Top quality is what makes the difference Vergleichende Untersuchungen von Acetonitril in Gradienten-Qualität verschiedener Hersteller.

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1 Top quality is what makes the difference Vergleichende Untersuchungen von Acetonitril in Gradienten-Qualität verschiedener Hersteller. Dr. Stefan Seekamp, Honeywell Specialty Chemicals GmbH, Seelze

2 Vergleichende Untersuchungen von Acetonitril in Gradienten-Qualität verschiedener Hersteller. Dr. Stefan Seekamp*, Honeywell Specialty Chemicals GmbH, D Seelze Abstract: Die Nachweisgrenzen bei Flüssigkeitschromatographie sinken immer weiter, denn es gibt immer wieder neue Gerätegenerationen der Systeme für Chromatographie. Dadurch rücken die Verunreinigungen aus den verwendeten Lösungsmitteln in den Blickpunkt. Das vorliegende Dokument fasst eine vergleichende Untersuchung von Acetonitril (Gradienten-Qualität) verschiedener Hersteller zusammen und bewertet sie. Dabei zeigte, sich, dass die herkömmlichen Testmethoden zur Bestätigung der Spezifikationen einigen Anforderungen aus der Praxis nicht mehr genügen.. Einleitung: Die Hersteller von Geräten für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC) arbeiten kontinuierlich an neuen Technologien, um ihre Geräte effizienter, robuster, günstiger und vor allem aber auch empfindlicher zu machen. Dieses führt zu immer neuen Anwendungsbereichen, aber auch zu immer höheren Anforderungen an die Peripherie in bestehenden Applikationen. Zu diesem Umfeld gehören beispielsweise Pipetten und Probegefäße, aber auch die für die Probenvorbereitung oder als Laufmittel verwendeten Lösungsmittel. Hier gibt es eine Reihe von einheitlichen Qualitätsparametern bei verschiedenen Herstellern, die jedoch nicht alle Applikationsbereiche berücksichtigen können. Die Vielfalt der möglichen Anwendungen ist einfach zu groß. Eine Rückstandsanalyse auf Pestizide in Gemüse stellt andere Anforderungen als beispielsweise die Suche nach Ölabbauprodukten in Fischleber. In den vergangenen Jahren hat sich die HPLC neben der Anwendung in der Kontrolle der Endprodukte auch Bereiche in der Prozesskontrolle erobert. So kann beispielsweise ein voll automatisiertes System mit einer entsprechenden Probenahme sehr effektiv bei der Überprüfung industrieller Abwässer eingesetzt werden. Weitere Felder liegen in der Online- oder Inline-Kontrolle der Synthese beispielsweise von pharmazeutischen Wirkstoffen und deren Vorläufern oder in der Überwachung von Peptidsynthesen oder deren Reinigung. Im Gegensatz zur Kontrolle eines kontinuierlichen Abwasserstroms mit regelmäßiger Beprobung kann das Probenaufkommen bei Batch-Prozessen sehr unterschiedlich sein. Das kann an einer anderen Prozeßführung oder auch an der Rohware liegen. Obwohl also die Produktion den genauen Zeitpunkt für das Liefern einer zu untersuchenden Probe nicht angeben kann, wird die Antwort dennoch schnellst möglich erwartet. Um im analytischen Labor direkt messbereit zu sein, wird die HPLC-Anlage bei einer Gradientenmethode (mit über die Zeit veränderte Mischungsverhältnisse von Wasser und Acetonitril) häufig lange Zeit mit der Startzusammensetzung der mobilen Phase betrieben. In dieser Vorlaufzeit von manchmal mehreren Stunden sammeln sich die Verunreinigungen aus dem Acetonitril an dem Anfang der Trennsäule. Bei einem Acetonitrilgehalt von nur 5 % in der mobilen Phase ist diese für unpolare Verbindungen unattraktiv. Wenn schließlich die Messung beginnt, werden diese Stoffe durch den nun beginnenden Anstieg der Acetonitrilkonzentration von der Säule eluiert. Die * Contact by using the contact from at

3 resultierenden Signale können die der Analyten überlagern und sind somit für den Analytiker ein Ärgernis, das behoben werden muss. Qualitativ hochwertige Lösungsmittel sind das Geschäft von Honeywell Research Chemicals, einem Geschäftsbereich, der auf dem Markt unter dem Namen Honeywell Burdick & Jackson auftritt. Der Schwerpunkt liegt bei diesen Produkten auf Reinheit und Konsistenz, wie zum Beispiel bei den hochreinen Lösungsmitteln für die Flüssigkeits-Chromatographie (LC) im Hochleistungsbereich gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) oder anderen Detektoren. Um den hohen Anforderungen dieser Verfahren zu entsprechen, müssen die Verunreinigungen im Lösungsmittel minimiert werden. Gleichzeitig sollen die verbleibenden Verunreinigungen im Spurenbereich eine möglichst gleich bleibende Zusammensetzung aufweisen, damit die Anlagen entsprechend kalibriert werden und so sichere Nachweise erbringen können. Die Wahl des Chemikalien-Lieferanten ist ein entscheidender Faktor für die Qualität der Ergebnisse, mit denen der Dienstleister sich wiederum gegenüber seinen Kunden profilieren kann. Experimentelles und Ergebnisse: Bei einem üblichen Gradiententest von HPLC-Lösungsmitteln wird die zu prüfende Flasche direkt als Laufmittel an ein HPLC-System angeschlossen. Nach einer Spülphase wird zügig mit der eigentlichen Gradientenmessung begonnen. Zwei Dinge lassen sich in dem resultierenden Chromatogramm erkennen: Die Basislinie steigt durch die unterschiedlichen UV-Transmissionen von Wasser und Acetonitril an und auf dieser Rampe beziehungsweise. an deren Ende sind Signale zu erkennen, obwohl keine Probe injiziert wurde. Aus diesen beiden Effekten werden sowohl eine Basislinienanhebung, als auch eine Peakhöhe des größten resultierenden Signals abgelesen. Diese beiden Werte gehen als qualitätsrelevant in die Spezifikation ein. Dieses Vorgehen hat sich in der Routine verschiedener Hersteller bewährt. Es erlaubt eine Einschätzung der Qualität des Produktes, reicht aber für eine Unterscheidung der unterschiedlichen Qualitäten am Markt kaum noch aus. In Abb. 1 sind Chromatogramme solcher Standardtests mit Lösungsmitteln verschiedener Hersteller gezeigt Intensity / mabs Competitor 1 Competitor 2 Competitor 3 Competitor 4 Competitor 5 Honeywell Time / min Abb 1: Standard Gradiententest (Shimadzu LC-10, 100 x 4 mm Nucleosil C18)

4 Es handelt sich dabei um Einzelmessungen von Proben, die per Zufall aus der jeweils aktuellen Produktion kommen oder gekauft wurden. Es wurde die jeweils beste erhältliche Gradientenqualität für den Vergleich verwendet. Es lässt sich gut sehen, dass bei dieser Methode mit einer Ausnahme alle Hersteller ziemlich gleichauf sind. Die beobachteten Unterschiede können noch im Rahmen der zu erwartenden Schwankung des Herstellprozesses liegen. Aber normale Gradiententests wie dieser bilden z.b. das oben beschriebene Szenario zur Produktionsüberwachung mit längeren Vorlaufzeiten nur unzureichend ab. Ferner hat sich intern bei Laborversuchen zu Prozessverbesserungen bzw. den Messsystemanalysen dazu gezeigt, dass diese Untersuchung unzureichend für eine statistisch signifikante Unterscheidung ist. Aufgrund der Notwendigkeit, für weitere Verbesserungen der Prozesse in der Produktion ein geeignetes Messsystem zu haben, wurden alternative Gradiententests untersucht. Neben Mehrfachinjektionen des zu untersuchenden Materials wurden auch Versuche mit einer deutlich verlängerten isokratischen Zeitspanne durchgeführt. Dieses soll den oben beschrieben praktischen Einsatz einer HPLC-Anlage zur Prozesskontrolle in der Produktion mit langen Standby-Zeiten abbilden. Für die in Abb. 2 nach dieser Methode gemachten Chromatogramme wurden die gleichen zufällig ausgewählten Proben wie oben verwendet. Die Messungen wurden auf einem HPLC-Gerät von Shimadzu (LC-10VP) durchgeführt. Die Säule (100 mm, 4mm Id) war gepackt mit Nucleosil C18. Bei einem Fluss von 1,8 ml/min enthielt die mobile Phase die ersten 60 min 10 % Acetonitril. Ab dann wurde der Anteil innerhalb von 17 min auf 90 % gesteigert. Die Chromatogramme wurden bei 210 nm detektiert Intensity / mabs Competitor 1 Competitor 2 Competitor 3 Competitor 4 Competitor 5 Honeywell Time / min Abb. 2: Vergleich verschiedener HPLC-Gradientenqualitäten nach 60 min Vorlaufzeit.

5 In Abb. 2 lassen sich deutliche Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Herstellern erkennen. Besonders dramatisch sind offensichtlich die bei Probe 2 resultierenden Signale. Wenn diese auch nur die Nähe der in einer Applikation gesuchten Analyten fallen, wird eine quantitative Auswertung extrem schwierig, wenn nicht unmöglich. Selbst eine Ware, die bei dem normalen Test (Abb. 1) gut abgeschnitten hat (Competitor 5), sieht unter diesen Bedingungen plötzlich ganz anders aus. Die Basislinienanhebung hat sich durch die Anreichung im Vorfeld des Gradienten verdoppelt. Die Honeywell-Ware ist mit einer geringen Basislinienanhebung und praktisch ohne Signal in beiden Fällen in der Spitzengruppe. Aufgrund der Tatsache, dass dies Einzelmessungen sind, kann es sich natürlich nur um eine Momentaufnahme für diese spezifischen Chargen handeln. Trotzdem ist die Bandbreite der beobachteten Qualitäten doch erheblich. Und dies, obwohl nach der Produktbeschreibung und teilweise auch nach der Spezifikation alle diese Materialien gleichwertig sein sollten. Fazit: Ein einfacher Gradiententest kann nur einen ersten Eindruck über die Qualität eines Lösungsmittels vermitteln. Die Durchführung lässt Freiraum für Unterschiede bei einzelnen Herstellern, die die große Varianz trotz gleicher Spezifikation unter den Herstellern erklären können. Es kann also durchaus zu Überraschungen führen, eine HPLC-Gradientenqualität nur aufgrund von Spezifikation und Preis zu kaufen. Eine bessere Aussagekraft kann erreicht werden, wenn der Anreicherungseffekt au der Trennsäule bei geringer Acetonitrilkonzentration in der mobilen Phase zur Steigerung der Nachweisgrenze verwendet wird. So lassen sich deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen Proben erkennen. Letztlich zählt für jeden Anwender die Erfahrung mit den Lösungsmitteln in seiner Applikation auf seinem Gerät.

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