Die -omics. Metabolomics. Institut für angewandte Biowissenschaften. Methoden HPLC / GC GC/MS LC/MS

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1 Die -omics Methoden zur Analyse des Zellstoffwechsels, Abteilung Angewandte Biologie DNA (Gene) Genom mrna Transkriptom Proteine Proteom Stoffwechsel Metabolom Genomics - Gesamtheit aller Gene - Vorhersage bestimmter Fähigkeiten - Grundsätzliche Lebensweisen - Potentielle biotechnologische Anwendungen Genomgrößen - E. coli: 4.6 x 10 6 bp 4500 Gene - S. cerevisiae: 2 x 10 7 bp 6000 Gene - H. sapiens: 3.3 x 10 9 bp Gene Die -omics Transcriptomics Gesamtheit der mrna Aussage über Aktivität der Gene Genetische Reaktion der Zellen auf Stimuli Bindeglied zwischen Genom und Proteom Proteomics Gesamtheit aller exprimierten Proteine Finale Diskrepanz zwischen Genaktivität und zellulärem Verhalten Tatsächliche biochemische Eigenschaften der Zelle Metabolom: Gesamtheit aller Stoffwechseleigenschaften eines Gewebes bzw. einer Zelle : Erforschung der Wechselwirkungen aller Metabolite und deren Identifikation Vom CO 2 zum Zucker Reduktiver AcetylCoA-Weg Methoden HPLC / GC Nuclear Magnetic Resonance Spektroskopie NMR Ionen-Mobilitäts Spektrometrie Massenspektrometrie MS GC/MS LC/MS HPLC/MS 3-OH-Propionat-Weg 4-OH-Butyrat-Weg Reduktiver Reduktiver Pentosephosphat-Weg Citratzyklus Ivan A. Berg Appl. Environ. Microbiol. 2011;77:

2 Absorptionseigenschaften einer Substanz Chemische Unterschiede Physikalische Eigenschaften Chromatographie Chromatographie - HPLC Trennung der Analyte durch zwei nicht miteinander mischbare Phasen Analytisch und präperativ Dünnschicht-Chromatographie (DC / TLC) Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Gas Chromatography (GC) Stationäre Phase: Cellulose, SiO 2, Al 2 O 3, C 2 C x, Methylsilicon Mobile Phase: Hexan, Toluol, MeOH, Acetonitril, CCl4, Aceton, EtOH, Tetrahydrofuran, Chloroform, N 2, H 2, NMR Nuclear Magnetic Resonance NMR Nuclear Magnetic Resonance Felix Bloch und Edward M. Purcell 1946 Nachweis Signal magnetischer Kernresonanz - Nobelpreis 1952 Rotierende Atomkerne = rotierende Ladung Kreisförmiger Stromfluss induziert magnetisches Feld 1 H, 13 C, 14 N, 15 N, 31 P 1 H und 31 P nahe 100% in biologischen Proben 15 N und 13 C seltene Isotope Ausrichtung innerhalb eines angelegten Magnetfeldes Aufgenommene Resonanzenergie Spezifität durch magnetischen Einfluss umgebender Atome (3 Bindungen) FID NMR Spektrum NMR Chromatogramm

3 Massenspektrometrie Grundprinzip der Massenspektrometrie ist es, aus anorganischen oder organischen Substanzen in geeigneter Weise Ionen zu erzeugen, diese Ionen nach ihrer Masse und Ladung zu trennen und sie mit einem Registriersystem nach Masse und Häufigkeit qualitativ und quantitativ zu erfassen. Die Ionisation der Substanzen kann thermisch, durch elektrische Felder oder durch Beschuss der Probe mit Elektronen, Ionen oder Photonen erfolgen. Die im allgemeinen positiven Ionen können einzelne ionisierte Atome oder Cluster, ionisierte Moleküle, deren Bruchstücke oder Assoziate sein. Die Ionentrennung erfolgt durch statische oder dynamische elektrische und magnetische Felder oder auch durch die Flugzeit. (Kienitz, 1968). Massenspektrometrie - Ionenquelle Methode englische Bezeichnung Abk. ionisierendes Agens Typ Elektronenstoß-Ionisation Electron Impact Ionisation EI Elektronen G Chemische Ionisation Chemical Ionisation CI ionische Reaktandgase G Feldionisation Field Ionisation FI elektrisches Feld G Felddesorption Field Desorption FD elektrisches Feld D Beschuss mit schnellen Atomen Fast Atom Bombardement FAB energiereiche Atome D Atmosphärendruckionisation Atmospheric Pressure Ionisation API thermische Elektronen S Laserdesorption Laser Desorption LD Laser D Photoionisation Photoionisation PI Photonen D Aufbau eines Massenspektrometers Ionenquelle Analysator Detektor Joseph J. Thompson elektr. Leitfähigkeit von Gasen 1906 Nobel Francis W. Aston 1. MS (1919) 1922 Nobel Wolfgang Paul & Hans Dehmelt Ionenfalle 1989 Nobel John B. Fenn ESI 2002 Nobel Koichi Tanaka LD 2002 Nobel Elektrospray-Ionisation Electrospray Ionisation ESI elektrisches Potential S Thermospray-Ionisation Thermospray Ionisation TS thermische Energie S Plasmadesorption Plasmadesorption PD Cf252-Zerfallsnullide D Sekundärionen-MS Secondary Ion Mass Spectrom. SIMS energiereiche Ionen D Thermodesorption Thermodesorption TD thermische Energie D Typ: G... Gasphasenionenquelle; D... Desorptionsquelle; S... Spray Ionenquelle Massenspektrometrie - ESI Massenspektrometrie - Analysator Trennung der erzeugten Ionen (Masse:Ladung) Flugzeit: TOF Filterung in elektrischen Wechselfeldern: Ionenfalle, Quadrupol Ablenkung in elektrischen und/oder magnetischen Feldern Auch Kombinationen möglich: Tandem-MS, MS/MS Massenspektrometrie - Quadrupole Massenspektrometrie - Detektoren Fotoplatten Sekundärelektronenvervielfacher Array-Detektoren focussing of ions - potential gradient to middle axis selection of ions: resonance energy Thermo Scientific

4 MS ESI-Quadrupole-Collision Cell-Orbitrap Fourier-Transformation Algorythmische Transformation einer Inteferenzwelle in ihre ursprünglichen Ausgangswellen Transformation der Frequenzmuster (zeitabhängig) in Chromatogramm (Masse/Ladung) Kombinationen Anwendung in der Forschung HPLC / GC - Retentionszeiten Massenspektren Masse/Ladung bzw. Masse Datenbank-Analyse 21. gi Mass: Score: 537 Queries matched: 25 empai: 0.67 kda WT Δstc ΔfccA ΔstcΔfccA nrfa gene product [Shewanella oneidensis MR-1] Query Observed Peptide K.LAQLLAK.K R.ISRPYVDR.A K.LKAEEQLVK.A R.ALDAIGTPFSK.A K.EFLVGVTNER.K R.GHMYAVTDVR.N K.AQAVLGMDMEK.M K.AQAVLGMDMEK.M K.GLTDPVAIPDISTK.A R.LIEEQGEDGYFK.G K.KGLTDPVAIPDISTK.A K.AWELGATEAEMKPILTDIR.H Anaerobe Atmungswege in S. oneidensis Aerob Anaerob Eisen Mangan DMSO TMAO Nitrat Fumarat U(VI) Cr(VI) Anwendung in der Forschung Fragestellung Methoden Ergebnisse Interpretation Fazit

5 Orbitrap - Detektor dezentral but vertical injection! special geometry - ions start to oscillate along z- axis oscillation produce image current at the outer electrodes MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization Time of flight) Detektor Analyzer Region Thermo Scientific Fourier Transformation frequency/ intensity spectrum Frequencies are converted into m/z: m/z = k* E/f mass spectrum kv Ion Source