Einfluss der Verpackung Aminosäuren Aufbau und Einteilung Stoffwechsel der Aminosäuren Bestimmung der Aminosäuren Methoden der Probenaufarbeitung Ionenaustauschchromatographie Einzelne Aminosäuren Alanin Arginin Asparaginsäure Glutaminsäure... 4

6 Glycin Isoleucin Leucin Lysin Serin Threonin Tyrosin Valin Anteil der Aminosäuren an der Aromabildung von Fleisch Glutamat Freie Aminosäuren Freie Aminosäuren in Geflügelfleisch Einfluss der Lagerung Einfluss der Herkunft Einfluss der Fütterung, der Rasse und des Alters Freie Aminosäuren in Schweinefleisch Freie Aminosäuren in Rindfleisch Einfluss der Mikroorganismen Untersuchungen von Dripwasser Zusammenfassende Auswertung des wissenschaftlichen Schrifttums Eigene Untersuchungen Versuchsaufbau Erster Untersuchungsabschnitt - Reifung Zweiter Untersuchungsabschnitt - Lagerung der Zubereitungen Material und Methoden Masthähnchen Schlachtung der Masthähnchen Reifung der Schlachtierkörper Zerlegung der Schlachtierkörper Transport der Brustfilets... 4

7 3.2.6 Einfrieren der Brustfilets Herstellung der Zubereitungen Untersuchungsmethoden Biochemische Untersuchungen Bestimmung der Gesamtaminosäuren Bestimmung der freien Aminosäuren Physikalisch-chemische Untersuchungen Bestimmung des Rohprotein-Gehaltes Bestimmung des Nicht Protein-Stickstoff-Gehaltes Bestimmung des Trockensubstanz-Gehaltes Bestimmung der auspressbaren Gewebeflüssigkeit Bestimmung des Wasser-Eiweiß-Verhältnisses Messung des ph-wertes der Brustmuskulatur Mikrobiologische Untersuchungen Aerobe Gesamtkeimzahl Enterobacteriaceen Pseudomonaden Laktobazillen Anaerobe Gesamtkeimzahl Brochothrix thermosphacta Statistische Auswertung Laborgeräte und Chemikalien Ergebnisse Ergebnisse des ersten Untersuchungsabschnittes - Reifung Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen Gesamtaminosäuren Freie Aminosäuren Ergebnisse der physikalisch-chemischen Untersuchungen Rohprotein Nicht Protein-Stickstoff... 4

8 Trockensubstanz Wasser-Eiweiß-Verhältnis Bestimmung des auspressbaren Gewebewassers ph-wert Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen Aerobe Gesamtkeimzahl Enterobacteriaceen Pseudomonaden Laktobazillen Ergebnisse des zweiten Untersuchungsabschnittes - Lagerung der Zubereitungen Ergebnisse der Untersuchungen der Geflügelfleisch-Zubereitungen Biochemische Untersuchungen Threonin Glutaminsäure Glycin Alanin Valin Leucin Isoleucin Tyrosin Lysin Serin Asparaginsäure Harnstoff Ergebnisse der physikalisch-chemischen Untersuchungen Rohprotein Nicht Protein-Stickstoff Trockensubstanz Bestimmung des auspressbaren Gewebewassers Wasser-Eiweiß-Verhältnis... 4

9 ph-wert Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen Aerobe Gesamtkeimzahl Anaerobe Gesamtkeimzahl Enterobacteriaceen Pseudomonaden Laktobazillen Brochothrix thermosphacta Ergebnisse der Untersuchungen des Dripwassers Biochemische Untersuchungen Ergebnisse der chemischen Untersuchungen Ergebnisse der Untersuchungen der Gewürzmischung Ergebnisse der biochemische Untersuchungen Ergebnisse der chemischen Untersuchungen Diskussion Diskussion von Material und Methode Diskussion der Ergebnisse Erster Untersuchungsabschnitt - Reifung Gesamtaminosäuren Freie Aminosäuren Physikalisch-chemische Untersuchungen Mikrobiologische Untersuchungen Zweiter Untersuchungsabschnitt - Lagerung der Zubereitungen Freie Aminosäuren Physikalisch-chemische Untersuchungen Mikrobiologische Untersuchungen Dripwasser-Untersuchungen Zusammenfassung Summary... 4

10 8 Literaturverzeichnis Anhang p-werte der Untersuchungen auf freie Aminosäuren p-werte der mikrobiologischen Untersuchungsergebnisse p-werte der physikalisch-chemischen Untersuchungsergebnisse Danksagung... 4

11 Abbildungsverzeichnis Abbildung 2-1: Allgemeine Strukturformel... 4 Abbildung 2-2: Strukturformel Alanin... 4 Abbildung 2-3: Strukturformel Arginin... 4 Abbildung 2-4: Strukturformel Asparaginsäure... 4 Abbildung 2-5: Strukturformel Glutaminsäure... 4 Abbildung 2-6: Strukturformel Glycin... 4 Abbildung 2-7: Strukturformel Isoleucin... 4 Abbildung 2-8: Strukturformel Leucin... 4 Abbildung 2-9: Strukturformel Lysin... 4 Abbildung 2-1: Strukturformel Serin... 4 Abbildung 2-11: Strukturformel Threonin... 4 Abbildung 2-12: Strukturformel Tyrosin... 4 Abbildung 2-13: Strukturformel Valin... 4 Abbildung 3-1: Untersuchungsaufbau: Erster Untersuchungsabschnitt - Reifung... 4 Abbildung 3-2: Untersuchungsaufbau: Zweiter Untersuchungsabschnitt - Lager-... ung der Zubereitungen... 4 Abbildung 3-3: Chromatogramm des Standards... 4 Abbildung 4-1: Summe der Gesamtaminosäuren im Verlauf der Reifung... 4 Abbildung 4-2: Konzentrationen einzelner Gesamtaminosäuren im Verlauf der... Reifung (THR, SER, GLY, VAL, ILEU, TYR, ARG)... 4 Abbildung 4-3: Konzentrationen einzelner Gesamtaminosäuren im Verlauf der... Reifung (ASP, GLU, ALA, LEU, LYS, HS)... 4 Abbildung 4-4: Summe der freien Aminosäuren im Verlauf der Reifung... 4 Abbildung 4-5: Konzentrationen einzelner freier Aminosäuren im Verlauf der... Reifung (GLU, GLY, VAL, ARG, HS)... 4 Abbildung 4-6: Konzentrationen einzelner freier Aminosäuren im Verlauf der... Reifung (THR, SER, LEU, TYR, ASP)... 4

12 Abbildung 4-7: Verlauf des Nicht Protein-Stickstoff-Gehaltes während der Reifung... 4 Abbildung 4-8: Verlauf des ph-wertes während der Reifung... 4 Abbildung 4-9: Verlauf der aeroben Gesamtkeimzahl während der Reifung... 4 Abbildung 4-1: Verlauf der Enterobacteriaceen-Keimzahl während der Reifung... 4 Abbildung 4-11: Verlauf der Pseudomonaden-Keimzahl während der Reifung... 4 Abbildung 4-12: Verlauf der Laktobazillen-Keimzahl während der Reifung... 4 Abbildung 4-13: Summe der freien Aminosäuren, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-14: Summe der freien Aminosäuren, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-15: Summe der freien Aminosäuren, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-16: Summe der freien Aminosäuren, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-17: Summe der freien Aminosäuren, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-18: Threonin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-19: Threonin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-2: Threonin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-21: Threonin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-22: Threonin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-23: Glutaminsäure, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-24: Glutaminsäure, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-25: Glutaminsäure, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-26: Glutaminsäure, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-27: Glutaminsäure, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-28: Glycin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-29: Glycin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-3: Glycin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-31: Glycin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-32: Glycin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-33: Alanin, Reifungsgruppe I... 4

13 Abbildung 4-34: Alanin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-35: Alanin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-36: Alanin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-37: Alanin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-38: Valin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-39: Valin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-4: Valin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-41: Valin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-42: Valin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-43: Leucin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-44: Leucin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-45: Leucin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-46: Leucin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-47: Leucin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-48: Isoleucin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-49: Isoleucin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-5: Isoleucin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-51: Isoleucin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-52: Isoleucin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-53: Tyrosin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-54: Tyrosin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-55: Tyrosin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-56: Tyrosin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-57: Tyrosin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-58: Lysin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-59: Lysin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-6: Lysin, Reifungsgruppe III... 4

14 Abbildung 4-61: Lysin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-62: Lysin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-63: Serin, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-64: Serin, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-65: Serin, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-66: Serin, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-67: Serin, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-68: Asparaginsäure, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-69: Asparaginsäure, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-7: Asparaginsäure, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-71: Asparaginsäure, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-72: Asparaginsäure, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-73: Harnstoff, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-74: Harnstoff, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-75: Harnstoff, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-76: Harnstoff, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-77: Harnstoff, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-78: Aerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-79: Aerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-8: Aerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-81: Aerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-82: Aerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-83: Anaerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-84: Anaerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-85: Anaerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-86: Anaerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-87: Anaerobe Gesamtkeimzahl, Reifungsgruppe V... 4

15 Abbildung 4-88: Enterobacteriaceen, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-89: Enterobacteriaceen, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-9: Enterobacteriaceen, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-91: Enterobacteriaceen, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-92: Enterobacteriaceen, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-93: Pseudomonaden, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-94: Pseudomonaden, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-95: Pseudomonaden, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-96: Pseudomonaden, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-97: Pseudomonaden, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-98: Laktobazillen, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-99: Laktobazillen, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-1: Laktobazillen, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-11: Laktobazillen, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-12: Laktobazillen, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-13: Brochothrix thermosphacta, Reifungsgruppe I... 4 Abbildung 4-14: Brochothrix thermosphacta, Reifungsgruppe II... 4 Abbildung 4-15: Brochothrix thermosphacta, Reifungsgruppe III... 4 Abbildung 4-16: Brochothrix thermosphacta, Reifungsgruppe IV... 4 Abbildung 4-17: Brochothrix thermosphacta, Reifungsgruppe V... 4 Abbildung 4-18: Summe der freien Aminosäuren des Dripwassers... 4 Abbildung 4-19: Konzentrationen einzelner freier Aminosäuren des Dripwassers... (ASP, THR, SER, VAL, ILEU, LEU)... 4 Abbildung 4-11: Konzentrationen einzelner freier Aminosäuren des Dripwassers... (GLU, TYR, GLY, LYS, ALA, HS, ARG)... 4

16 Tabellenverzeichnis Tabelle 2-1: Geschmack einiger Aminosäuren (nach BELITZ u. GROSCH 1987)... 4 Tabelle 2-2: Freie Aminosäuren in Brustfleisch von Masthähnchen bei... unterschiedlichen Lagerungsbedingungen in mg/1g (nach MILLER , TANABE et al. 199)... 4 Tabelle 2-3 : Freie Aminosäuren in Brustmuskulatur von Hähnchen... unterschiedlicher Herkunft in mg/1g (nach TIMMERMANN 1995)... 4 Tabelle 2-4 : Freie Aminosäuren in Schweinefleisch unterschiedlicher... Reifungsdauer in mg/1 g (nach PFUHL 1999)... 4 Tabelle 3-1: Nachweisgrenzen einzelner Aminosäuren in µg/1g... 4 Tabelle 4-1: Verlauf des Rohprotein-Gehaltes während der Reifung... 4 Tabelle 4-2: Verlauf des Trockensubstanz-Anteils während der Reifung... 4 Tabelle 4-3: Verlauf des Wasser-Eiweiß-Verhältnisses während der Reifung... 4 Tabelle 4-4: Verlauf des auspressbaren Gewebewassers während der Reifung... 4 Tabelle 4-5: Rohprotein-Gehalte der Geflügelfleisch-Zubereitungen... 4 Tabelle 4-6: Nicht Protein-Stickstoff-Gehalte der Geflügelfleisch-Zubereitungen... 4 Tabelle 4-7: Trockensubstanz-Gehalte der Geflügelfleisch-Zubereitungen... 4 Tabelle 4-8: Auspressbares Gewebewasser der Geflügelfleisch-Zubereitungen... 4 Tabelle 4-9: Federzahlen der Geflügelfleisch-Zubereitungen... 4 Tabelle 4-1: ph-werte der Zubereitungen... 4 Tabelle 4-11: Konzentrationen freier Aminosäuren der Gewürzmischung... in mg/1g... 4 Tabelle 9-1: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freie Asparaginsäure... 4 Tabelle 9-2: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Threonin... 4 Tabelle 9-3: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Serin... 4 Tabelle 9-4: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freie Glutaminsäure... 4 Tabelle 9-5: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Glycin... 4 Tabelle 9-6: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Alanin... 4

17 Tabelle 9-7: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Valin... 4 Tabelle 9-8: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Isoleucin... 4 Tabelle 9-9: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Leucin... 4 Tabelle 9-1: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Tyrosin... 4 Tabelle 9-11: p-werte der Untersuchungsergebnisse: freies Lysin... 4 Tabelle 9-12: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Harnstoff... 4 Tabelle 9-13: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Aerobe Gesamtkeimzahl... 4 Tabelle 9-14: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Anaerobe Gesamtkeimzahl... 4 Tabelle 9-15: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Pseudomonaden... 4 Tabelle 9-16: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Laktobazillen... 4 Tabelle 9-17: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Enterobacteriaceen... 4 Tabelle 9-18: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Brochothrix thermosphacta... 4 Tabelle 9-19: p-werte der Untersuchungsergebnisse:... Nicht Protein-Stickstoff-Gehalt... 4 Tabelle 9-2: p-werte der Untersuchungsergebnisse: ph-wert... 4 Tabelle 9-21: p-werte der Untersuchungsergebnisse: Rohprotein-Gehalt... 4

18 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung C Grad Celsius ADP Adenosindiphosphat ALA Alanin AMP Adenosinmonophosphat ARG Arginin ASP Asparaginsäure ATP Adenosintriphosphat ATPase Adenosintriphosphatase DFD dark, firm, dry (dunkel, fest, trocken) et al. et alii (und andere) g Gramm GKZ Gesamtkeimzahl GLU Glutaminsäure GLY Glycin Gruppe A Geflügelfleischzubereitungen ohne Gewürzzugabe Gruppe B Geflügelfleischzubereitungen mit Gewürzzugabe h Stunden HPLC High Pressure Liquid Chromatography Hrsg. Herausgeber HS Harnstoff I. E. Internationale Einheiten ILEU Isoleucin KbE/g Koloniebildende Einheiten pro Gramm kg Kilogramm l Liter LEU Leucin LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch lg Logarithmus zur Basis 1 LT Lagerungstag LYS Lysin

19 M. Musculus min. Minute N Stickstoff Nm Nanometer NPN Nicht Protein-Stickstoff-Verbindung p Signifikanzniveau p. m. post mortem PSE pale, soft, exudative (blass, weich, wässrig) RG Reifungsgruppe SAS Statistics Analysis System SDSPAG Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gradient SER Serin spp. Spezies Tab. Tabelle THR Threonin TNC Troponin-C TNI Troponin-I TNT Troponin-T TYR Tyrosin VAL Valin

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21 1 Einleitung 21 1 Einleitung Der Geflügelfleischverbrauch hat in den vergangenen Jahren in Deutschland stetig zugenommen. Der Pro-Kopf-Verbrauch lag im Jahr 25 bei ca. 1,8 kg, wobei frische Geflügelfleischteile und Geflügelfleisch-Zubereitungen immer beliebter werden. Zubereitungen sind küchenfertige Lebensmittel, die unter Verwendung verschiedener Zusatzstoffe industriell hergestellt werden. Sie zeichnen sich durch ihre einfache Handhabung und geschmackliche Vielfalt aus (ZMP 25, FEHLHABER 21 c). Zur Deckung des Inlandkonsums ist Deutschland auf Importe angewiesen. Im Jahr 23 importierte Deutschland insgesamt 484. Tonnen Geflügelfleisch aus Drittländern. Es wird sowohl frisches als auch gefrorenes Geflügelfleisch importiert. Gefrorenes Fleisch wird häufig aufgetaut und für die Herstellung von Zubereitungen oder Erzeugnisse verwendet (ZMP 24). Geflügelfleisch weist im Gegensatz zu Fleisch anderer Tierarten ein wenig ausgeprägtes Fleischaroma auf. Freie Aminosäuren sind maßgeblich an der Aromabildung beteiligt. Für die Herstellung von Geflügelfleisch-Erzeugnissen sind die Gehalte der freien Aminosäuren daher von Interesse. Ziel der vorliegenden Studie war es, diese immer mehr an Bedeutung gewinnenden Lebensmittel während ihrer Reifung bzw. Lagerung auf verschiedene Parameter zu untersuchen und die postmortalen Prozesse weiter zu charakterisieren. Ein besonderes Augenmerk galt der Entwicklung von freien Aminosäuren.

22 22 2 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Fleisch Der Begriff Fleisch wird im allgemeinen Sprachgebrauch als Synonym für Teile der Skelettmuskulatur warmblütiger Schlacht- oder Wildtiere verwendet (BEUTLING 1992) Morphologie des Skelettmuskels Ein Skelettmuskel, außen von einem festen Bindegewebe, dem Epimysium, umgeben, setzt sich aus Muskelfaserbündeln zusammen. Die einzelnen Bündel werden vom Perimysium umgeben und bestehen aus Muskelzellen (SZENTKUTI 2). Die Skelettmuskelzelle ist eine Faser von rund 1 µm - 1 µm Durchmesser und bis zu 2 cm Länge. Die Zellmembran der Muskelfaser(-zelle) heißt Sarkolemm und umschließt außer den Myofibrillen das Sarkoplasma (Zytoplasma), mehrere Zellkerne, Mitochondrien (Sarkosomen), Lysosomen, Fetttröpfchen, Glykogenkörnchen u. a. Einschlüsse. Im Sarkoplasma sind Glykogen, Myoglobin, glykolytische Enzyme, Kreatinphosphat, Aminosäuren u. v. a. Substanzen gelöst. Eine Muskelfaser enthält einige hundert Myofibrillen, von denen jede durch sog. Z-Scheiben in ca. 2 µm lange Fächer, Sarkomere, unterteilt ist. Die Sarkomere einer Myofibrille lassen bei mikroskopischer Betrachtung abwechselnd helle und dunkle Bänder und Linien erkennen, die durch die Anordnung der dicken Myosin- und dünnen Aktinfilamente verursacht werden (SILBERNAGEL 1991). Jedes Sarkomer besteht aus der Hälfte zweier I-Banden und einem zentralen A-Band. Das A-Band enthält eine weniger dichte zentrale H-Zone, in der sich Myosin- und Aktinfilamente nicht überlappen. Die H-Zone ist unterteilt durch eine dunkle M-Linie, die Myomesin enthält (RÜEGG 1987). Das Myosinmolekül besitzt einen zweigeteilten Kopf, der die ATPase enthält. Der Kopf ist gelenkartig mit einem Halsstück verbunden, an das sich wiederum gelenkartig verbunden, das Schwanzstück anschließt. Die gelenkartige Beweglichkeit des Kopf-Hals-Stückes ermöglicht die reversible Bindung des Myosins an das Aktin und

23 2 Literaturübersicht 23 das Ineinandergleiten der Aktin- und Myosinfilamente. Aktin ist ein globuläres Proteinmolekül, von dem jeweils 4 eine perlschnurartige Kette bilden. Jeweils zwei solcher Ketten bilden das Aktinfilament. Das ebenfalls fadenförmige Tropomyosin windet sich um das Aktinfilament, wobei etwa alle 4 nm ein Troponinmolekül angeheftet ist. Troponin besteht aus drei Untereinheiten. Die erste ist das Troponin-C (TnC), welches Calcium bindet, die zweite das Troponin-T (TnT), das das Troponin mit dem Tropomyosin verbindet und die dritte das Troponin-I (TnI), das die Bindung zwischen Aktin und Myosin hemmt (SILBERNAGEL 1991). Der Muskel wird durch einen elektrischen Impuls, der über die Nerven transportiert wird, stimuliert. Die elektrische Reizung breitet sich über die Transversaltubuli aus, die in Höhe der Z-Scheibe einer Myofibrille in die Muskelzelle hineinreichen. Von diesen Transversal-Tubuli wird das elektrische Signal auf das sarkoplasmatische Retikulum übertragen. Die Folge ist eine Calcium-Ausschüttung aus dem Lumen des sarkoplasmatischen Retikulums. Die Calcium-Ausschüttung leitet dann die Kontraktion der benachbarten Myofibrillen ein. Die rasche Reizausbreitung führt dazu, dass alle Myofibrillen der Zelle gleichzeitig kontrahieren. Die freien Calciumionen verändern die räumliche Struktur des Troponinkomplexes und aktivieren den kontraktilen Apparat (TERNES 1994) Biochemische Funktion des Skelettmuskels Der Muskel verbraucht für seine Tätigkeit Energie, die im Muskel aus Glykogen gewonnen wird. Es wird im Sarkoplasma zu Glukose gespalten und auf anaerobem Weg zu Brenztraubensäure (Pyruvat) abgebaut. Dieser Schritt erzeugt 2 Mol Adenosintriphosphat (ATP), den Energieüberträger des Stoffwechsels. Im Zitratzyklus und in der Atmungskette wird die Brenztraubensäure zu Kohlendioxid und Wasser abgebaut. Dabei werden pro Mol Glukose 38 Mol ATP erzeugt. Der aerobe Reaktionsmechanismus liefert viel Energie, läuft im Gegensatz zum anaeroben Weg jedoch langsam ab. Bei erhöhtem Energiebedarf in vivo und im postmortalen Skelettmuskel wird die Energie anaerob gebildet. Auf diesem Weg wird das Glykogen nach der Glykogenolyse zu Milchsäure abgebaut. Die ATP-Ausbeute liegt bei 3 ATP pro Molekül Gluko-

24 24 2 Literaturübersicht se. Ein kurzfristiger Energiespeicher ist das Kreatinphosphat. Es bindet Phosphatgruppen, die im Bedarfsfall auf Adenosindiphosphat (ADP) übertragen werden und ATP liefern. Der Sauerstoffspeicher im Muskel ist das Myoglobin (LEHNINGER 1994, LOEFFLER 197) Chemische Zusammensetzung des Fleisches Die Zusammensetzung des Fleisches variiert bei verschiedenen Tierarten, aber auch zwischen einzelnen Teilstücken. Durchschnittlich gelten folgende Richtwerte für fettarmes Fleisch: 76 % Wasser, 22 % Stickstoffsubstanzen (Peptide, Aminosäuren, Amine, Amide, Nukleoside, Nukleotide, Purinderivate, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff, Ammoniak), 1 % Mineralstoffe und max.,5 % Kohlenhydrate (Glykogen). Fett variiert in weiten Grenzen und kann beim Geflügel 1 % - 15 % ausmachen (RÖMPP 1995, LOEFFLER 197). Nach SOUCI (2) liegt der Proteingehalt beim Hähnchenbrustfilet mit Haut im Mittel bei 22,8 %. Der Wasser-Anteil liegt bei 7,4 %, Fett bei 6,2 % und Asche bei 1,25 %. Proteine kann man aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften in drei Gruppen einteilen: 1. Skleroproteine Sie sind wasserunlöslich, besitzen Faserstruktur und dienen als Stütz- und Gerüstsubstanzen. In Faserrichtung weisen sie eine hohe molekulare Ordnung auf. Ihre wichtigsten Vertreter sind Kollagen, Kreatin und Myosin. 2. Globuläre Proteine oder Sphäroproteine Sie sind in Wasser oder verdünnten Salzlösungen löslich, ihre Moleküle sind sphärisch, wenn auch unregelmäßig gestaltet. Hierzu gehören Albumine und Globuline. 3. Protein-Komplexe Sie setzen sich aus einem Proteinanteil und anderen Bausteinen zusammen. Man unterscheidet Glykoproteine, Lipoproteine, Phospoproteine und Metalloproteine (KARLSON 1988).

25 2 Literaturübersicht 25 Die Eiweißbestimmung erfolgt in der Lebensmittelanalytik anhand des in allen Aminosäuren enthaltenen Stickstoffs. Der Stickstoffanteil von Proteinen liegt im Mittel bei 16 % (OHLROGGE 21). Multipliziert man den Stickstoffgehalt mit 6,25, so ergibt sich daraus der Gehalt des Lebensmittels an Rohprotein. Bei dieser Vorgehensweise werden neben den fleischeigenen Proteinen auch Fremdeiweiße, (z. B. Milcheiweiß) und Nicht Protein-Stickstoff-Verbindungen (NPN) mit erfasst (OHLROGGE 21, HAUSER 1999). Zu den NPN-Substanzen im Fleisch zählen u. a. freie Aminosäuren, Peptide, Kreatinin, Ammoniak und Harnstoff. Sie täuschen in Fleischerzeugnissen einen höheren Proteingehalt vor (OHLROGGE 21). KIJOWSKI (1984) bestimmte den NPN-Gehalt in Broilerbrustfleisch. Er fand heraus, dass nach 24 h post mortem der NPN-Gehalt von 2,65 % auf 3,6 % anstieg. Nach SCHOLTYSSEK (1987) besteht beim Huhn etwa 71 % - 73 % der fettfreien Körpersubstanz aus Wasser. Das entspricht je nach Fettanteil einem Wassergehalt von ca. 6 %. Im Muskelfleisch liegt das Wasser zum überwiegenden Teil als freies Wasser vor. Ungefähr 5 % des Wassers liegt als an Eiweiß gebundenes Wasser vor (PRÄNDL 1988) Fleischbeschaffenheitsmerkmale Zu den Fleischbeschaffenheitsmerkmalen zählen unter anderem der ph-wert und das Wasserbindungsvermögen. Außerdem ist das Wasser-Eiweiß-Verhältnis in der Geflügelfleischverarbeitung ein wichtiger Parameter ph-wert Der ph-wert, der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen- Konzentration, ist eine der zentralen Parameter bei der Bestimmung der Fleischqualität. Durch die Bildung von Milchsäure im Muskel während der Fleischreifung zeigt der ph-wert einen charakteristischen Verlauf post mortem (KALLWEIT 1988). NIEWIAROWICZ et al. (1978, 1979) ermittelten bei Broilern in der Brustmuskulatur 15 min. post mortem drei ph-bereiche, die Ausdruck für die unterschiedliche Fleischbeschaffenheit sind. Ein ph 1 -Wert 5,7 (ph 1 = 15 bzw. 5 min. p. m.) charakterisiert eine überstürzte postmortale Glykolyse und damit verbunden häufig eine

26 26 2 Literaturübersicht abweichende Fleischbeschaffenheit (PSE = pale, soft, exudativ), ein ph 1 -Wert von 5,8 bis 6,3 eine normale Fleischbeschaffenheit und ein ph 1 -Wert 6,4 eine DFD- Kondition (dark, firm, dry). RISTIC et al. (1977, 1978) sowie SCHÖN und RISTIC (1977) charakterisierten Anfangs ph-werte in der Brustmuskulatur, die unter 5,8 liegen, eine beschleunigte, über 6, eine normale und über 6,2 eine verlangsamte Glykolyse. Im bekannten Schrifttum wurde der End-pH-Wert von reifendem Geflügelfleisch in der Regel 24 h post mortem gemessen und lag zwischen 5,51 und 5,86 (LEE et al. 1979, STEWART et al. 1981, SAMS et al. 199) Wasserbindungsvermögen Unter dem Wasserbindungsvermögen wird die Fähigkeit des Fleisches verstanden, eigenes und zugesetztes Wasser festzuhalten (HAMM 1972, PRÄNDL et al. 1988). DODGE und STADELMAN (196) sowie SCHOLTYSSEK et al. (1967, 1968) bezweifeln einen Zusammenhang zwischen Wasserbindungsvermögen und Fleischqualität von Geflügelfleisch. HAMM (1972) hingegen sieht das ungebundene Gewebewasser als ein wichtiges Merkmal der Fleischqualität an. Er bezieht sich auf die Annahme von HANSON und HUXLEY (1955), dass die Zartheit des gekochten Fleisches mit zunehmender Sarkomerenlänge der Myofibrillen, das ist die Strecke von Z-Linie zu Z-Linie im Feinbau der quergestreiften Muskelfasern, zunimmt. Da laut HAMM (1972) mit zunehmender Sarkomerenlänge das Muskelgewebe gleichzeitig in die Lage versetzt wird, Wasser im immobilisierten Zustand aufzunehmen, besteht für ihn eine positive Korrelation zwischen Fleischqualität und Wasserbindungsvermögen. RISTIC (1977) beobachtete, dass das Safthaltevermögen der Brustmuskulatur vorwiegend von der Lagerdauer abhängig ist Wasser-Eiweiß-Verhältnis Bei der industriellen Geflügelschlachtung kommt es prozessbedingt zu einer Wasseraufnahme der Geflügelschlachttierkörper während des Brühens, der Eviszeration und den nachfolgenden Reinigungsschritten. Außerdem können unterschiedliche Kühlverfahren zu einer weiteren Wasseraufnahme führen. Dieses so genannte Fremdwasser wird in der Haut und zu einem geringen Anteil in der Muskulatur ge-

27 2 Literaturübersicht 27 bunden oder in der Leibeshöhle eingelagert. Eine Folge der Wassereinlagerungen ist ein flüssigkeitsbedingter Gewichtsanstieg der Geflügelschlachttierkörper. Um Wettbewerbsverzerrungen zu vermeiden und den Verbraucher vor möglicher Irreführung zu schützen, muss die Wasseraufnahme im Rahmen betrieblicher Eigenkontrollen geprüft werden und sich im Rahmen gesetzlich vorgegebener Werte bewegen (DILDEI u. KÜHNE 25, VO 1538/91 EWG). Zur Prüfung dieser Wasseraufnahme wird die Federzahl verwendet. Diese beruht auf der Tatsache, dass rohes Fleisch ein relativ konstantes Verhältnis zwischen Rohprotein und dem fleischeigenen Wassergehalt aufweist. Dieses Verhältnis zwischen Wasser und Rohprotein beträgt bei luftgekühlten Hähnchenbrustfilets ohne Haut im Mittel 3,2 (2,9-3,4) (OHLROGGE 21) Proteinhydrolysate Proteinhydrolysate werden durch Spaltung von tierischen oder pflanzlichen Eiweißen gewonnen. Dabei entstehen kürzere Eiweißketten und Aminosäuren. Von der Lebensmittelindustrie werden Proteinhydrolysate hauptsächlich verwendet zur Beeinflussung von Geschmack und Aromen, aber auch zur Verbesserung von Lebensmittel-Oberflächen, des Wasserbindungsvermögens und zur Optimierung der ernährungsphysiologischen Eigenschaften. Proteinhydrolysate kommen beispielsweise in Gewürzen, Süßwaren, Molkereiprodukten und in Sportlernahrung zum Einsatz. Nach deutschem Recht ( 4 (1) Nr. 5 der Fleisch-Verordnung) dürfen Fleischerzeugnisse gewerbsmäßig nicht in den Verkehr gebracht werden, wenn bei ihrer Herstellung Proteinhydrolysate verwendet wurden. Ausgenommen sind Würzen, die zum unmittelbaren Verzehr bestimmt sind und deren Gehalt an Gesamtstickstoff nicht über 4,5 % liegt. In der Praxis bereitet diese Regelung häufig Probleme bei der lebensmittelrechtlichen Beurteilung, da mit der Kenntlichmachung als Würze der Einsatz von Proteinhydrolysaten verschleiert werden kann. Bei frischem Geflügelfleisch wurden im Rahmen der amtlichen Überwachung wiederholt überhöhte Wassergehalte bedingt durch den Einsatz von Proteinhydrolysate festgestellt. Derartig behandelte Produkte verstoßen gegen geltendes Recht der Europäischen Union (Artikel 5 der Richtlinie 71/118/EWG zur Regelung gesundheitlicher Fragen beim Handelsverkehr mit fri-

28 28 2 Literaturübersicht schem Geflügelfleisch). Danach ist die Zugabe von Wasserbindern auf allen Stufen der Nahrungskette verboten. Analytischer Nachweis von Proteinhydrolysaten in Fleisch und Fleischerzeugnissen zum spezifischen Nachweis von Proteinhydrolysaten werden biochemische und molekularbiologische Untersuchungsverfahren (Polymerase-Kettenreaktion, Elektrophorese und ELISA) herangezogen. Außerdem müssen bei der Analytik der Einfluss der genetischen Variabilität, der Fleischreifung und der Verarbeitungstechnologie berücksichtigt werden. Diese routinemäßig angewandten Methoden führten allerdings bisher nicht immer zum Nachweis unrechtmäßig zugesetzter Fremdproteine. Dies ist unter anderem auf den gestiegenen Reinheitsgrad der eingesetzten Proteinhydrolysate und die Komplexität der Fleischuntersuchungen zurückzuführen. Ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Fremdprotein-Zusätzen in frischem Fleisch könnte sich mit der Bestimmung des Musters der freien Aminosäuren abzeichnen. Dazu müssen im Rahmen von Vorversuchen mit Proben definierter Zusammensetzung weitere Ergebnisse gesammelt werden und ausgewertet werden, um daraus eine Datenbank von Vergleichsmustern zu erstellen. Die derzeit angewandten Methoden sind grundsätzlich ausreichend zum Nachweis von unregelmäßig zugesetzten Fremdproteinen. Jedoch werden die Fremdproteine den natürlichen immer besser angepasst. Daher arbeitet derzeit eine Projektgruppe unter Beteiligung von Experten aus den Bundesländern, der Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittelsicherheit (BVL) an der Weiterentwicklung der Analysenmethoden. Als einen viel versprechenden Ansatz zum Nachweis von Wasserbindern bezeichnete die Projektgruppe die Bestimmung der Konzentration eines bestimmten Aminosäurenderivats. Aminosäurederivate sind Aminosäuren, die zusätzlich chemische Gruppen enthalten. Diese Derivate kommen ausschließlich im Muskelfleisch der Lebensmittel liefernden Tieren vor. Werden frischem Fleisch, Wurst oder Schinken Wasserbinder zugesetzt, nimmt die Konzentration dieses Aminosäurenderivats ab. Der Kern der Bestimmung von muskeleiweiß-spezifischen A- minosäurenderivaten ist die SDSPAG-Elektrophorese (BVL 25).

29 2 Literaturübersicht Fleischreifung Mit dem Eintritt des Todes beginnt in der Muskulatur des geschlachteten Tieres ein Ablauf chemischer, biochemischer, physikalischer und morphologischer Veränderungen, durch die sich die Wandlung des Muskelgewebes zu Fleisch beschreiben lässt. Dieser je nach Art des Schlachttierkörpers wenige Tage bis mehrere Wochen dauernde Prozess wird auch als Fleischreifung bezeichnet (KÜHNE 24). KIJOWSKI (1984) wies darauf hin, dass die postmortalen Veränderungen in der Muskulatur von Geflügel deutlich rascher ablaufen, als bei Fleisch anderer schlachtbarer Tiere. Geflügel wird zwanzigmal schneller zart als Rindfleisch (TERNES 1994). Nach THIELKE (22) reicht eine ca. 1 bis 12 stündige Fleischreifung beim Masthähnchen aus, um eine Verbesserung der Zartheit der Muskulatur zu erzielen. Die postmortalen Prozesse in der Muskulatur werden folgerichtig in eine frühpostmortale und eine spät-postmortale Phase, die eigentliche Fleischreifung, unterteilt. Während die früh-postmortale Phase vor allem durch den Ablauf und die Folgen der Glykogenolyse gekennzeichnet ist, spielen im weiteren Verlauf enzymatischautolytische Vorgänge eine dominierende Rolle (KÜHNE 24) Glykogenolyse Nach Stillstand des Kreislaufes folgt die schnelle Entwicklung eines anaeroben Milieus, weil kein Sauerstoff mehr zugeführt wird. Die ATP-Reserven aus Kreatin- Phosphat und die enzymatisch katalysierte Umwandlung von zwei ATP in je ein ATP und AMP sind schnell erschöpft. Eine weitere Quelle ATP zu bilden, ist die Glykolyse. Dabei wird Glykogen oder Glykose über mehrere phosphorylierte Zuckerderivate zu Laktat (Milchsäure) abgebaut (TERNES 1994). Im Verlauf der postmortalen anaeroben Glykolyse reichert sich im Fleisch zunehmend Milchsäure an. Dadurch sinkt der Muskel-pH-Wert aus dem Neutralbereich innerhalb einiger Stunden bis auf muskeltypische End-pH-Werte ab. Spätestens 24 h post mortem ist der Endpunkt der Glykolyse und damit auch ein stabiler ph-wert erreicht, der das Fleisch vor rascher mikrobieller Besiedelung schützt. Gleichzeitig hat die säuerliche Geschmacksnote entscheidenden Anteil an der Ausbildung des Fleischaromas (FEHLHABER 1992).

30 3 2 Literaturübersicht Wird kein ATP mehr gebildet, so sinkt der ATP-Gehalt, da enzymatische Prozesse weiterlaufen. So kann auch die Verbindung von Aktin- und Myosinfilamenten nicht mehr gelöst werden, da hierfür ATP benötigt wird. In der Folge kommt es zum Eintritt des Rigor mortis (TERNES 1994) Enzymatische Vorgänge Die fleischeigenen glykolytischen Enzyme und verschiedenen Proteasen führen zur Ausbildung erwünschter Eigenschaften in Bezug auf Genussfähigkeit und Haltbarkeit: Säuerung Aromabildung Zartheit Saftigkeit Fleischfarbe (FEHLHABER 1992) Durch fleischeigene Kathepsine erfolgt in der Nähe der Z-Bande eine Spaltung, durch Papain jedoch auch an den Actin- und Myosinmolekülen (TERNES 1994). Zum vollständigen Abbau von Proteinen zu freien Aminosäuren sind mehrere Enzyme mit unterschiedlicher Spezifität notwendig. Proteinasen und Peptidasen gibt es nicht nur im Magen-Darm-Trakt sondern auch innerhalb der Zellen. Nach ihrem Angriffspunkt im Substratmolekül unterteilt man die proteolytischen Enzyme in Endopeptidasen und Exopeptidasen. Die Endopeptidasen oder Proteinasen spalten Peptidbindungen im Inneren von Peptidketten. Sie erkennen und binden kurze Teilsequenzen des Substrats und hydrolysieren dann relativ spezifisch Bindungen zwischen bestimmten Aminosäuren-Resten (KOOLMANN 1998). Exopeptidasen greifen, wie der Name sagt, nur am Ende einer Peptidkette an: Die Carboxypeptidasen vom Carboxy-Rest, die Aminopeptidasen von der Aminogruppe her (KARLSON 1988).

31 2 Literaturübersicht Mikrobielle Faktoren Verderbniskeime Mikroorganismen sind ein normaler Bestandteil der meisten Lebensmittel. Dies trifft gleichermaßen auf das geschlachtete Geflügel zu. Im Allgemeinen besitzen die verschiedenen Lebensmittel eine nach Keimmenge und Keimart typische, in bestimmten Grenzen variierende Mikroflora (FEHLHABER 21 a). Geflügel gilt als vergleichsweise leicht verderbliches Lebensmittel, weil im Zuge der Schlachtung eine intensive Kontamination, auch in modernen Schlachtanlagen, unvermeidlich ist und das Produkt selbst günstige Bedingungen für die Keimvermehrung bietet (FEHLHABER 21 a). Nach der Schlachtung gehören Pseudomonaden, Acinetobacter und Enterobacteriaceen zur dominierenden Keimflora von Geflügelfleisch (KRÖCKEL u. HECHELMANN 1998, BARNES 1966). Nach WEISE (1996) überwiegen bei kühlgelagertem Geflügelfleisch neben Bakterien der Gattung Pseudomonas und Acinetobacter auch Brochothrix thermosphacta und Shewanella putrefaciens, Moraxella und Psychrobacter die Keimflora. Innerhalb der ersten 24 h der Lagerung bei C - 2 C kommt es kaum zu einem Wachstum der Mikroorganismen, da der ph-wert des Fleisches auf 5,7 bis 6, absinkt. Trotz des niedrigen ph-wertes entwickelt sich eine so genannte Keimhaus- Flora, die vor allem aus Pseudomonaden und Enterobacteriaceen besteht (KRÖCKEL u. HECHELMANN 1998). Bei Keimzahlen > 1 7 /g treten sensorische Defekte wie Geruch- und Schleimbildung hervor. Der Abbau von Fleischproteinen wird vor allem auf extrazelluläre Proteasen mancher Vertreter der Gattung Proteus, Bacillus und Clostridium zurückgeführt, obwohl sie in der Regel einen kleineren Anteil der Population darstellen. Die entstehenden Peptide und Aminosäuren werden von anderen Mikroorganismen zu typischen Fäulnisprodukten wie Ammoniak, Schwefelwasserstoffverbindungen, Aminen usw. abgebaut. Die Entstehung von biogenen Aminen steht eng im Zusammenhang mit der Stoffwechselaktivität der Enterobacteriaceen, bei denen die Aminosäurendecarboxylaseaktivität recht ausgeprägt ist.

32 32 2 Literaturübersicht Manche Mikroorganismen, so z. B. die Enterobacteriaceen sind zunächst, solange leicht abzubauende Kohlenhydrate verfügbar sind, überwiegend saccharolytisch, um anschließend den proteolytischen Stoffwechselweg zu beschreiten. Andere Gruppen, wie die Milchsäurebakterien, sind dominant saccharolytische, vermögen aber auch vorgespaltenes Eiweiß weiter zu Aminosäuren abzubauen. Den Variationsmöglichkeiten des mikrobiellen Fleischabbaus durch eine komplexe Mikroflora sind prinzipiell keine Grenzen gesetzt. Nur die technologischen Faktoren der Fleischbehandlung, wie Kühlung, Abtrocknung oder Verpackungen, geben bestimmte Gesetzmäßigkeiten vor (WEISE 1996) Einfluss der Verpackung Für längere Haltbarkeiten von gekühltem ( C - 4 C) Frischfleisch sind Verbundpackungen mit niedriger Gasdurchlässigkeit erforderlich. Dadurch kann sowohl bei Vakuum- als auch Schutzgasverpackungen die Einhaltung eines niedrigen Redoxpotentials während der gesamten Lagerzeit gewährleistet werden. Dabei müssen aber nachteilige Wirkungen auf die Fleischfarbe und Gewichtsverluste durch Abscheidungen von Muskelflüssigkeit in Kauf genommen werden. Für vakuumverpacktes Fleisch von guter hygienischer Qualität und einen ph-wert von 5,7 lässt sich bei C - 1 C Kühllagerung eine Haltbarkeit von 8-1 Wochen erwarten, wobei zum Ende der Haltbarkeit säuerliche und (bedingt durch kurzkettige Fettsäuren) käseartige Geruchsabweichungen bei Gesamtkeimzahlen um 1 7 bis 1 8 /cm 2 wahrnehmbar werden (WEISE 1996). Bei Verpackungen mit modifizierter Atmosphäre und auch bei Vakuumverpackungen besteht die dominierende Keimflora aus milchsäurebildenden Bakterien, wie Laktobazillen und Streptokokken. Diese Keimarten werden von dem vorhandenen bzw. gebildeten CO 2 und von dem verminderten bzw. fehlenden Sauerstoffangebot nicht vollständig im Wachstum gehemmt. Nach BORCH (1996), VARNAM und SUTHERLAND (1995) und HOLZAPFEL (1996) sind Milchsäurebakterien und Brochothrix thermosphacta die dominierenden Mikroorganismen in vakuumverpacktem Fleisch. In Abhängigkeit vom Vakuum bzw. der

33 2 Literaturübersicht 33 Sauerstoffdurchlässigkeit der Folie kommen außerdem Enterobactericeae, Shewanella putrefaciens, Pseudomonas und Carnobacterium vor. Die organoleptischen Veränderungen, die mit dem hohen Keimzahlen von Milchsäurebakterien verbunden sind, sind weniger ausgeprägt als die Abweichungen, die durch die überwiegend aerobe Bakterienflora verursacht werden (ZEITOUN u. DEBEVERE 1992). KAKOURI und NYCHAS (1994) lagerten Hühnerkeulen und brustfilets 13 Tage lang bei 3 C und 1 C in verschiedenen Verpackungen (Vakuumverpackung und Verpackung in unterschiedlichen modifizierten Atmosphären) um Unterschiede im Wachstum der Mikroflora festzustellen. Bei Vakuumverpackungen und Verpackung mit 1%iger CO 2 -Atmosphäre stellten Laktobazillen die dominierende Flora dar. Bei den Vakuumverpackungen kam es bis zum Ende der Lagerzeit zu einem 1fachen Anstieg der Pseudomonadenzahlen, wobei jeweils bei 1 C das Wachstum der Pseudomonaden am größten war. 2.3 Aminosäuren Im Organismus erfüllen Aminosäuren unterschiedliche Funktionen: Sie sind die Bausteine für die Biosynthese der Proteine. Auch in Gallensalzen, Antibiotika und weiteren Naturstoffen finden sich Aminosäuren oder ihre Derivate als Bausteine. Einige Aminosäuren wirken selbst als Neurotransmitter, andere sind Vorstufen für Neurotransmitter, Mediatoren oder Hormone. Aminosäuren sind wichtige Bestandteile der Nahrung. Bestimmte Aminosäuren sind als Zwischenprodukte im Stoffwechsel von Bedeutung, z. B. als Stickstoff- Donoren bei Biosynthesen (LÖFFLER u. PETRIDES 1988, KOOLMAN 1998) Aufbau und Einteilung Von den zahlreichen bekannten Aminosäuren werden nur 2 in Proteinen gefunden. Entsprechend bezeichnet man diese 2 Aminosäuren als proteinogene Aminosäu-

34 34 2 Literaturübersicht ren. Die übrigen Aminosäuren werden als nicht proteinogene Aminosäuren bezeichnet (KREUTZIG 1994). Alle Aminosäuren besitzen zwei charakteristische funktionelle Gruppen: die Aminogruppe ( NH 2 ) und die Carboxylgruppe ( COOH). Mit Ausnahme des Glycins, der einfachsten Aminosäure, besitzen alle Aminosäuren mindestens ein asymmetrisches C-Atom und haben somit optische Aktivität. Aufgrund der Aminogruppe am C 2 -Atom unterscheidet man zwei sterische Reihen: L- und D-Reihe. Die in den Proteinen vorkommenden Aminosäuren gehören der L-Reihe an. Aminosäuren haben amphoteren Charakter, d. h. sie können als Base und als Säure reagieren. Am isoelektrischen Punkt liegt überwiegend die zwitterionische Form vor, so dass die Aminosäurelösung nach außen hin ungeladen erscheint (TERNES 1994). Abbildung 2-1: Allgemeine Strukturformel Eine Einteilung der Aminosäuren ist nach verschiedenen Gesichtspunkten möglich. Da die Seitenketten der Aminosäuren für die intra- und intermolekularen Wechselwirkungen bei Proteinen und damit für deren Eigenschaften entscheidend sind, kann man einteilen in: Aminosäuren mit ungeladenen, unpolaren Seitenketten: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin Aminosäuren mit ungeladenen, polaren Seitenketten: Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin

35 2 Literaturübersicht 35 Aminosäuren mit geladenen Seitenketten: Asparaginsäure, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Arginin Eine Einteilung nach ernährungsphysiologischen Gesichtspunkten unterscheidet: Essentielle Aminosäuren: Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Trytophan, Methionin, Threonin, Histidin (für den Säugling essentiell), Lysin, Arginin (semiessentiell) Nichtessentielle Aminosäuren: Glycin, Alanin, Prolin, Serin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure (BELITZ u. GROSCH 1992) Stoffwechsel der Aminosäuren Der Stoffwechsel der Aminosäuren beginnt mit der hydrolytischen Zerlegung von Proteinen (Proteinasen, Peptidasen) zunächst zu größeren Bruchstücken und schließlich zu Aminosäuren. Die auf diesem Wege aus der Nahrung freigesetzten Aminosäuren werden vom Darm resorbiert und zur Leber geleitet. Dort werden sie entweder zum Aufbau körpereigener Proteine verwendet oder weiter abgebaut. Die wichtigste Reaktion zum Abbau der Aminosäuren ist die Transaminierung, bei der Pyridoxalphosphat als Coenzym fungiert. Die Transaminierung ist die reversible Verschiebung einer α-aminogruppe auf eine α-ketosäure, wobei eine neue Aminosäure und eine andere α-ketosäure entstehen. Der Organismus kann auf diesem Wege neue Aminosäuren aufbauen. Aus α-ketosäuren können so nicht essentielle Aminosäuren gebildet werden (KREUTZIG 1995). Die oxidative Desaminierung ist neben der Transaminierung der zweite Weg, auf dem aus einer Aminosäure eine α-ketosäure entstehen kann. Da dieser Weg ein oxidativer ist, entstehen dabei Wasserstoff (Oxidation = Dehydrierung), der auf ein Coenzym (meist NAD + oder NADP + ) übertragen wird (KREUTZIG 1995). Bei der oxidativen Desaminierung von Aminosäuren zu α-ketosäuren wird Ammoniak freigesetzt, das als Zellgift wirkt und deshalb in besonderer Weise ausgeschieden werden muss. Die Entgiftung des Ammoniaks geschieht im Harnstoffzyklus, der in der Leber abläuft.

36 36 2 Literaturübersicht Die dritte Möglichkeit des Abbaus der Aminosäuren ist die Decarboxylierung (Abspaltung der COOH-Gruppe); sie führt zu den biogenen Aminen. An der Decarboxylierung von Aminosäuren ist meistens Pyridoxalphosphat als Cofaktor beteiligt (ASKAR 1986). Einige der Aminosäuren liefern beim Abbau Ketonkörper und werden daher ketoplastische Aminosäuren genannt (Leucin, Lysin). Hingegen werden Aminosäuren, die beim Abbau z. B. Pyruvat, Succinyl-CoA oder Zwischenprodukte der Glukoneogenese oder des Zitronensäurezyklus liefern, als glukoplastische Aminosäuren bezeichnet. Die Glukosebildung (Gluconeogenese) aus Aminosäuren spielt dann eine Rolle, wenn die Ernährung glucosearm aber eiweißreich ist oder der Körper wegen Hungers Proteinreserven mobilisieren muss (KREUTZIG 1995) Bestimmung der Aminosäuren Die Aminosäurenanalyse kann mit verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. In den 4er Jahren des letzten Jahrhunderts wurden Aminosäuren mit Hilfe von Mikroorganismen identifiziert. Hierfür machte man sich zu nutze, dass gewisse Mikroorganismen nur dann wachsen, wenn unter anderen lebenswichtigen Stoffen auch Aminosäuren zugeführt werden. Man ermittelte das Minimum der gesuchten Aminosäuren, welches zum Wachsen benötigt wurde. Dies war eine langwierige und ungenaue Analysemethode (KERGL et al. 1954). MONTOC und BANU (1968) untersuchten freie Aminosäuren in Rind- und Schweinefleisch mit Hilfe der Papierchromatographie. Bei dieser Methode dauerte die Erstellung eines Aminosäurenprofils einige Tage. Anfang der 6er Jahre des vergangenen Jahrhunderts entwickelten MOORE und STEIN (1963) eine Ionenaustauschchromatographische Methode mit einer Nachsäulenderivatisierung der getrennten Aminosäuren. Diese Analysemethode war bahnbrechend und wird in leicht modifizierter Form noch heute angewendet. In den 7er Jahren des letzten Jahrhunderts erlangte die Hochdruck- Flüssigkeitschromographie (HPLC) immer größere Bedeutung. Mit ihr wird heute der größte Teil der Aminosäurenanalysen durchgeführt (BAXTER 1994, TAUBERT 1996). Ein weiteres chromatographisches Verfahren, das für die Aminosäurenanalyse eingesetzt wird, ist die Gaschromatographie (GÜNTHER 1971).

37 2 Literaturübersicht Methoden der Probenaufarbeitung Um im Muskelgewebe eine Bestimmung von freien Aminosäuren vornehmen zu können, muss das Eiweiß, des zu untersuchenden Probenmaterials, ausgefällt werden. Dies kann durch Ultrafiltration, Ultrazentrifugation oder Säurefällung erfolgen. Die Eiweißfällung mit Sulfosalicylsäure ist die am häufigsten verwendete Methode. Für die Bestimmung von Gesamtaminosäuren muss das Probenmaterial in freie Aminosäuren zerlegt (hydrolisiert) werden. Man unterscheidet mehrere Hydrolyseverfahren: die sauere Hydrolyse, die alkalische Hydrolyse und die enzymatische Hydrolyse (EPPENDORF 1994) Ionenaustauschchromatographie Die Ionenaustauschchromatographie ist ein flüssigkeitschromtographisches Verfahren zur Trennung und Quantifizierung von Ionen. Prinzipiell ähnelt sie in den methodischen Abläufen der Hochleistungsfüssigkeitschromatographie (MATTER 1994). Der für jede Aminosäure spezifische isoelektrische Punkt ist bei der Ionenaustauschchromatographie die Grundlage für die Trennbarkeit (EPPENDORF 1993). Die stationäre Phase besteht aus einem Kunstharzpulver, das negativ geladene (Benzosulfonsäure-)Gruppen enthält. Die zugehörigen positiven Ionen (Na + ) befinden sich zusammen mit Aminosäuren in der mobilen Phase. In dieser Phase liegt ein ph-wert vor, bei dem alle Aminosäuren als Kationen (+) vorliegen. Diese Aminosäuren-Kationen binden sich an die negativen Gruppen des Austauschharzes (Adsorption). Erhöht man den ph-wert der mobilen Phase, so verlieren die Aminosäuren ihren Kationen-Charakter, indem sie ein H + abgeben, und gehen in die Zwitterform über, in der sie zwar geladen, aber nach außen elektrisch neutral sind. Aus diesem Grund können sie jetzt nicht mehr gebunden werden. Sie werden abgelöst (eluiert). Die Aminosäuren, die besonders leicht ein H + abgeben können, also einen niedrigen isoelektrischen Punkt haben, werden zuerst abgelöst. Erhöht man langsam den ph-wert der mobilen Phase, so erscheinen die Aminosäuren nacheinander im Eluat (KREUTZIG 1994). Nach der Trennung in der Säule werden die einzelnen Aminosäurenfraktionen quantitativ photometrisch bestimmt. Dies geschieht in einem UV-Photometer, in dem die Transmissionslichtmenge beim Durchfluss der Fraktion