Quantitative Analyse des Polysaccharides Sinistrin in Serum mittels HPLC und elektrochemischer Detektion

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1 Quantitative Analyse des Polysaccharides Sinistrin in Serum mittels HPLC und elektrochemischer Detektion D. Payerl, K. Öttl und G. Reibnegger Institut für Medizinische Chemie & Pregl-Laboratorium Harrachgasse 21/II; A-81 Graz Hintergrund: Zur Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) können verschiedene Marker eingesetzt werden. Einer dieser Marker ist das Polyfructosan Sinistrin, das gegenüber Inulin den Vorteil hat, dass es wasserlöslich und somit leichter handzuhaben ist. Zur Bestimmung der GFR wird der zeitliche Verlauf der Sinistrinkonzentration im Serum nach einer intravenösen Sinistrinbolusinjektion bestimmt. Mittels computergestützter Systemidentifikation wird aus dem Verlaufsprofil die GFR berechnet. Prinzipiell sind zwei verschiedene Methoden zur Sinistrinbestimmung bekannt. Die erste Methode ist eine vollenzymatische Methode [1], die auf der Hydrolyse von Sinistrin zu Fructose basiert und mittels Analysenautomat durchgeführt wird. Für die zweite Methode, die mittels HPLC und elektrochemischer Detektion durchgeführt wird, ist eine aufwendige Festphasenprobenvorbereitung notwendig [2]. Wir haben eine neue Methode für die Sinistrinbestimmung mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion und einer sehr einfachen Probenvorbereitung entwickelt. Methode: Die Probenvorbereitung erfolgt in 2 Schritten, um Glucose, die in hoher Konzentration stören würde, zu entfernen: Zuerst wird eine Vorinkubation mit Glucoseoxidase (GOD) und Catalase (CAT) durchgeführt, danach erfolgt die saure Hydrolyse und gleichzeitig eine Proteinfällung mit Trifluoressigsäure (TFA). Testansatz: 9µl Serum +1µl Standard oder H 2 O +5µl GOD (5U/ml) +5µl CAT(1U/ml) Die Probe wird 6 Minuten bei 56 C im Brutschrank inkubiert. +1µl TFA (6M) 1

2 Die Probe wird abzentrifugiert. Nach einer 9-minütigen Inkubation von 2µl Überstand bei 35 C im Wasserbad wird die Probe mit flüssigem Stickstoff eingedampft und in 2µl H 2 O gelöst. Das HPLC-System besteht aus einem Spark Midas Autosampler mit PEEK-Injektionsventil, einer Flux Rheos 4-Pumpe, einem ERC Vacuumentgaser, einem ESA PEEK Pulsationsdämpfer, einem Säulenofen Jetstream 2, einem ESA Coulochem II elektrochemischen Detektor, ausgestattet mit einer ESA 54 gepulst amperometrischen analytischen Zelle, und einer CSW Chromatographie Datenstation zum Aufzeichnen der Ergebnisse. Die mobile Phase ist eine 5mM NaOH, hergestellt aus NaOH-Pellets, mit einer Flussrate von 1ml/min. Als stationäre Phase verwenden wir eine Hamilton RCX-1 Anionenaustauschersäule, 25 x 4.1mm, mit einer passenden Vorsäule. Die Temperatur des Säulenofens beträgt 25 C. Detektoreinstellungen (Fig.1): Gepulst amperomterische Methode E1 2mV T1 3ms AD 1ms E2 7mV T2 1ms E3-9mV T3 1ms Max. Output: 1V Range R 1µA Potenzial [mv] Reinigung Messung Zeit [ms] Fig.1: Aufeinanderfolgend angelegte Potenziale für die gepulste amperometrische Detektion von Sinistrin Es werden 5µl Probe injiziert. Die Laufzeit beträgt 2min. Die Aufzeichnung erfolgt mit der CSW-Chromatographie-Software, die Auswertung wird mit Excel (Microsoft) anhand einer Standardkurve durchgeführt. Es werden bei jedem Lauf zwei Kontrollen mitgeführt. 2

3 Als Standards verwenden wir Blank-Serum und dasselbe Serum angereichert mit Sinistrin mit folgenden Konzentrationen: 5µg/ml, 1µg/ml, 2µg/ml, 3µg/ml und 5µg/ml. Als Kontrollen verwenden wir einen Serumpool, angereichert mit Sinistrin in den Konzentrationen 2µg/ml für die Kontrolle K1 und 3µg/ml für die Kontrolle K2. Ergebnisse: Durch die Inkubation der Serumproben mit GOD und CAT wird Glucose oxidiert, allerdings nicht quantitativ. Unter den von uns gewählten chromatographischen Bedingungen, können jedoch Glucose und Fructose voneinander getrennt werden (Fig.2) und daher kann eine genaue Aussage über die Fructosekonzentration gemacht werden (im Unterschied zur bekannten enzymatischen Methode). Die Inkubation mit GOD ist deshalb unerlässlich, weil hohe Serumkonzentrationen an Glucose die HPLC-Säule überladen würden. Während der anschließenden Inkubation der enteiweißten Proben mit TFA erfolgt die vollständige Hydrolyse von Sinistrin zu Fructose (Fig.3). 1 Glucose Fructose 1 Detektor Response [mv] Peakhöhe [mv] Zeit [min] Konzentration [µg/ml] Fig.2: Chromatogramme von Serumprobe, die Sinistrin enthält (blau) Serum mit Sinistrin (grün) Serumblank (rot) Fig.3: Vergleich von hydrolysiertem Sinistrin (rot) mit Fructose (blau) Wir haben jeweils vor und nach der Analysenreihe die Standards gemessen und festgestellt, dass die Kalibrationskurve für Sinistrin über einen breiten Konzentrationsbereich linear und während der Analyse stabil ist (Fig.4). Die Methode ist sensitiv genug, um Proben für eine GFR-Bestimmung problemlos messen zu können (Fig.5). 3

4 4 2 y =.66x -.3 Peakhöhe [mv] r 2 =.99 y =.68x r 2 =.99 Sinistrin [µg/ml] Sinistrin [µg/ml] Zeit [min] Fig.4: Kalibrationskurve von Fructose (=hydrolysiertes Sinistrin) vor (rot) und nach (blau) einer Serie von 3 Proben, 1 Blank- Serum, 5 Standards und 2 Kontrollen (ca. 76min) Fig.5: Zeitlicher Verlauf der Abnahme der Sinistrinkonzentration nach einer Bolusinjektion von 2.5g Sinistrin Die elektrochemische Detektion von Fructose (Monomer) ist sensitiver als die Detektion von Sinistrin (Polymer). Die Resultate der enzymatischen Sinistrinbestimmung sind sehr gut mit unserer Methode vergleichbar (Fig.6 und Fig.7). 4 8 HPLC [µg/ml] Enzymatisch [µg/ml] Differenz beider Methoden [µg/ml] Mittelwert beider Methoden [µg/ml] Fig.6: Vergleich von Sinistrinkonzentrationen bestimmt mit der enzymatischen Methode und der beschriebenen HPLC- Methode. r 2 =.94 Regressionskoeffizient=1.64 Fig.7: Bland Altman Diagramm [3] zum Vergleich der enzymatischen und der HPLC-Methode. Der Bias beträgt 6,7µg/ml. 4

5 Zusammenfassung: Die von uns entwickelte HPLC-Methode zeichnet sich durch eine einfache Probenvorbereitung und hohe Sensitivität aus. Die hydrolysierten Proben sind über einen langen Zeitraum stabil. Durch die chromatographische Trennung von Glucose und Fructose ist die beschriebene Bestimmung von nicht vollständig oxidierter Glucose unabhängig, was umso wichtiger ist, wenn man beachtet, dass es sich bei der Restglucose um keinen konstanten Wert handelt. Bei der enzymatischen Methode gibt es keine Kontrolle über die Vollständigkeit dieser Oxidation. Ein Vorteil der enzymatischen Methode ist auf jeden Fall der viel größere Probendurchsatz, allerdings nur unter Verwendung eines Analysenautomaten. Gegenüber der bereits publizierten HPLC-Methode hat die hier vorgestellte Methode den Vorteil, dass keine aufwendige Festphasenprobenvorbereitung notwendig ist. Aus diesem Grund entfällt auch die Verwendung eines internen Standards. Der lineare Messbereich bei der publizierten HPLC-Methode reicht bis ca. 3µg/ml, mit der hier vorgestellten Methode konnte problemlos bis 5µg/ml gemessen werden. Außerdem würde die Empfindlichkeit der Detektion eine deutliche Reduktion der durchaus schon geringen Probenmenge erlauben. Dies bedeutet, dass mit dieser Methode auch Messungen aus Kapillarblut möglich wären, was die Bestimmung der GFR bei Kindern erleichtern könnte. Literatur 1 Summerfield A, Hortin G, Smith C, Wilhite T, Landt M. Automated Enzymatic Analysis of Inulin. Clin Chem 1993; 39(11): Sechaud R, Decosterd LA, Pechere-Bertschi A, Biollaz J, Kesselring UW. Determination of the polyfructosan sinistrin in biological fluids by HPLC with electrochemical detection. J Pharm Biomed Anal 1996 Feb;14(4): Bland M, Altman D. Statistical Methods for Assessing Agreement between two Methods of Clincal Measurement. Lancet Feb 8;1(8476):37-1 5

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