Das Verhalten von Benzotriazolen in Abwasserreingungsanlagen

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1 Das Verhalten von Benzotriazolen in Abwasserreingungsanlagen Als DIPLOMARBEIT eingereicht an der Fachhochschule Wels zur Erlangung des akademischen Grades Diplom-Ingenieur (FH) von Thomas Hinterbuchner 2006

2 Fachhochschul-Diplomstudiengang Bio- & Umwelttechnik Das Wasserforschungsinstitut des ETH Bereichs, Schweiz Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Februar 2006 bis Juli 2006 in der Abteilung Umweltchemie der Eawag in Dübendorf, Schweiz angefertigt. Betreuerin FH: Betreuer Eawag: DDI Mag. Michaela Kröppl, Msc. Dr. Christa McArdell, Dr. Hans-Peter Kohler Eva Molnar (Labor), Christian Schaffner (Analytik)

3 Danksagung Bedanken möchte ich mich bei der gesamten Abteilung Umweltchemie an der Eawag für viele hilfreiche Diskussionen, im Speziellen bei Eva Molnar, Christian Schaffner, Heinz Singer und im Weiteren Dr. Hans-Peter Kohler von der Abteilung Umweltmikrobiologie. Besonderer Dank gebührt Dr. Christa McArdell für die sehr gute Betreuung in der Schweiz und für die tatkräftige Unterstützung bei allfälligen Fragen und Problemen bei der selbstständigen Erarbeitung des Themas. Im Weiteren gebührt DDI Mag. Michaela Kröppl, Msc. Dank für die Betreuung seitens der FH Wels. Ich danke Herrn KommR Viktor Sigl für die Unterstützung in Form einer Sonderförderung des Landes Oberösterreich. Recht herzlich danken möchte ich meiner Familie, die mir den Aufenthalt in der Schweiz finanziell ermöglichte und mich zu jeder Zeit bei meinem Vorhaben unterstützte.

4 Inhaltsverzeichnis Inhalt Zusammenfassung 6 Abstract 7 1. Einleitung Benzotriazole Eigenschaften von Benzotriazolen Umweltrelevante Aspekte der Benzotriazole Eintragswege in die Umwelt Persistenz Toxizität Analytische Grundlagen Solid Phase Extraction (SPE) High performance liquid chromatography (HPLC) Massenspektrometrie Zielsetzung Hintergrund Aufgabenstellung Material und Methoden Verwendetes Material Verwendete Chemikalien Instrumente Abwasserreinigungsanlagen ARA Kloten-Opfikon ARA Thunersee ARA Altenrhein Hergestellte Lösungen Solid phase extraction (SPE) LC/MS/MS Analyse API 4000 (Methode 1) TSQ Quantum (Methode 2) Quantifizierung 34

5 Inhaltsverzeichnis 3.7. Abbauversuche, ARA Kloten-Opfikon und Thunersee Allgemeine Beschreibung der Abbauversuche Vorversuch Bestimmung der Trockensubstanz des eingesetzten aktivierten Klärschlammes Vergleichssubstanz Biologischer Abbau Negativkontrolle Probenahme Vergleich des Trägerbiologieverfahren mit dem konventionellen Belebtschlammverfahren in der ARA Altenrhein Probenvorbereitung und Analyse in der ARA Altenrhein Ergebnisse Vorversuch Vergleichssubstanz Wiederfindung im Abwasser der ARA Kloten-Opfikon und der ARA Thunersee Trockensubstanzen der verwendeten Belebtschlämme Abbauversuche Erster Abbauversuch zur Bestimmung der zeitlichen Abfolge der Probenahme Abbauversuch mit Klärschlamm der ARA Kloten-Opfikon Abbauversuche mit Klärschlamm der ARA Thunersee Verteilungskoeffizient Festphase zu Wasser (K d ) Vergleich Festbettreaktor- und Belebtschlammverfahren Diskussion Literatur Anhang Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungen 72

6 Zusammenfassung Zusammenfassung Benzotriazole werden in verschiedenen Bereichen als Additive eingesetzt, um der Korrosion von metallischen Oberflächen entgegenzuwirken, so zum Beispiel als Silberschutzmittel in Geschirrspülmitteln. Durch die Anwendung dieser Substanzen im industriellen sowie auch im privaten Bereich gelangen diese in die Umwelt und wurden auch im Grundwasser gefunden. In Abwasserreinigungsanlagen (ARAs) werden diese Substanzen unterschiedlich stark eliminiert. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, welche Prozesse für die unterschiedliche Elimination in den Reinigungsanlagen verantwortlich sind. Außerdem sollten zwei unterschiedliche Reinigungstechnologien verglichen werden, um eventuelle Unterschiede in der Reinigungsleistung zu ermitteln. Um das Verhalten der Benzotriazole zu untersuchen, wurden kontrollierte Abbauversuche im Labormaßstab durchgeführt. Dabei wurden Klärschlämme aus zwei ausgewählten Abwasserreinigungsanlagen verwendet und mit den Benzotriazolen versetzt. Durch die Durchführung von Negativkontrollen und durch den Einsatz einer Vergleichssubstanz sollten die Prozesse eruiert werden, welche zur Elimination beitragen. Für den Vergleich der unterschiedlichen Reinigungstechnologien wurden Sammelproben von definierten Probenahmestellen aus der Kläranlage entnommen. Die Proben wurden einer Aufbereitung mittels Festphasenextraktion (SPE) unterzogen und anschließend mit LC/MS/MS analysiert. Die Resultate zeigen, dass in der ARA Kloten-Opfikon Benzotriazol bis zu 20% eliminiert wird. Methylbenzotriazol zeigt eine Elimination von 15-20%. In der ARA Thunersee werden ca. 40% Benzotriazol und ca. 23% Methylbenzotriazol eliminiert. Der Prozess, der für diese Elimination von Bedeutung ist, ist bei Kloten-Opfikon ausschließlich Adsorption an die Klärschlammpartikel. In der ARA Thunersee sind bei Benzotriazol ca. 20% auf Sorption und 20% auf biologischen Abbau zurückzuführen, wohingegen Methylbenzotriazol zur Gänze durch Sorption entfernt wird. Der Vergleich der Reinigungstechnologien zeigt für Benzotriazol eine bessere Reinigungsleistung bei Einsatz eines Festbettreaktors (Elimination 48%) im Vergleich zum konventionellen Belebtschlammverfahren (Elimination 33%). Methylbenzotriazol zeigt keine Eliminationsunterschiede in beiden Verfahren (ca. 12%)

7 Abstract Abstract The complexing agents Benzotriazole and Tolyltriazole are not only widely used as anticorrosives (e.g. in engine coolants or in antifreezing liquids) but also for so-called silver protection in dish washing liquids. Different concentration of Benzotriazoles can be detected in wastewater and also in very low concentrations in ground and drinking water. The motivation for the thesis was the result of a foregone study where varying elimination rates of Benzotriazole and Tolyltriazole in different wastewater treatment plants (WWTP) were found. The aim of this thesis was to study the processes responsible for the different elimination rates (e.g. microbial degradation or sorption). Furthermore, two different treatment technologies should be compared to reveal if they show different elimination efficiencies for Benzotriazoles. The studies of the microbial degradation were done in controlled laboratory experiments. Activated sludge from the WWTP Kloten-Opfikon and Thunersee were taken and Benzotriazole and Methylbenzotriazole were spiked in known concentration. Samples were taken in certain time intervals. For the comparison of two different treatment technologies in full scale plants samples were taken at in- and outflow. The sample preparation was done by solid phase extraction (SPE). For the analysis of Benzotriazole and Methylbenzotriazole high pressure liquid chromatography (HPLC) coupled with tandem mass spectrometry (MS/MS) was used. The results of the study are that Benzotriazole is eliminated to about 20% and Methylbenzotriazole to 15-20% at the WWTP Kloten-Opfikon due to sorption processes. At the WWTP Thunersee Benzotriazole is eliminated to about 40% where 20% are due to sorption and 20% due to biological degradation. Methylbenzotriazole is eliminated to about 23% due to sorption processes. The comparison of the two different treatment technologies shows that the fixed bed reactor exhibits a higher elimination for Benzotriazole (48%) than the conventional activated sludge treatment (33%). For Methylbenzotriazole no difference in elimination was found for the two investigated technologies (both 12%)

8 Einleitung 1. Einleitung 1.1. Benzotriazole Das Problem, dass viele metallische Oberflächen einer gewissen Korrosion durch Oxidation unterliegen, ist weit verbreitet und bekannt. Eine Möglichkeit, um diesen unerwünschten Erscheinungen entgegen zu wirken, ist der Einsatz verschiedenster Chemikalien, so genannter Korrosionsschutz-Additive. Sehr verbreitet sind Benzotriazole, die mit Metallen starke Komplexe bilden können, was auch der Grund dafür ist, dass sie einer breiten Palette von Produkten als Korrosionsinhibitoren beigefügt werden. Hierzu gehören z.b. 1H-Benzotriazol und Tolyltriazol, eine Mischung aus 4- und 5-Methyl-1H-Benzotriazol, welche in folgenden Bereichen als Korrosionsschutzadditive eingesetzt werden: Flugzeugenteisungsmittel und Flugzeugantieisungsmittel (Cancilla D.A. et al. 2003) Frostschutzmittel in Kraftfahrzeugen (Cancilla D.A. et al. 2003) Kühlflüssigkeiten in Kraftwerken und Kraftfahrzeugen (Callender T. and Davis L.C. 2002) Bremsflüssigkeiten (Pillard D.A. et al. 2001) Schneidflüssigkeiten (Pillard D.A. et al. 2001) Eine weitere Anwendung finden sie in Geschirrspülmitteln (Giger W. and Schaffner C. 2004) als Silberschutz, was auch der wichtigste Eintragsweg ins kommunale Abwasser ist. Ferner werden Benzotriazole als antifoggant (Antibeschlagsmittel) in der Photographie eingesetzt (Pillard D.A. et al. 2001; Callender T. and Davis L.C. 2002). Neben der oben erwähnten Eigenschaft (starke Komplexbildung mit Metallen), verfügen sie weiters auch über eine hohe Stabilität gegenüber UV Strahlung, was den Einsatz als Stabilisatoren in Kunststoffen erklärt. In diesem Bereich wird hauptsächlich das Chlorbenzotriazol verwendet (Katritzky A.R. and Rogovoy B. 2003; Hart D.S. et al. 2004; Hem L.J. et al. 2003)

9 Einleitung Durch die zahlreichen Einsatzbereiche im privaten wie im industriellen Bereich stellen die Benzotriazole ein hohes Belastungspotential für die Umwelt dar. Untersuchungen von Flugzeugenteisungsmittel (aircraft deicing fluids, ADFs) waren ausschlaggebend für die Entdeckung der Benzotriazole als für die Umwelt relevante Verbindungen. ADFs werden in großem Maßstab eingesetzt und wurden in diversen Studien auf ihr Gefährdungspotential hin untersucht. Diese Untersuchungen deuteten an, dass auch von diversen anderen Bestandteilen, die in ADFs vorhanden sind, wie Flammschutzmittel, Korrosionsschutzmittel oder Farbstoffe, eine Gefährdung der Umwelt ausgehen kann (Pillard D.A. et al. 2001). Weitere Untersuchungen ergaben, dass die in ADFs enthaltenen Benzotriazole im Microtox- Testverfahren signifikante toxische Wirkung zeigten und eine der primären microtoxaktiven Substanzen in ADFs sein könnten (Cancilla D.A. et al. 2003) H N H 6 1 N1 N N 2 N N H 3 C H 1 N N N 3 2 CH 3 1H-Benzotriazol 5-Methyl-1H-Benzotriazol 4-Methyl-1H-Benzotriazol Tolyltriazol Abb. 1: In der Diplomarbeit bearbeitete Benzotriazole 1.2. Eigenschaften von Benzotriazolen Benzotriazole und methylierte Benzotriazole sind heterocyclische stickstoffhaltige Verbindungen. Die Substanzen weisen eine gute Wasserlöslichkeit auf. 1H- Benzotriazol hat eine Wasserlöslichkeit von 28 g/l und Tolyltriazol (Isomerengemisch aus 4-Methyl-1H-Benzotriazol und 5-Methyl-1H-Benzotriazol) von 7 g/l (Voutsa D. et al. 2006). Die Wasserlöslichkeit ist abhängig von der Art der Substituenten am Benzolring

10 Einleitung Benzotriazole sind Säuren mit zwei pks-werten. In wässrigen Lösungen können somit drei Spezies vorliegen. Benziotriazole liegen zwischen einem ph von 1,6 und 8,2 in der Neutralform vor. Oberhalb von ph 8,2 dominiert das Anion und unterhalb ph 1,6 dominiert das Kation. H N N + N H pks 1,6 pks 8,2 -H + +H + N N N H -H + +H + N N N - Abb. 2: pks- Werte von 1H-Benzotriazol Substanz pks- Wert 1 pks- Wert 2 Quelle 1H- Benzotriazol 1,6 8,2 (Schmitt T.) 5-Methyl-1H-Benzotriazol 1,65* 8,5 (Hart D.S. et al. 2004) 5,6-Dimethyl-1H-Benzotriazol 1,97* 9,28* *Berechnet mit Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V4.67 ( ACD/Labs) Tab. 1: pks- Werte von 1H- Benzotriazol, 5-Methyl-1H-Benzotriazol und 5,6-Dimethyl-1H-Benzotriazol (Lutze H. 2005) Benzotriazole sind Komplexbildner und sind in der Lage mit Kupfer wasserunlösliche Komplexe zu bilden (Abu-Dalo M. and Hernandez M. 2003). Benzotriazole sind polarisierte Moleküle, sie besitzen drei freie Elektronenpaare an Stickstoffatomen und weisen ein permanentes Dipolmoment auf. Im Weiteren zeigen Benzotriazole eine gewisse Affinität zu organischen Phasen, was durch den Oktanol- Wasser-Verteilungskoeffizienten (K OW ) anschaulich gemacht wird (vergleiche Tab. 2), der ein Modellmaß für die Polarität bzw. Wasser-/Fettlöslichkeit der Chemikalie ist. Je höher der Koeffizient, desto stärker die Tendenz des Stoffes, sich z.b. im Fettgewebe von Organismen anzureichern

11 Einleitung Substanz Log K OW 1H-Benzotriazol 1,23 ±0,06 5-Methyl-1H-Benzotriazol 1,89 ±0,01 5-Chloro-1H-Benzotriazol 2,17 ±0,08 Tab. 2: log K OW Werte von Benzotriazolen (Hart D.S. et al. 2004) 1.3. Umweltrelevante Aspekte der Benzotriazole Eintragswege in die Umwelt Durch den Einsatz von Benzotriazol-hältigen Substanzen im industriellen sowie auch im privaten Bereich gibt es vielfältige Möglichkeiten, dass diese Substanzen in die Umwelt gelangen. Laut Studien gelangen 80% der Flugzeugenteisungsmittel über Aerosole durch Sprühverluste und durch die im Flugbetrieb auftretenden Scherkräfte in die Umwelt (Hartwell S. et al. 1995). Abschätzungen der U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA) ergaben, dass jährlich etwa 80 Millionen Liter von den eingesetzten Ethylen- oder Propylenglycol basierten Flugzeugent- und antieisungsmittel (ADFs) in amerikanische Oberflächengewässer gelangen (Cancilla D.A. et al. 2003). In einer Studie über den Verbleib und den Effekt von Flugzeugenteisungsmittel auf die Umwelt wurde ein Areal nahe des General Mitchell International Airports (Milwaukee, WI, USA) beprobt. Es wurden Flusswasserproben analysiert, wobei neben den Benzotriazolen auch andere Substanzen quantifiziert wurden. Gemessen wurden Konzentrationen von bis zu 1,7 mg/l an 4-Methylbenzotriazol und 2,2 mg/l an 5-Methylbenzotriazol (Cancilla D.A. et al. 2003). Durch die Anwendung in privaten Bereichen (hauptsächlich in Geschirrspülmitteln) können Benzotriazole über das Abwasser ebenfalls in die Umwelt gelangen. Benzotriazole sind auf Grund ihres permanenten Dipolmomentes gut wasserlöslich und somit mobil in wässrigen Systemen. Eine Studie, bei der die Zu- und Abläufe von zehn Abwasserreinigungsanlagen in der Schweiz beprobt wurden, ergab 1H-Benzotriazolkonzentrationen von µg/l und Tolyltriazolkonzentrationen von 0,2-5,6 µg/l in den Zuläufen der Abwasserreinigungsanlagen (Voutsa D. et al. 2006). Im Weiteren wurde durch die Analyse der Abläufe der Abwasserreinigungsanlagen (ARA) festgestellt, dass die

12 Einleitung Benzotriazole in der ARA nicht vollständig eliminiert werden und so in die Umwelt gelangen. Es zeigte sich eine stark variierende Elimination von fast keiner bis zu 60% für 1H-Benzotriazol und bis zu 70% für Tolyltriazol in den beprobten Abwasserreinigungsanlagen (Voutsa D. et al. 2006). In einer anderen Studie wurden ähnliche Konzentrationen im Zu- und Ablauf einer Kläranlage und nur kleine Eliminationsraten für Benzotriazol (19%) und Tolyltriazol (7%) gefunden (Weiss and Reemtsma, 2005). Dabei wurde eine analytische Methode entwickelt, um die beiden Isomere 4-MeBzTr und 5-MeBzTr aufzutrennen. Es zeigte sich, dass 4-MeBzTr keine Elimination aufwies und nur 5-MeBzTr während der Abwasserreinigung zu einem kleinen Teil eliminiert wurde (Weiss S. and Reemtsma T. 2005). Messungen in der Glatt (einem Fluss im Kanton Zürich), die bis zu 10% aus gereinigtem Abwasser besteht, zeigte eine 1H-Benzotriazolkonzentration im Bereich von 0,6-3,7 µg/l und eine Tolyltriazolkonzentration im Bereich von 0,1-0,6 µg/l (Voutsa D. et al. 2006). Im größeren Rhein wurden niedrigere 1H- Benzotriazolkonzentrationen von 0,2-0,5 µg/l und Tolyltriazolkonzentrationen von 0,05-0,20 µg/l gemessen (Schaffner C. and Giger W. 2004). Erste Studien haben gezeigt, dass diese Substanzen im Rohwasser von Wasseraufbereitungsanlagen nachweisbar sind. Sie können aber durch Ozonierung weitgehend entfernt werden (Lutze H. 2005). Benzotriazole wurden auch im Grundwasser in Konzentrationen von 0,04 0,20 µg/l nachgewiesen. Diese Kontamination ist auf die Infiltration, eines mit Benzotriazolen belasteten Flusses zurückzuführen (Blüm W. et al. 2005) Persistenz In einer Studie über Benzotriazole als potentielle Nitrifikationshemmer in der Landwirtschaft wurde festgestellt, dass Benzotriazole eine nahezu konstante Inhibition der Nitrifikation in einem Zeitraum von 4 Wochen bewirken. Diese Ergebnisse beziehen sich auf einen landwirtschaftlichen Boden, der geringe Mengen an organischem Material enthielt (0,27%). Die oben erwähnte vierwöchige konstante Inhibition der Nitrifikation in Böden sowie die Stabilität der Benzotriazole in Gegenwart von UV- Strahlung deuten auf eine hohe Persistenz in natürlicher Umgebung hin (Callender T. and Davis L.C. 2002). In der Literatur wurden keine Angaben über die Persistenz in wässrigem Milieu gefunden. In einer Untersuchung im Rahmen einer Bachelorarbeit, in welcher die

13 Einleitung Ozonung von Benzotriazolen untersucht wurde und Benzotriazolstammlösungen regelmäßig photometrisch überprüft wurden, wurde eine Konstanz der Konzentration während mindestens zwei Monaten gefunden (Lutze H. 2005). Dies lässt vermuten, dass Benzotriazole auch in wässrigen Systemen persistent sind Toxizität In verschiedenen Studien wurde die Toxizität der Benzotriazole untersucht. Zur Anwendung kam der Microtox Lumineszenztest. Dabei werden lumineszierende Bakterien, meist Vibrio Fischeri mit der zu untersuchenden Substanz exponiert und die Lichtintensität bzw. die Abnahme der Lichtintensität aufgezeigt. Der EC 50 Wert stellt dabei jene Konzentration dar, bei der es in einer definierten Expositionszeit zu einem Lichtintensitätsverlust der lumineszierenden Bakterien von 50% kommt. Substanz EC 50 [mg/l] 5 Min 15 Min 1H-Benzotriazol 41,13 ±4,63 41,65 ±11,01 5-Methyl-1H-Benzotriazol 5,69 ±1,19 5,91 ±1,11 5,6-Dimethyl-1H-Benzotriazol 0,72 ±0,28 0,80 ±0,33 Tab. 3: EC 50 Werte von Benzotriazolen für eine Expositionszeit von 5 und 15 Minuten (Cancilla D.A. et al. 1997) Als weitere Kenngrößen kommen die Werte NOAEC (No observed adverse effect level concentration) und LOAEC (lowest observed adverse effect concentration) zur Anwendung. Der LOAEC ist definitionsgemäß die niedrigste Dosis (Expositionskonzentration) eines verabreichten chemischen Stoffes, bei der eine toxische Wirkung im Tierexperiment nachgewiesen wurde. Der NOAEC stellt definitionsgemäß die höchste Dosis (Expositionskonzentration) dar, bei der keine schädlichen (toxischen) Befunde beobachtet werden. In einer Studie über die Toxizität von Benzotriazol und Benzotriazolderivaten auf drei aquatische Spezies wurde der NOAEC und LOAEC mit Ceriodaphnia dubia und Pimephales promelas bestimmt

14 Einleitung Substanz C. dubia (48 h Expositionszeit) [mg/l] P. promelas (96 h Expositionszeit) [mg/l] NOAEC LOAEC NOAEC LOAEC Benzotriazol Methylbenzotriazol Methylbenzotriazol :1 Mix aus 4- und 5- Methylbenzotriazol Tab. 4: NOAEC und LOAEC Werte für Ceriodaphnia dubia (48 h) und Pimephales promelas (96 h) (Pillard D.A. et al. 2000) Betrachtet man diese Werte, so ist auffällig, dass mit zunehmendem Methylierungsgrad die Toxizität steigt. Im Weiteren ist zu beobachten, dass die Methylgruppe an der Position 5 des Benzotriazols eine größere Toxizität bewirkt. Die in Studien gemessenen Konzentrationen an Benzotriazolen in der Schweiz, siehe Punkt 1.3.1, sind unter den oben angeführten Werten und stellen somit ein geringes Gefährdungspotential dar. Die Anwendung von ADFs führt allerdings lokal zu hohen Belastungen mit Benzotriazolen. In einer Studie über das Vorkommen von Flugzeugent- und antieisungsmittel in Amerika wurden bei einem internationalen Flughafen Benzotriazolkonzentrationen von bis zu 126 mg/l und Konzentrationen an methylsubstituierten Benzotriazolen von bis zu 198 mg/l gemessen (Cancilla D.A. et al. 1998). Diese Konzentrationen übersteigen die EC 50 Werte (Tab. 3) um ein vielfaches, wodurch die Aussage getroffen werden kann, dass diese Einträge als umweltgefährdend betrachtet werden können

15 Einleitung 1.4. Analytische Grundlagen Solid Phase Extraction (SPE) Die Festphasenextraktion (Solid-Phase-Extraction, SPE) ist die am weitesten verbreitete Methode der Probenaufreinigung oder Probenanreicherung für die moderne Flüssigkeitschromatographie. Sie findet in nahezu allen Bereichen Anwendung, in denen chromatographische Analysentechniken eine Rolle spielen. Dazu gehören unter anderem die Analyse von pharmazeutischen Wirkstoffen und Metaboliten in Blutproben sowie auch die Anreicherung von Analyten der Wasseranalytik und der Umweltchemie. Bei der SPE werden die zu extrahierenden Komponenten auf speziellen Adsorbentien angereichert und anschließend mit einem Lösungsmittel eluiert. Durch Auswahl des Adsorbens (Festphasenmaterial) und eines geeigneten Elutionsmittels ist neben der Extraktion eine Abtrennung von Matrixbestandteilen möglich High performance liquid chromatography (HPLC) Die HPLC, high performance liquid chromatography oder high pressure liquid chromatography (alte Bezeichnung), stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit mittels einer flüssigen Phase (Eluent) unter hohem Druck über eine stationäre Phase (Trennsäule) transportiert wird. Die Auftrennung der Analyten erfolgt in der Trennsäule durch die unterschiedlich starken Wechselwirkungen der einzelnen Substanzen mit dem Säulenmaterial, wodurch sich für die einzelnen Substanzen unterschiedliche Retentionszeiten ergeben Massenspektrometrie Der Massenspektrometer ist ein Instrument welches entwickelt wurde, um Gasphasen-Ionen auf Grund ihres m/z (Masse zu Ladung)-Verhältnisses zu separieren. Das Herzstück ist der Analyser, der die Gasphasen-Ionen trennt

16 Einleitung Zusätzlich zum Analyser beinhaltet ein Massenspektrometer: ein Vakuumsystem Instrumente zum Aufgeben der Proben (LC, GC,...) Instrumente,die Gasphasen Ionen aus den Probenmolekülen produzieren Instrumente zum Fragmentieren der Ionen, mit der Aufgabe Strukturinformationen oder mehr Selektivität bei der Detektion zu erhalten ein Detektionssystem eine Software und EDV Mehrere MS können auch kombiniert werden. Die im ersten MS isolierten Ionen werden in den weiteren MS fragmentiert und die Fragmente isoliert. Dadurch erhält man eine bessere Selektivität und Sensitivität. LC/MS/MS ist eine Technik, die die Trennleistung einer HPLC mit der Detektionsleistung eines Tandem Massenspektrometers koppelt

17 Zielsetzung 2. Zielsetzung 2.1. Hintergrund Hintergrund und Motivation der Arbeit war eine Studie (Voutsa D. et al. 2006), bei der die Eliminationsraten in zehn ARAs bestimmt wurden. Es zeigten sich Unterschiede in der Effektivität der ARAs im Bezug auf die Elimination der Benzotriazole (Abb. 3). Im Rahmen des Berufspraktikums wurden erste Abbaustudien von Benzotriazolen durchgeführt. Die Resultate dieser Arbeit stellten interessante Aspekte für die Weiterarbeit dar. Konzentration [µg/l] Benzotriazol Zulauf Benzotriazol Ablauf Tolyltriazol Zulauf Tolyltriazol Ablauf FR SA SO MO DI MI DO Konzentration [µg/l] FR SA SO MO DI MI DO Abb. 3: Darstellung der Wochengänge der ARA Kloten-Opfikon (links) und ARA Thunersee (rechts) (Voutsa D. et al. 2006) 2.2. Aufgabenstellung Im Rahmen der Diplomarbeit sollten Abbaustudien in Laborexperimenten durchgeführt werden, um detailliertere Kenntnis über den Verbleib von Benzotriazolen in ARAs zu erhalten. Die Ergebnisse sollten zeigen, wie sich die Benzotriazole innerhalb der Aufenthaltszeit im Belebtschlammbecken der beprobten Kläranlagen verhalten, und welche Mechanismen bei der Elimination eine Rolle spielen. Es sollte abgeklärt werden, ob Adsorption der Substanzen an die Klärschlammpartikel bei der unterschiedlichen Elimination in ARAs eine Rolle spielt. Für die Abbauversuche wurden Versuche mit Klärschlamm aus zwei ARAs durchgeführt, die unterschiedliche Eliminationsleistungen aufweisen. Es sollten die Substanzen 1H-Benzotriazol und 5-Methyl-Benzotriazol verwendet werden, welche in großen Konzentrationen in den ARAs auftreten. Die Analyse der Proben wird mit LC/MS/MS durchgeführt

18 Zielsetzung Im Weiteren sollte überprüft werden, ob es bei Verwendung verschiedener Abwasserreinigungsverfahren Unterschiede in der Elimination der untersuchten Substanzen gibt. Verglichen werden sollte ein Festbettreaktor mit einem Belebtschlammverfahren in der ARA Altenrhein, die beide Methoden zur Abwasserreinigung parallel betreiben

19 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1. Verwendetes Material Verwendete Chemikalien Bezeichnung Summenformel Marke Reinheit 1H-Benzotriazol C 6 H 5 N 3 Fluka 99% 5-Methyl-1H-Benzotriazol C 7 H 7 N 3 Aldrich 98% 5,6-Dimethyl-1H-Benzotriazol C 8 H 9 N 3 Fluka 99% Methanol, HPLC grade CH 3 OH Scharlau 99,98% Ameisensäure HCOOH Fluka 98% Natriumazid N 3 Na Fluka 99,5% Phenoxyessigsäure C 6 H 5 OCH 2 COOH Aldrich 99% Phenoxyessigsäure, Na-Salz C 6 H 5 OCH 2 CO 2 Na* 1 / 2 H 2 O Aldrich 98+% Benzoesäure C 6 H 5 COOH Aldrich 99% Dichlormethan CH 2 Cl 2 Merck 99% Salzsäure HCl 20% Merck 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure Cl 2 C 6 H 3 OCH 2 COOH Riedel-de Haen Pro analysi Wasser, HPLC grade Scharlau Tab. 5: Verwendete Chemikalien

20 Material und Methoden Instrumente Bezeichnung Typ Marke Magnetrührer COMBIMAG RCT IKA Labortechnik Analysenwaage AE200 Mettler Waage PM4800 DeltaRange Mettler Waage PM480 DeltaRange Mettler ph-meter 713-pH-Meter Metrohm SPE Kartuschen OASIS HLB 3cc, 60mg, 3 ml Waters SPE Apparatur Spe-12G BAKER HPLC Trennsäule 1 1 CC125/2 NUCLEOSIL C8 ec 2 LiChroCART HPLC Trennsäule 2 LiChrospher 100, RP-18 (5µm) MACHEREY- NAGEL Merck KGaA HPLC 1 1 Serie 1100 Hewlett Packard HPLC 2 2 Rheos 2000 Flux instruments Autosampler 1 1 Serie 1100 Agilent Autosampler 2 2 HTC PAL CTC Analytics AG Tandem MS 1 1 MDS SCIEX API 4000 LC/MS/MS Applied Biosystems Tandem MS 2 2 TSQ Quantum Thermo Electron Spritzenvorsatzfilter 25mm / 0,45 µm, Polyethersulfon Membran VWR International Glasfaser Mikrofilter GF/F Whatman Cellulose-Nitrat-Filter 0,45 µm Sartorius Einwegspritzen Omnifix 20 ml Braun 1 Analysenmethode siehe Punkt Analysenmethode siehe Punkt Tab. 6: Verwendete Instrumente

21 Material und Methoden 3.2. Abwasserreinigungsanlagen ARA Kloten-Opfikon Die ARA Kloten-Opfikon (K-O) hat eine Größe von Einwohnergleichwerte und ist im Kanton Zürich lokalisiert. Das Einzugsgebiet umfasst Einwohner und eine unbekannte Zahl an Flugpassagieren des Unique Airport Zürich. Die mittlere Zuflussrate (bei trockenem Wetter) beträgt m 3 /d. Ein Rechen, ein belüfteter Sandfang und ein Vorklärbecken bilden die erste Reinigungsstufe der Anlage. Ca. 60% des Zuflusses werden in ein Belebtschlammbecken geleitet (V= m 3 ), welches mit einem Schlammalter von drei Tagen und einer Verweildauer des Abwassers von fünf Stunden betrieben wird. Dieses Belebtschlammbecken wird zur Vorreinigung eingesetzt. Das eigentliche Belebtschlammbecken der Anlage beinhaltet eine Denitrifikation (V= m 3 ) und eine Nitrifikation (V= m 3 ). Die hydraulische Verweilzeit inklusive der Nachklärung beträgt ca. 15 Stunden, wobei das Abwasser für ca. 8 Stunden in dem Belebtschlammbecken verweilt. Phosphat wird durch Fällung mit Eisen durch die Zugabe von FeSO 4 entfernt. Nach einer Filtration durch diskontinuierlich betriebene Zweischichtsandfilter gelangt das gereinigte Abwasser in den Vorfluter, die Glatt. Der Sandfilter besteht aus 8 Kammern mit einem Gesamtvolumen von 288 m 3, welche aus einer 1,2 m dicken schieferhaltigen Schicht (Durchmesser 2-3 mm) und einer 0,4 m dicken Quarzsand- Schicht (Durchmesser 0,7-1,2 mm) besteht. Die Sandfiltereinheit wird täglich durch Rückspülen mit einer Kombination aus Filtrat und Luft gereinigt. Das schematische Fließbild der ARA Kloten-Opfikon ist in Abb. 4 gezeigt

22 Material und Methoden ~40% Primär schlamm ~60% Probenahme für Abbauversuche 1. Rechen 2. Belüfteter Sandfang 3. Vorklärbecken 4. Biologie Hauptstufe 5. Nachklärbecken 6. Teilstufe Biologie, alte Biologie 7. Sandfilter 6 Sekundär schlamm 4 5 Sekundär schlamm 7 Abfluss Abb. 4: Schematische Darstellung der ARA Kloten-Opfikon

23 Material und Methoden ARA Thunersee Die ARA Thunersee ist im Kanton Bern lokalisiert und ist für Einwohnergleichwerte konzipiert. Die mittlere Zuflussrate bei trockenem Wetter beträgt rund m 3 Abwasser pro Tag. Ein Rechen, ein belüfteter Sandfang und ein Vorklärbecken bilden die erste Reinigungsstufe der Anlage. Eine Besonderheit der ARA Thunersee ist die doppelte Ausführung ab dem Vorklärbecken, wo das Abwasser auf zwei Straßen aufgeteilt wird. Von den beiden Vorklärbecken wird eines als Reservebecken bei starken Regenfällen verwendet. Nach dem Vorklärbecken gelangt das Abwasser in die Belebtschlammbecken, die ein Gesamtvolumen von m 3 aufweisen. Diese beinhalten eine Denitrifikations- Zone (4 Becken mit je 930 m 3 ). Das Abwasser gelangt dann in die aerobe Zone, in welcher die Nitrifikation stattfindet. Die vier Becken haben jeweils ein Volumen von m 3. Die hydraulische Verweilzeit in der biologischen Reinigungsstufe beträgt 16 Stunden, wobei sich das Abwasser für ca. zwei Drittel der Zeit, knapp zehn Stunden in der aeroben Zone der biologischen Stufe befindet. Zur Entfernung des Phosphats wird Eisensulfat eingesetzt, welches allerdings in sehr geringen Mengen verwendet wird, da die Anlage das Phosphat größtenteils biologisch eliminieren kann. Der Ablauf der Belebtschlammbecken gelangt in die Nachklärung und anschließend in die Aare, dem Vorfluter der ARA Thunersee. Ein schematisches Fließbild der ARA Thunersee ist in Abb. 5 dargestellt

24 Material und Methoden Primär schlamm Probenahme für Abbauversuche 1. Rechen 2. Belüfteter Sandfang 3. Vorklärbecken 4. Biologie mit anaerober und aerober Zone 5. Nachklärbecken 4 5 Sekundär schlamm Abfluss Abb. 5: Schematische Darstellung der ARA Thunersee

25 Material und Methoden ARA Altenrhein Die Abwasserreinigungsanlage Altenrhein ist für Einwohnergleichwerte ausgelegt und ist im Kanton St. Gallen lokalisiert. Die Anlage hat einen durchschnittlichen Zufluss von m 3 Abwasser pro Tag bei trockenem Wetter. Die erste Reinigungsstufe besteht aus einem Rechen, einem belüfteten Sandfang und einem Vorklärbecken. Die Sekundärreinigung erfolgt nach zwei unterschiedlichen Anlagenkonzepten. Einerseits arbeitet die Kläranlage mit dem konventionellen Belebtschlammverfahren, andererseits mit dem Konzept eines Festbettreaktors. Beide Teile werden mit 50 % des Gesamtzuflusses beschickt. Die Belebtschlammbecken haben ein gesamtes Volumen von m 3 und beinhalten Denitrifikationsstufen (V= m 3 ) und aerobe Nitrifikationsstufen. Die hydraulische Verweilzeit im Belebtschlammbecken beträgt ca. 6 Stunden. Der Festbettreaktor arbeitet nach dem Prinzip des Festbett-Trägerbiologiesystem Biostyr. Der Festbettreaktor ist mit Biostyrkügelchen (Durchmesser 3 mm), die mit den Bakterien besiedelt sind, gefüllt. Das Gesamtvolumen des Festbettreaktors beträgt m 3. Das mechanisch gereinigte Abwasser wird gleichmäßig in acht Festbettkammern mit einem Volumen von je 168 m 3 gepumpt. Die Kammern werden von unten nach oben durchströmt, wobei das Abwasser zuerst die Denitrifikations- Zone (Gesamtvolumen von 504 m 3 ) und anschließend die Nitrifikations-Zone (Gesamtvolumen von m 3 ) passiert. Die mittlere Verweilzeit in dem Festbettreaktor beträgt ca. 20 Minuten. Die beiden Teilströme, der Ablauf des Nachklärbeckens und derjenige der Trägerbiologie, werden vor der Sandfiltration wieder vereint. Bei der Filtration gelangt das Abwasser zuerst in ein Kontakt- und Reaktionsbecken, in dem es zur Phosphatfällung mit Eisen durch Zugabe von Eisensulfat kommt. Im Weiteren werden acht Filter (Quarzsand) mit einer Höhe der Filterschicht von je 1,5 m parallel verwendet. Das Gesamtvolumen der Filter beträgt ca. 380 m 3. Die Filter werden kontinuierlich gereinigt. Dies erreicht man durch laufendes Hochpumpen des Sandes durch Mammutpumpen und durch den Einsatz von Sandwäschern, die starke Turbulenzen erzeugen, wodurch der Schmutz vom Sand gewaschen wird. Der gereinigte Sand fällt anschließend wieder auf das Filterbett zurück. Das Schlammwaschwasser wird vor die Rechenanlage der ARA gepumpt. Nach der Filtration gelangt das gereinigte Abwasser in den Alten Rhein bzw. in den Bodensee. Die schematische Darstellung der ARA Altenrhein ist in Abb. 6 gezeigt

26 50% 6 Sekundär Schlamm a) Prozessschlamm 7 Abfluss Material und Methoden Primärschlamm 50% Probenahmestellen zur Bestimmung der Eliminationsraten der beiden unterschiedlichen Technologien a) Rückspülung zur Beseitigung von Prozessschlamm 1. Rechen 2. Belüfteter Sandfang 3. Vorklärbecken 4. Belüftungs- und Belebungsbecken 5. Nachklärbecken 6. Festbettreaktor 7. Sandfilter Abb. 6: Schematische Darstellung der ARA Altenrhein

27 Material und Methoden 3.3. Hergestellte Lösungen 1H-Benzotriazol (BzTr)-Stammlösung Zur Herstellung der BzTr Stammlösung wurde in einen 10 ml Messkolben 50 mg eingewogen und mit Methanol bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung enthielt 5 mg/ml. 5-Methyl-1H-Benzotriazol (MeBzTr)-Stammlösung In einem 10 ml Messkolben wurden 50 mg MeBzTr in Methanol gelöst und bis zur Marke aufgefüllt, was einer Konzentration von 5 mg/ml entspricht. 5,6-Dimethyl-1H-Benzotriazol (DMBT)-Stammlösung In einem 10 ml Messkolben wurden 50 mg DMBT in Methanol gelöst und bis zur Marke aufgefüllt, was einer Konzentration von 5 mg/ml entspricht. Phenoxyessigsäure Stammlösung In einem 10 ml Messkolben wurden 50 mg Phenoxyessigsäure genau eingewogen, in Methanol gelöst und bis zur Ringmarke aufgefüllt. Die resultierende Konzentration betrug 5 mg/ml. Alle Stammlösungen wurden mit Methanol auf eine Konzentration von 5 µg/ml verdünnt. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) Ausgehend von der Stammlösung, mit der Konzentration von 1 mg/ml wurde eine Verdünnung hergestellt, die eine Konzentration von 5 µg/ml aufwies. Die Standards, welche BzTr, MeBzTr und Phenoxyessigsäure enthielten, wurden in der mobilen Phase für die HPLC Methode (Methanol : Wasser = 70:30) im Konzentrationsbereich von µg/l hergestellt

28 Material und Methoden 3.4. Solid phase extraction (SPE) Zur Entfernung störender Matrix für die LC/MS/MS Analyse wurde eine Festphasenanreicherung mit SPE Kartuschen OASIS HLB (Waters) durchgeführt. Im Weiteren wird eine Aufkonzentrierung um das Fünffache erreicht. Die SPE wurde nach einer von Christian Schaffner entwickelten Methode durchgeführt (Voutsa D. et al. 2006). Die SPE Kartuschen wurden mit ca. 6 ml Methanol konditioniert und anschließend mit Wasser gespült. Die Proben wurden mit Salzsäure (20%) auf einen ph Wert unter 3 angesäuert, wobei sich das Volumen der Probe nur unmerklich und ohne Auswirkung auf die Analyse veränderte. Die internen Standards wurden dann zudosiert (siehe Pkt. 3.6). Anschließend erfolgte die Beschickung der SPE Kartuschen mit der Probe (5 ml). Nachdem die Proben mit einer Durchflussrate von ca. 0,5 ml/min durchgelaufen waren, wurden die Kartuschen unter Vakuum für 10 min getrocknet. Für die Eluierung wurden 1,6 ml eines Gemisches von Dichlormethan und 3% Methanol verwendet. Das Eluat wurde in einem 2 ml Reacti-Vial aufgenommen. Die Verdampfung des Lösungsmittels bis fast zur Trockene erfolgte mit einem schwachen Stickstoffstrom. Aufgenommen wurde die Probe anschließend mit 1 ml eines Gemisches aus Methanol : Wasser (70 : 30). Die Überführung der Probe in die Autosampler Vials erfolgte quantitativ mit Pasteurpipetten. Die Verschließung der Autosampler Vials erfolgte mit 1 mm Crimp- Caps mit Septum. Die Proben wurden bis zur Analyse im Kühlschrank bei -40 C aufbewahrt LC/MS/MS Analyse Es kamen zwei verschiedene LC/MS/MS Systeme zur Anwendung. Zu Beginn wurde mit dem API 4000 gearbeitet, danach wegen Messkapazitätsengpässen mit dem TSQ Quantum. Beim API 4000 wurde versucht, die Substanzen in einer Methode zu analysieren. Beim TSQ Quantum wurden die Substanzen mit zwei separaten Methoden analysiert

29 Material und Methoden API 4000 (Methode 1) Die Analyse erfolgte in einer Methode, wobei zwischen negativem und positivem Ionisationsmodus gewechselt wurde. Für die Steuerung der HPLC und des Tandem MS, sowie für die Auswertung der Massenspektren wurde die Software Analyst verwendet. Die Daten wurden anschließend unter Zuhilfenahme von Microsoft Excel 2003 visualisiert. Abb. 7: Chromatogramm der API 4000 Methode Abb. 7 zeigt das Chromatogramm der API 4000 Methode. In der ersten Zeile ist das Gesamtchromatogramm aller Substanzen dargestellt, in der zweiten Zeile das BzTr, in der dritten Zeile das MeBzTr, in der vierten Zeile das DMBT und in der letzten Zeile die Phenoxyessigsäure. Das Chromatogramm zeigt, dass es zu keiner starken Auftrennung der Substanzen durch die HPLC Methode kommt Betriebsbedingungen für die HPLC Die mobile Phase wurde isokratisch geführt, das heißt, dass die Zusammensetzung der mobilen Phase während der gesamten Messung konstant blieb. Die Gesamtdauer der HPLC Methode betrug sechs Minuten. Als mobile Phase wurde ein

30 Material und Methoden Gemisch aus Methanol : Wasser : Ameisensäure (70 : 30 : 0,4) verwendet. Als Flussrate wurden 200 µl/min gewählt. Die Temperatur der Trennsäule wurde auf Raumtemperatur gehalten und das Einspritzvolumen betrug 20 µl. Für die Trennung wurde eine analytische Säule von Machery-Nagel (CC125/2 NUCLEOSIL C8 ec) verwendet Betriebsbedingungen des Tandem-Massenspektrometers Die Substanzen BzTr, MeBzTr und DMBT wurden mittels Elektrosprayionisation (ESI) im positiven Modus bei einer Spray Voltage von V und die Phenoxyessigsäure im negativen Modus bei einer Spray Voltage von V ionisiert. Die Temperatur der Ion transfer capillary betrug 390 C und die Substanzen wurden im MRM-Mode (multi reaction monitoring) im Tandemmassenspektrometer aufgezeichnet. Als Nebulizer Gas wurde Stickstoff verwendet. Die zur Quantifizierung verwendeten Ionenübergänge mit ein bis zwei Fragmentionen sind in der Tab. 7 dargestellt. Analyt Vorläuferion [m/z] Produkt-Ion 1 [m/z] Produkt-Ion 2 [m/z] BzTr 120,050 64,850 92,050 MeBzTr 133,850 76,850 78,950 DMBT 148,050 77,050 90,950 Phenoxyessigsäure 151,100 92,900 Tab. 7: Substanzspezifische MS/MS Parameter für das API

31 Material und Methoden TSQ Quantum (Methode 2) Für die Analyse der Substanzen wurden zwei Analysenmethoden entwickelt, basierend auf der Polarität der Ionisation. Phenoxyessigsäure und 2,4-D wurden negativ ionisiert, BzTr, MeBzTr und DMBT wurden positiv ionisiert. Der Grund für die Verwendung zweier separater Methoden war die Stabilisierungsdauer für die Spannung der Ionisation. Die Substanzen konnten mit der HPLC Methode nicht soweit aufgetrennt werden, um ein genügend großes Zeitfenster für den Wechsel der Polarität der Ionisationsspannung zu erhalten. Die Massenkalibration des Massenspektrometers wurde mit einer Polytyrosinlösung überprüft. Die HPLC sowie das Tandem MS wurden über die Software Xcalibur gesteuert und die Auswertungen der Massenspektren erfolgten ebenfalls mit Xcalibur. Visualisiert wurden die Daten der Auswertungen in Excel Abb. 8: Chromatogramm der TSQ Quantum Methode für Benzotriazol, Methylbenzotriazol und Dimethylbenzotriazol

32 Material und Methoden Abb. 9: Chromatogramm der TSQ Quantum Methode für Phenoxyessigsäure und 2,4-D In Abb. 8 ist das Chromatogramm von BzTr, MeBzTr und DMBT dargestellt. In der ersten Zeile ist das Benzotriazol, in der zweiten Zeile das Methylbenzotriazol und in der dritten Zeile das Dimethylbenzotriazol dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Substanzen mit der HPLC Methode nicht gut aufgetrennt werden, was allerdings nicht notwendig ist, da die Polarität der Ionisation während der gesamten Analyse positiv bleibt. Abb. 9 zeigt das Chromatogramm für Phenoxyessigsäure und 2,4-D. In der ersten Zeile ist die Phenoxyessigsäure und in der zweiten Zeile das 2,4-D dargestellt. Die beiden Substanzen werden auch hier nicht stark aufgetrennt, was allerdings wie bei den Benzotriazolen zu keinem Problem führt, da die Polarität der Ionisation während der gesamten Analysendauer negativ bleibt

33 Material und Methoden Betriebsbedingungen für die HPLC BzTr, MeBzTr, DMBT Als mobile Phase wurde ein Gemisch aus Methanol : Wasser : Ameisensäure (70 : 30 : 0,4) verwendet, welches isokratisch geführt wurde. Als Flussrate wurden 200 µl/min gewählt. Die Gesamtdauer der HPLC Methode betrug acht Minuten, wobei sich die Zusammensetzung der mobilen Phase und die Flussstärke nicht änderten. Die Temperatur der Trennsäule wurde bei 30 C gehalten, verwendet wurde eine LiChroCART LiChrospher 100, RP-18 (5µm) Säule von Merck KGaA. Das Einspritzvolumen durch den Autosampler betrug 20 µl. Phenoxyessigsäure, 2,4-D Als mobile Phase wurde ein Gemisch Methanol : Wasser (70 : 30) gewählt, welches isokratisch geführt wurde. Die Flussrate betrug 200 µl/min, welche sich über die Gesamtdauer der HPLC Methode von acht Minuten nicht änderte. Die Temperatur der Trennsäule (LiChroCART LiChrospher 100, RP-18 (5µm), Merck KGaA) betrug 30 C, das Einspritzvolumen 20 µl Betriebsbedingungen des Tandem-Massenspektrometers Nach der chromatographischen Auftrennung auf der analytischen Säule wurden die Analyten mit einem Tandem Quadrupol Massenspektrometer TSQ Quantum gemessen. Die Substanzen BzTr, MeBzTr und DMBT wurden hierzu mittels Elektrosprayionisation (ESI) im positiven Modus bei einer Spray Voltage von V und die Phenoxyessigsäure und das 2,4-D im negativen Modus bei einer Spray Voltage von V ionisiert. Die Temperatur der Ion transfer capillary betrug 350 C und die Substanzen wurden im SRM- Mode (selected reaction monitoring) im Tandemmassenspektrometer aufgezeichnet. Als Kollisionsgas wurde hochreines Argon (<99,998%) mit einem Druck von 1,5 mtorr verwendet. Für die Elektrosprayionisation (ESI) kam Stickstoff zur Anwendung. Die optimalen Elektrospray- und MS-Parameter wurden experimentell durch die Direkteinspritzung von Einzelsubstanzlösungen ermittelt. Die verwendeten Ionenübergänge sind in Tab. 8 dargestellt wobei die Kollisionsenergien [V] in den runden Klammern angegeben sind

34 Material und Methoden Analyt Vorläuferion [m/z] Produkt-Ion 1 [m/z] Produkt-Ion 2 [m/z] BzTr 120,1 65,11 (22) 92,06 (16) MeBzTr 133,9 77,07 (25) 79,08 (19) DMBT 148,1 77,08 (26) 93,07 (19) 2,4-D 218,9 161,00 (20) 125 (34) Phenoxyessigsäure 151,1 93,03 (19) 65,08 (33) Tab. 8: Substanzspezifische MS/MS Parameter für das TSQ Quantum 3.6. Quantifizierung Die Proben wurden jeweils gegenüber einer Standardgeraden in Methanol : Wasser (70 : 30) im Konzentrationsbereich von µg/l quantifiziert. Für die Bestimmung der Wiederfindung im Abwasser der ARA TH wurde filtriertes Abwasser aus dem Belebungsbecken verwendet. Es wurde eine Standardadditionsgerade im Konzentrationsbereich von µg/l hergestellt. Das Abwasser wurde mit Salzsäure (20%) auf einen ph Wert unter drei eingestellt. In genau 5 ml Probelösung wurden genau 50 µl DMBT (interner Standard für Benzotriazole) und genau 50 µl 2,4-D (interner Standard für Phenoxyessigsäure) mit einer Hamilton Mikroliterspritze pipettiert. Die Analyten BzTr, MeBzTr und Phenoxyessigsäure wurden in entsprechender Menge den Vials zugegeben, wobei wieder eine Hamilton Spritze verwendet wurde. Die weitere Vorgehensweise war wie in Punkt 3.4 beschrieben. Die gleiche Prozedur wurde mit Abwasser der ARA K-O durchgeführt, wobei DMBT auch als interner Standard für Phenoxyessigsäure verwendet wurde. Für die Bestimmung der Wiederfindung im Abwasser der Probenahmestellen der ARA Altenrhein wurden jeweils Doppelproben mit 100 µg/l BzTr bzw. MeBzTr angereichert. Verwendet wurde DMBT als interner Standard für die Analyten (BzTr und MeBzTr). Die weitere Vorgangsweise war wie in Punkt 3.4 beschrieben. Versuche mit Standardaddition haben gezeigt, dass nach einer SPE keine Matrixeffekte die Quantifizierung mit einer externen Kalibrationsgeraden störten und gute Wiederfindungen erreicht wurden (siehe Punkt 4.1.2)

35 Material und Methoden Für die Methode auf dem API 4000 wurde DMBT als interner Standard für alle Analyten (BzTr, MeBzTr, Phenoxyessigsäure) verwendet. Am TSQ Quantum wurde DMBT als interner Standard für BzTr und MeBzTr und 2,4-D als interner Standard für Phenoxyessigsäure verwendet. Für die eindeutige Identifizierung der Analyten wurden für die Verbindungen mindestens zwei Ionenübergänge aufgenommen (siehe Tab. 7 und 8). Für die Quantifizierung wurde pro Substanz der jeweils intensivste Ionenübergang (Quantifier) ausgewählt. Um die Menge an Analyten zu bestimmen, die vorweg in der natürlichen Abwassermatrix vorhanden war, wurden jeweils mindestens zwei Proben, die nicht aufgestockt wurden, mitgemessen. Der LOQ (limit of quantification, Bestimmungsgrenze) der verwendeten Methode am API 4000 bzw. am TSQ Quantum ist in Tab. 9 dargestellt. Matrix LOQ [µg/l] Anreicherungs- BzTr MeBzTr faktor Bemerkung Flusswasser API 4000 (Voutsa 0,03 0,01 25 D. et al. 2006) Abwasser ARA Thunersee 0,23 0,25 5 TSQ Quantum Abwasser ARA Kloten-Opfikon 0,34 0,22 5 TSQ Quantum ARA Altenrhein nach VKB 0,46 0,39 25 TSQ Quantum ARA Altenrhein nach FB 0,32 0,33 25 TSQ Quantum ARA Altenrhein nach NKB 0,35 0,31 25 TSQ Quantum Tab. 9: Darstellung der LOQ Werte der verwendeten Gerätetypen in verschiedenen Matrizes Der LOQ für Flusswasser wurde ermittelt als die zehnfache Standardabweichung der Messungen. Die restlichen LOQ Werte wurden durch Extrapolation über das Signal to Noise (S/N) Verhältnis bestimmt und ist definiert als S/N =

36 Material und Methoden Im Weiteren wurde untersucht, ob die Zugabe von Natriumazid die Quantifizierung stört. Zu frischen Proben aus dem Belebungsbecken der ARA TH wurde in Doppelproben 100 µg/l der Benzotriazole zugegeben mit und ohne Zudosierung von 2g/L Natriumazid. Nach anschließender SPE und Messung mit LC/MS/MS auf dem TSQ Quantum zeigte sich, dass mit und ohne Zugabe des Bakterizids gleiche Peakflächen für die Benzotriazole erhalten wurden und die Quantifizierung durch die Zugabe von Natriumazid also nicht gestört wird. Für die Versuche mit Matrix der ARA Kloten-Opfikon wurde mindestens eine Probe dreimal genommen und analysiert. Bei Versuchen mit der Klärschlammmatrix der ARA Thunersee wurde jeweils jede Probe dreimal genommen und analysiert. In den Darstellungen sind Fehlerbalken angegeben, welche sich aus der Addition der Fehler der Wiederfindung der SPE, der Mehrfachbestimmungen und der Nullwertbestimmungen ergaben Abbauversuche, ARA Kloten-Opfikon und Thunersee Die Abbauversuche wurden als Batchversuche durchgeführt. Die Matrixsubstanzen waren einerseits aktivierter Klärschlamm der ARA Kloten-Opfikon (K-O) und andererseits Klärschlamm der ARA Thunersee (TH). Die Klärschlammsuspension wurde bei beiden Anlagen aus dem gut durchmischten Belebtschlammbecken am Ende des Beckens abgeschöpft (Abb. 4, 5, 10). Probenahme Abb. 10: Probenahmestellen des aktivierten Klärschlammes in der ARA Kloten-Opfikon (links) und ARA Thunersee (rechts)

37 Material und Methoden Der Transport erfolgte jeweils in 5 L-Glasgefäßen. Die Abbauversuche wurden maximal einen Tag nach der Entnahme des Klärschlammes gestartet, um die Aktivität des Klärschlammes zu gewährleisten. Die Aufbewahrung des Schlammes bis zum Beginn des Batchversuches erfolgte in Glasgefäßen unter ständigem Rühren, um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten. Angesetzt wurden insgesamt pro Abbauversuch drei Batchreaktoren. Im ersten Erlenmeyerkolben wurde der biologische Abbau untersucht, beim zweiten und dritten wurde eine Negativkontrolle durchgeführt (genaue Beschreibung siehe Punkt 3.7.6). Analysiert und quantifiziert wurden die Proben der ARA Kloten-Opfikon mit dem LC/MS/MS System API 4000 unter Verwendung der in Punkt beschriebenen Methode. Die Analyse und Quantifizierung der Proben der ARA Thunersee erfolgte mit dem LC/MS/MS System TSQ Quantum. Die verwendete Methode ist in Punkt angeführt

38 Material und Methoden Allgemeine Beschreibung der Abbauversuche Abb. 11: Schematische Darstellung der Gesamtmethode der Abbauversuche

39 Material und Methoden Vorversuch Ein Vorversuch mit Klärschlamm aus der ARA K-O diente zur Bestimmung der besten zeitlichen Abfolge der Probenahme und zur ungefähren Visualisierung des Abbauverlaufs. Der Vorversuch wurde in einem 2 L-Erlenmeyerkolben angesetzt. Zur Erreichung einer guten Durchmischung wurde ein Magnetrührer verwendet und zusätzlich wurde Luftsauerstoff über eine Glasfritte eingeblasen Bestimmung der Trockensubstanz des eingesetzten aktivierten Klärschlammes Für die Bestimmung der Trockensubstanz wurde gut durchmischte Klärschlammmatrix in Petrischalen genau eingewogen. Die Verdampfung des Flüssigkeitsanteils erfolgte in einem auf 120 C eingestellten Trockenschrank für die Dauer von zehn Stunden. Nach dem Abkühlen der Gefäße und der Auswaage erfolgte die Berechnung der Trockensubstanz (getrocknete Schlammmasse dividiert durch die eingewogene Schlammsuspension). Es wurde jeweils eine Doppelbestimmung durchgeführt Vergleichssubstanz Als eine positive Kontrolle, ob der Schlamm biologisch aktiv ist, wurde die Substanz Phenoxyessigsäure verwendet, welche eine gute biologische Abbaubarkeit aufweist. Zu Beginn wurde auch Natriumbenzoat als Positivkontrolle getestet, welches aber bei der Analyse mittels LC/MS/MS Probleme bereitete und somit nicht zur Anwendung kam Biologischer Abbau Verwendet wurde ein 2 L-Erlenmeyerkolben, welcher mit einem Liter an gut durchmischter Klärschlammsuspension gefüllt wurde. Zur ausreichenden Durchmischung der Matrix wurde ein Magnetrührer verwendet. Zusätzliche Luft wurde nicht eingeblasen, da das Gefäß mit einem Wattestopfen verschlossen wurde, der ausreichende Diffusion an Luftsauerstoff zuließ