Technologie neuer HPLC-Materialien
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- Ralf Glöckner
- vor 8 Jahren
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1 Technologie neuer PLC-Materialien für höhere Effizienz und kürzere Analysenzeiten Sigma-Aldrich Chemie Gmb Klaus Buckendahl
2 Inhalt Van eemter-kurve Fused-Core TM Partikel - PLC Entwicklung der PLC-Partikel - Fused-Core Partikeltechnologie - Säulenleistung Vergleich zu Sub-2µm und 3µm/5µm Materialien Systemkompatibilät Applikationsbeispiele 2 Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp.
3 van eemter-kurve: = A + B/u + Cu B = 2 m C = (f 1 d P2 +f 2 d f2 ) A = 2 d P 3 u
4 Geschichte des PLC-Partikel- esigns Irregulär Schwierig zu packen, schnelles Verstopfen, nicht sehr robust Pellicular Pelliculare Partikel haben eine sehr dünne poröse aut (geringe Kapazität) Total Porös er aktuelle Standard in der PLC 5
5 van eemter und die Partikelgröße = A + B/u + Cu 16, d p = 10 µm ETP (µm) d p = 5 µm d p = 3 µm d p = 1.7 µm Lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase (mm/s)
6 ruck und Effizienz sind umgekehrt proportional zur Partikelgröße Einfluss von d P auf den ruck ist größer Effizienz bar 30,000 25,000 20,000 15,000 10, , d p (μm) N P 1 2 d p 1 d p Eine Verdoppelung der Effizienz führt zu einer Vervierfachung des rucks. Alleinige Verringerung der Partikelgröße führt somit nicht zum Ziel. Partikelgr psi Bar N 27,500 20,000 16,500 10,000 5,000 3,750 2, cm Säule, 3 mm/s lineare Geschwindigkeit
7 Geschichte des PLC-Partikel- esigns Irregulär Schwierig zu packen, schnelles Verstopfen, nicht sehr robust Pellicular Pelliculare Partikel haben eine sehr dünne poröse aut (geringe Kapazität) Total Porös er aktuelle Standard in der PLC Fused-Core Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology, Inc. ie Zukunft der PLC? 8
8 Fused Core-Technologie öhere Effizienz Agilent 1200 Ascentis Express C18, 15cm x 4.6mm, 2.7 µm 1.0mL/min, 254nm, RT, 10uL inj 1. Uracil (Totzeitmarker) 2. Acetophenon N = 33,786 Wie viel Trennleistung ist auf einem 3. konventionellen Benzol N = 31,696 PLC-System 4. möglich? Toluol N = 30,738 ruck = 183 bar (2690 psi) min 9
9 Fused-Core Partikeltechnologie Fused-Core Partikeltechnologie als innovativer Ansatz in der PLC durch r. Jack Kirkland Poröse Kieselgelschicht mit hoher Kapazität auf einem soliden, nichtporösen Kern. Verwendung von hochreinem Kieselgel. 0.5 µm 2.7 µm Kieselgelpartikel 2.7 µm µm 1.7 µm solider Kern 0.5 µm poröse SiO 2 -Schicht C18, C8, ILIC (Si), RP-Amid, Phenyl-exyl Extrem enge Partikelgrößenverteilung
10 3- Zeichnung der Fused Core-Partikel Oberfläche ca. 150 m 2 /g (>200 m 2 /g dichtekorrigiert). er Kern ist der am wenigsten nützliche Teil im Partikel! 11
11 Fused-Core zeigt höhere Effizienz als 3 μm schmalere Peaks bedeuten bessere Auflösung + höhere Empfindlichkeit 0.5 µm iffusionsweg 1.5 µm 2.7 µm 1.7 µm 12 er kürzere iffusionsweg reduziert die Peakverbreiterung!
12 16, Vorteile der Fused-Core Technologie Vergleich von Effizienz und ruck bei verschiedenen Partikeln = A + B/u + Cu 16,000 14,000 P = 1000F L P = r 2 d 2 p 1.7 µm , ml/min ETP ( m) ruck (psi) 10,000 8,000 6, µm FC ,000 3 µm µm Ascentis Express 2, Lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase (mm/sec) Lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase (mm/sec) 14 *50x4.6 mm Säulen, 55/45 ACN/Wasser
13 Kleinere Partikel erhöhen ruck exponentiell bar Rückdruck vs. Partikelgröße 1.8 µm ~ 400 bar (6,000 psi) 3 µm ~ 150 bar (2,250 psi) 5 μm ~ 50 bar (750 psi) d p (μm) 10 cm Säule, 3 mm/s lineare Flussrate 15
14 Fritten für PLC Säulen Säule Partikelgröße (µm) Arbeitspferd 5 Frittenporosität (µm) 2 Ascentis Express 3µm poröses Material höhere Effizienz Ascentis Express enge Partikelgrössenverteilung erlaubt 2 µm-fritten UPLC Ascentis Express Wie 5 µm-säulen können Ascentis Express-Säulen effizient mit 0.5 µm-inline- Filtern geschützt werden. 16
15 Ascentis Express 2.7 µm 3 µm van eemter-studie: Naphthalin, M.W. = 130 8,00 Naphthalene 7,00 6,00 Acentis C8 3µm h = / d p h 5,00 4,00 3,00 AMT Ascentis C18 Express WP C µm AMT Ascentis C8 WP Express C8 2.7 µm 2,00 1,00 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 u (mm/s) 17 Säule: 50 x 4.6 mm. Mobile Phase: 55/45 ACN/Wasser. Probe: Naphthalin (20 µg/ml), in 55/45 ACN/Wasser Injektion: 5 µl etektion: 254 nm Temperatur: 30 C Instrument: Agilent 1100
16 Fused-Core bietet höhere Auflösung bei niedrigeren rücken Maximale Anzahl von N wird bestimmt durch die Partikelgröße Sub 2 µm-partikel bieten eine 1.55-fache Verbesserung der Auflösung bei einem 8-fachen ruckanstieg (vgl. zu 5 µm) Fused Core-Partikel (FC) bieten eine 1.55-fache Verbesserung der Auflösung bei max. 4-fachen ruckanstieg Säulenlänge dp N R ruck (psi) ruck (bar) 10cm 5μm cm 3μm , cm 2.7μm FC , cm 1.8μm ,
17 öhere Effizienz als 3 µm Ascentis Express C18, 2.7 µm 65 % ACN N = 237,700 N/m, N = 35,655 N/Säule ruck = ca. 4,000 psi Vergleich von 15 cm-säulen Agilent 1100 PLC System Säule: 150 x 4.6 mm Mobile Phase: Acetonitril / Wasser Fluss: 1.5 ml/min Injektion: 2.0 L etektion: 220 nm 1. p-hydroxy ethylbenzene 2. Napthalene 3. p-xylene 4. Biphenyl Konventionelle C18, 3 µm 72.5 % ACN N = 140,600 N/m, N = 21,090 N/Säule ruck = ca. 4,000 psi Bessere Effizienz als 3 oder 3.5 µm-säulen bei gleichem ruck und Fluß; Vorteil wird bei hohen Flüssen noch größer
18 TO-11/IP-6A Carbonyl-NP Mix Naherzu 2-fache Empfindlichkeit mau mau Ascentis Express C18, 2.7 µm Peak 8 N = 260,720 p/m N = 39,108 p/col Empfindlichkeitslücke Ascentis C18, 3 µm Peak 8 N = 146,587p/m N = 21,988p/col Column: 150 x 4.6 mm I.. Mobile phase: Ascentis Express C µm: 25:75, water: acetonitrile Ascentis C18 3 µm: 30:70, water: acetonitrile Flow rate: 1.0 ml/min. Temp.: 30 C et.: UV at 365 nm Injection: 1 µl Sample: U TO11/IP6A Carbonyl-NP Mix as indicated below in 40:60, water: acetonitrile Peak Is 1. Formaldehyde-2,4-NP (105 µg/ml) 2. Acetaldehyde-2,4- NP (76.4 µg/ml) 3. Acrolein-2,4- NP (63.2 µg/ml) 4. Acetone-2,4- NP (61.5 µg/ml) 5. Propionaldehyde-2,4- NP (61.5 µg/ml) 6. Crotonaldehyde-2,4- NP (53.6 µg/ml) 7. Butyraldehyde-2,4- NP (52.5 µg/ml) 8. Benzaldehyde-2,4- NP (40.5 µg/ml) 9. Isovaleraldehyde-2,4- NP (46.4 µg/ml) 10. Valeraldehyde-2,4- NP (46.4 µg/ml) 11. o-tolualdehyde-2,4- NP (37.5 µg/ml) 12. m-tolualdehyde-2,4- NP (37.5 µg/ml) 13. p-tolualdehyde-2,4- NP (37.5 µg/ml) 14. exaldehyde-2,4- NP (42 µg/ml) 15. 2,5-imethylbenzaldehyde-2,4- NP (35 µg/ml) NB: Ascentis C18 and Ascentis Express C18 have different Surface Chemistries
19 öherer Probendurchsatz auf traditionellen PLC Systemen* 6x Konventionelle C18 25 cm x 4.6 mm I.., 5 μm 1.0 ml/min., N= Pressure: 128 bar (1880 psi) Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm I.., 2.7 μm 1.0 ml/min., N = Pressure: 167 bar (2450 psi) Methodenanforderung war N > Ascentis Express C18 10 cm x 4.6 mm I.., 2.7 μm 1.5 ml/min., N = Pressure: 248 bar (3645 psi) *Agilent 1100 PLC System
20 ohe Gewschwindigkeit: öhere Flussrate Ascentis Express vs. Sub-2 µm bei Maximaldruck des Systems Ascentis Express C ml/min 45 % acetone psi N = 12,500 Sub-2 µm Column ml/min 51 % acetone psi N = 12, Ascentis Express C ml/min 45 % acetone psi N = 8, Mobile Phase: water : acetonitrile; isoelutropic for -Estradiol Columns: 100 x 2.1 mm Flow: variable et: 200 nm Inj: 1µL Elution order: 1. Estriol 2. -Estradiol 3. Contaminant 4. Estrone 5. Estrone degradant Alle Säuleneffizienzen wurden durch Systemdispersionen beinträchtigt. ie Ascentis Express Säule zeigt auch bei doppelter Flussrate nur einen halb so hohen Rückdruck wie die Sub-2µm Säule. 25
21 2-fache Effizienz am Systemlimit: 4,000 6,000 psi System Ascentis Express C mm length 45 % acetonitrile 4500 psi N = 8,500 p/col Mobile Phase: water : acetonitrile; isoelutropic for -Estradiol Columns: 2.1 mm I Flow: 0.6 ml/min et: 200 nm Inj: 1µL C18 Sub-2 µm Säule Elution order: 1. Estriol 2. -Estradiol 3. Contaminant 4. Estrone 5. Estrone degradant 50 mm length 46 % acetonitrile 5200 psi N = 3,790 p/col Beide Säuleneffizienzen wurden durch Systemdispersionen beinträchtigt. ie längere Ascentis Express Säule zeigt doppelte Trennstufenzahl (N) bei gleichem Rückdruck wie die kürzere Sub-2µm Säule
22 Ferrule passt in jedes Fitting Bis zu 1000 bar / psi Finger-tight 28
23 Ascentis Express: N = 100,000 durch Säulenkopplung 1 Säule 15cm x 4.6mm 2 Säulen = 30cm Agilent N Toluol = 30, mL/min, 254nm, RT, 10uL, 50 C 3. N Benzol = 31, N Acetophenon = 33,786 ruck = 183 bar (2690 psi) 4. N Toluol = 63, N Benzol = 64, N Acetophenon = 67,390 ruck = 350 bar (5145 psi) 3 Säulen = 45cm N Toluol = 91, N Benzol = 94, N Acetophenon = 101,586 ruck = 473 bar (6953 psi)
24 Ascentis Express trennt Agilent cm x 4.6mm (>100,000 N in 14 min) 60% Acetonitril 1.1mL/min, 254nm, 50 C, 10uL 4 Säulen B B deuterierte Isomere B Toluol N = 104,235 Benzol N = 106,096 Acetophenon N = 117,475 ruck = 473 bar (7,000 psi) B 10 Toluol N = 105, Benzol N = 106,260 6 Benzol N = 105,235 Acetophenon N = 118,567 ruck = bar (7,000 psi)
25 Ascentis Express trennt deuterierte Isomere mau 250 nm Jasco X-LC 3 4 Säule: Ascentis Express C18; 150 x 3 mm; x5 Fluß: 0.6 ml/min Mobile Phase: 56:44, Wasser:Acetonitril Temp: 60 C ruck: psi (930 bar) k (Toluol) : 5.3 (3µL Injektion) Peak I 1. Uracil 2. Acetophenon 3. Benzol 4. Toluol Säule: sub-2µ C18; 3 x 150 mm; x2 Fluß: 0.3 ml/min Mobile Phase: 56:44, Wasser:Acetonitril Temp: 60 C mau 250 nm ruck: psi (780 bar); [eine weitere 10 cm-säule würde den ruck auf über 1000 bar erhöhen] k (Toluol) : 5.3 (3µL Injektion)
26 Ascentis Express trennt deuterierte Isomere Säule: Ascentis Express C18; 150 x 3 mm; x5 Benzol Fluß: 0.6 ml/min Mobile Phase: 56:44, Wasser:Acetonitril Temp: 60 C ruck: psi (930 bar) k (toluene) : 5.3 C 3 C 3 Toluol C 3 C
27 35 Weitere Applikationsbeispiele für hohe Auflösung mit Fused Core Partikeln/ Ascentis Express
28 Bessere Auflösung als 3µm Partikel Ascentis Express C18 (2.7 m) Efficiency (N) Peak 9: psi columns: 10 cm x 2.1 mm I.. mobile phase A: 100 mm ammonium acetate (p 7.0; titrated with ammonium hydroxide) mobile phase B: water mobile phase C: methanol online mixing: Ascentis Express C18: A:B:C = 10:28:62 3 µm, C18: A:B:C = 10:25:65 (isoelutropic for peaks 6 & 9) flow rate: 0.3 ml/min. temp.: 55 C det.: UV at 250 nm injection: 1 µl C18 3 µm 6 Efficiency (N) Peak 9: psi Peak I 1. Uracil 2. Nordoxepin (50 mg/l) 3. esipramine (50 mg/l) 4. Nortiptyline (50 mg/l) 5. oxepin (50 mg/l) 6. Norclomipramine (50 mg/l) 7. Imipramine (50 mg/l) 8. Amitriptyline (50 mg/l) 9. Clomipramine (50 mg/l)
29 Mehr Auflösung: Tryptischer Verdau von Carbonsäureanhydrase Agilent 1100 Probe: Tryptischer Verdau von Carbonsäureanhydrase Injektion: 40 μl; Fluss 35ºC; etektor: 215 nm Response time (et.) >0.010min Gradient: MP A 5% ACN w/0.1% TFA MP B 80% ACN w/0.095% TFA 2 min 0% B 58 min gradient from 0% B to 50% B 20 min gradient from 50% B to 85% B Ascentis Express C18 15 cm x 4.6 mm 2.7 µm Konventionelle C18 15 cm x 4.6 mm 3 µm
30 Mehr Auflösung mit Ascentis Express Vergrößerte Regionen. Gleiche Skalierung Konventionelle C18 3 m Ascentis Express C µm
31 T IC o f + M R M (4 p airs ): fro m S am p le 11 (tes t m ix 1 0 ) of A s c en tis tes t m ix w iff (T u rb o S p ra y) M ax. 2.1e6 cps. Steile Gradienten mit Ascentis Express 2.1 e6 2.0 e6 1.9 e6 1.8 e6 1.7 e6 1.6 e6 1.5 e6 1.4 e6 1.3 e6 1.2 e6 1.1 e6 1.0 e6 9.0 e5 8.0 e5 7.0 e5 18µL test mix Injection 9 Pressure 434 bar e5 5.0 e5 4.0 e5 Probe. Plasma nach Proteinfällung Säule: Ascentis Express C18 imension: 50 x 2.1mm Gradient: A: 0.1% (aq) Ameisensäure B: 0.1% Ameisensäure in MeCN Flussrate = 1.1mL/min Zeit (mins) %B 2.0 e5 1.0 e T i m e, m i n T IC o f + M R M (4 p airs): fro m S am p le 5 (te s t m ix ) o f A s ce ntis te s t m ix w iff (T urbo S p ra y ) M a x e 6 c p s. 1.3 e6 1.2 e6 1.1 e6 1.0 e6 9.0 e5 8.0 e5 7.0 e5 6.0 e5 5.0 e5 4.0 e5 3.0 e5 2.0 e5 1.0 e5 0.0 Injection 659 Pressure 444 bar Tim e, m in T IC o f + M R M (4 p airs ): fro m S am p le 25 (tes t m ix) of A sc en tis tes t m ix w iff (T u rb o S p ra y) M a x e 6 c p s. 1.9 e6 1.8 e6 1.7 e6 1.6 e6 1.5 e6 1.4 e6 1.3 e6 1.2 e6 1.1 e6 1.0 e6 9.0 e5 Injection 1658 Pressure 447 bar e5 8.0 e5 7.0 e e5 5.0 e5 4.0 e5 3.0 e e5 1.0 e T i m e, m i n Courtesy of: r avid Mallet, MPK, GSK, Stevenage, UK T IC o f + M R M (4 p airs): fro m S am p le 10 (tes t m ix 5 ) o f A sce ntis te st m ix w iff (T urbo Sp ra y) M a x e 6 c p s e e e e e e e e e e e e e e 5 Injection 3688 Pressure 458 bar e e e e e e T i m e, m i n
32 41 Ascentis Express Stabilität Erfahrung eines Kunden mit Ascentis Express C18
33 as Maximum aus einer Fused Core Säule / Ascentis Express herausholen Flussraten für Ascentis Express sind höher als für traditionelle Säulen mit porösem Material. Basierend auf den Van eemter-kurven, sind für die Ascentis Express höhere Flüsse als für 5µm Säulen nötig um die maximale Effizienz zu erreichen. 16,00 0 ETP ( m) Ascentis Express Säulen I 4.6mm Empf. Flussrate für den Start der Methodenodenentwicklung 1.6 ml/min mm 0.8 ml/min µm Ascentis Express 2.1mm 0.4 ml/min Mobile Phase Velocity (mm/sec)
34 Zusammenfassung Fused-Core Partikel bieten einen kinetischen Vorteil - öhere Trennleistung auf jedem PLC-System oppelte Effizienz verglichen mit 3 µm Partikeln alber Rückdruck verglichen mit sub-2 µm Partikeln Erhöhung der Säulenlänge für erhöhte Trennleistung - Kürzere Analysendauer bei gleicher Trennleistung albe Säulenlänge: gleiche Trennleistung wie 3 µm-säulen Gleiche Geschwindigkeit und Trennleistung wie sub-2 µm-säulen bei halbem Rückdruck Erhöhung von Fluß und Geschwindigkeit - Vorteil der Robustheit und altbarkeit traditioneller PLC-Säulen u. Systeme 43
35 anksagung r. illel Brandes r avid Bell ugh Cramer r. Richard A. enry r. Wayne Way r. Russel Gant r. Paul Ross r. William Campbell r. A. aniel Jones, MSU 45
36 Vielen ank! C18 C8 ILIC (Si) RP-Amide Phenyl-exyl 46
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