Seite 1 No. 201 Anwendungsmöglichkeiten. Eppendorf Thermomixer comfort/compact Eppendorf ThermoStat plus Thermomixer comfort heizt, mischt, kühlt

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1 USERGUIDE Seite 1 No. 201 Eppendorf Thermomixer comfort/compact Eppendorf ThermoStat plus Thermomixer comfort heizt, mischt, kühlt Temperierbereich: (RT 13 C) bis 99 C [MTPs: (RT 10 C) bis 70 C], Minimal Temp. 1 C Temperiergenauigkeit: +/ 0,5 C im Bereich 20 C bis 45 C; +/ 2 C im übrigen Bereich Aufheizgeschwindigkeit: ca. 5 C/min. Abkühlgeschwindigkeit: 2 C 3 C/min. von RT bis 13 C unter RT 0.5 C 1 C/min. Mischen: rpm (1500 rpm bei 0,5 ml Wechselblock); Mischhub: 3 mm (orbital) Programmierung: 2 unterschiedliche Programmabläufe, jeweils Intervallmischen möglich Wechselblöcke: 24 x 0,5 ml; 24 x 1,5 ml; 24 x 2,0 ml; MTP + Deepwellplatten; Adapterplatte für PCR-MTP; Gefäße 2 5 ml mit Durchmesser: 11 11,9 mm, Höhe: mm 8 x Falcon * tubes 15 ml; 4 x Falcon tubes 50 ml; 24 x 1,5 2 ml Cryo tubes Thermomixer compact heizt und mischt Temperierbereich: (RT + 4 C) bis 99 C Temperiergenauigkeit: +/ 1 C im Bereich von 20 C bis 45 C; +/ 2 C im übrigen Bereich Aufheizgeschwindigkeit: ca. 5 C/min. Mischen: 300 rpm 1400 rpm; Mischhub: 3 mm (orbital) Fest-Block: 24 x 1,5 ml ThermoStat plus kühlt und heizt Temperierbereich: 5 C bis 99 C (CombiBox bis 95 C) Temperiergenauigkeit: +/ 0,5 C im Bereich 5 C bis 45 C; +/ 2 C im übrigen Bereich Aufheizgeschwindigkeit: ca. 4 C/min. Abkühlgeschwindigkeit: 2 C/min. zw. 99 C und 25 C; 1 C/min. zw. 25 C und 5 C Programmierung: 4 aufeinanderfolgende unterschiedliche Temperier- und Zeitphasen möglich Wechselblöcke: 24 x 0,5 ml; 24 x 1,5 ml; 24 x 2,0 ml; MTP + Deepwellplatten; Adapterplatte für PCR-MTP; CombiBox; Gefäße 2 5 ml mit Durchmesser: 11 mm 11,9 mm, Höhe: 30 mm 76 mm 8 x Falcon tubes 15 ml; 4 x Falcon tubes 50 ml; 24 x 1,5 2 ml Cryo tubes Produkt Thermomixer comfort Thermomixer compact ThermoStat plus Feature heizt heizt heizt kühlt mischt mischt kühlt Temperierbereich (RT 13 C) bis 99 C (RT + 4 C) bis 99 C 5 C bis 99 C (MTPs: (RT 10 C) bis 70 C) (CombiBox bis 95 C) Applikationen Anzucht von Bakterien/Hefen Anzucht von Bakterien/Hefen Aufbewahren von Chemikalien Bead-Technologie Bead-Technologie bei bei bestimmter Temperatur Immunpräzipitation Temp > RT + 4 C Enzym-Reaktionen Enzym-Reaktionen Enzym-Reaktionen bei Transformation (in Verbindung Transformation (in Verbindung Temp > RT + 4 C mit IsoTherm System) mit IsoTherm System) Transformation (in Verbindung Denaturierung von Denaturierung von mit IsoTherm System) DNA, RNA, Proteinen DNA, RNA, Proteinen Denaturierung von DNA, RNA, Proteinen *Falcon ist eine eingetragene Marke der Firma Becton Dickinson.

2 Seite 2 No. 201 RNA-Isolierung Prinzip der Bead-Technologie: An ein bestimmtes Trägermaterial (bead) sind Moleküle einer bestimmten Identität immobilisiert. Die Technologie basiert auf der Bindung eines bestimmten Moleküls an immobilisierte Proben. Die Bindung kann eine Hybridisierungsreaktion oder eine Ag/Ak-Reaktion darstellen. Ein leichtes Mischen der Probe verbessert die Bindungseffizienz. Dynabeads Oligo (dt)25 von Dynal Biotech Genexpressionsanalyse Grundprinzip: Durchführung: Bindung von PolyA + -RNA an Oligo-dT-Nukleotiden von etwa 20 Basen, die an die Beads gebunden sind. Bindung der PolyA + -RNA an die Beads unter mischen der Probe Reverse Transkription Grundprinzip: Synthese von cdna (complementary DNA) aus mrna mittels reverser Transkription Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei verschiedenen Temperaturen Denaturierung der RNA + Primer z.b. bei 70 C für 10 min. cdna-synthese: Inkubation des Ansatzes bei 37 C 42 C für 1h Abstoppen der Reaktion durch Hitzedeaktivierung z. B. bei 70 C für 30 min. Microarray Hybridisierungen Grundprinzip: An ein bestimmtes Trägermaterial (Slide) sind Moleküle einer bestimmten Identität immobilisiert. Die Technologie basiert auf der Bindung eines bestimmten Moleküls an immobilisierte Proben. Die Bindung basiert auf einer Hybridisierungsreaktion. Ein Mischen der Probe verbessert die Bindungseffizienz.

3 Seite 3 No. 201 Zell-Lyse Immunologische Methoden und Protein Detektion Applikation für ThermoStat plus/thermomixer comfort Grundprinzip: Zellen werden in einem speziellen Lysis-Puffer (Detergenz) lysiert. Durchführung: Inkubation des Ansatzes bei 4 C für 1 h Immunpräzipitation Applikation für Thermomixer comfort Grundprinzip: Ein bestimmtes Protein in Lösung kann durch Zugabe des entsprechenden monoklonalen Antikörpers und Protein A bzw. Protein G aus der Lösung gefällt werden. Ein leichtes Mischen der Probe verbessert die Bindungseffizienz Durchführung: Inkubation bei 4 C für 1 h 2 h In-Vitro-Translation Applikation für ThermoStat plus/thermomixer comfort Grundprinzip: Unter In-Vitro-Translation versteht man die zellfreie Synthese von Proteinen. Die Durchführung dieser Methode kann in drei Teile gegliedert werden: Generierung einer Template-DNA, die für ein Protein kodiert Üblicherweise kloniert man dafür eine cdna in einem Vektor mit SP6-, T3 bzw. T7-RNA-Polymerase-Promoter Von diesem Template synthetisiert man mittels In-vitro-Transkription eine RNA Durchführung: Das linearisierte Template wird mittels einer RNA-Polymerase in RNA umgeschrieben Inkubation bei 37 C 42 C für 1 h Translation der RNA Durchführung der Proteinsynthese in einem eukaryotischen Translationssystem (Weizenkeimextrakt oder Reticulocytenlysat) Durchführung: Inkubation bei 30 C für 1 h Isolierung/Aufreinigung von Proteinen mit Bead-Technologie Applikation für Thermomixer comfort Prinzip der Bead-Technologie An ein bestimmtes Trägermaterial (bead) sind Moleküle einer bestimmten Identität immobilisiert. Die Technologie basiert auf der Bindung eines bestimmten Moleküls an immobilisierte Proben. Die Bindung kann eine Hybridisierungsreaktion oder eine Ag/Ak-Reaktion darstellen. Ein leichtes Mischen der Probe verbessert die Bindungseffizienz. Dynabeads for Protein Isolation von Dynal Biotech Grundprinzip: Durchführung: Bindung des Proteins an die beadgekoppelten Antikörper - precoating der beads: bei 2 C 8 C für 2 h 24 h - binding reaction: bei 2 C 8 C für 10 min. 60 min.

4 Seite 4 No. 201 Klonierung von DNA-Fragmenten Diese gentechnologische Methode ermöglicht das Erbgut von Zellen bzw. Organismen willkürlich und gezielt zu verändern. Hierfür wird ein DNA-Fragment mit einem sogenannten Vektor, der z. B. die massenhafte Vermehrung dieser DNA in einer Wirtszelle ermöglicht, verknüpft (Herstellung von rekombinanter DNA) und anschließend in eine Wirtszelle übertragen. Neben der Vermehrung gibt es noch andere interessante Eigenschaften, die durch den Einsatz bestimmter Vektoren induziert werden können. Z. B. erlauben RNA-Polymerasen-Promotoren im Vektor die problemlose in-vitro-transkription von RNA, während virale Promotoren im Konstrukt eine Expression von cdnas in Säugerzellen erlauben. Grundprinzip: Präparation von Insert- und Vektor-DNA Ligation von Vektor und DNA-Insert Transformation in Wirtszelle Präparation Insert-DNA und Vektor Restriktionsverdau: Applikation für ThermoStat Plus/Thermomixer compact/thermomixer comfort Restriktionsenzyme erkennen eine spezifische Basensequenz von 4, 6 oder 8 Basen in einer DNA-Doppelhelix und schneiden beide Stränge der Helix an spezifischen Stellen. Mittels Restriktionsenzymen kann man DNA-Moleküle in spezifische Fragmente spalten, die dann wesentlich leichter analysiert und manipuliert werden können als das ursprüngliche Molekül. Fast alle Enzyme generieren Fragmente mit einem 5 -Phosphat-Ende und einem 3 -OH-Ende (wichtig für die Ligation). Die Enden sind entweder glatt (blunt ends) oder stehen über (sticky ends), ist das 5 -Ende länger spricht man von einem 5 -Überhang, sonst von einem 3 -Überhang. Beispiel: Die ringförmige 5,1 kb lange DNA-Doppelhelix des tumorerzeugenden SV40-Virus wird durch EcoRI an einer Stelle, durch Hpal an 4 Stellen und durch Hindlll an elf Stellen geschnitten. Ein DNA-Abschnitt der durch Einwirkung eines Restriktionsenzyms entstanden ist, lässt sich mit einem anderen Restriktionsenzym noch spezifisch in kleinere Fragmente spalten. Das Muster dieser Fragmente kann als Fingerprint eines DNA-Moleküls dienen. Kleine Unterschiede zwischen ähnlichen DNA-Molekülen sind leicht festzustellen, da man ihre Restriktionsfragmente durch Gelelektrophorese trennen und sichtbar machen kann. Ein Restriktionsfragment mit einer bestimmten Basensequenz kann durch eine Hybridisierung mit einem markierten, komplementären DNA-Strang identifiziert werden (Southern Blot). Durchführung: Inkubation des Restriktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z. B. bei 37 C für 1 h Abstoppen der Reaktion durch Hitzedeaktivierung des Enzyms (z. B. bei 65 C für 20 min.) oder Zugabe von 0,5 M EDTA. Umwandlung der sticky ends in blunt ends Im Allgemeinen ist es schwierig geeignete Restriktionsschnittstellen für die Klonierung zu finden. Das DNA-Fragment wird nach dem Restriktionsverdau mit einem Vektor ligiert, der zuvor mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wurde. Falls der für die Klonierung vorgesehene Vektor nicht die passenden Schnittstellen besitzt, muss eine andere Strategie gewählt werden. Man kann die überhängenden Fragmentenden glätten und das Fragment anschließend in einen Vektor mit glatten, dephosphorylierten Enden ligieren. Über eine normale Polymerasereaktion mit einer T4 DNA-Polymerase (oder mit Klenow-Fragment) können die überhängenden Enden aufgefüllt werden. Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z.b. bei Raumtemperatur für 20 min. oder bei 37 C für 5 min. Abstoppen der Reaktion durch Hitzedeaktivierung des Enzyms (z. B. bei 75 C für 10 min.).

5 Seite 5 No. 201 Phosphorylierung/Kinasierung: Die Übertragung von Phosphorylgruppen ist eine fundamentale Reaktion in der Biochemie. Ein Enzym, das eine Phosphorylgruppe von ATP auf einen Akzeptor überträgt, wird allgemein als Kinase bezeichnet. Mögliche Anwendung: Herstellung von künstlichen, kohäsiven Enden an beliebige DNA-Molekülen. Hierfür werden kurze, chemisch synthetisierte DNA-Linker mit den Enden eines DNA-Fragmentes oder eines Vektors verknüpft und anschließend mittels Restriktionsverdau geschnitten. Prinzip: Das 5 -Ende eines decamer Linkers und das eines DNA-Moleküls werden durch eine Polynukleotid-Kinase phosphoryliert und anschließend mittels einer Ligase aus dem T4-Phagen (verknüpft stumpfe Enden einer Doppel-Helix) aneinander gefügt. Kohäsive Enden erhält man, indem die angefügten Endstücke durch ein geeignetes Restriktionsenzym aufgeschnitten werden. Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z. B. bei 37 C für 0,5 h 1 h Abstoppen der Reaktion durch Hitzedeaktivierung z. B. bei 70 C für 30 min. Dephosphorylierung: Wenn ein Vektor nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten wird, entstehen zwei kompatible Enden, die wieder miteinander ligieren können. Die Selbst-Ligation des Vektors steht in direkter Konkurrenz zur DNA-Vektor-Ligation. Man kann dieses Problem verringern, indem man die Vektor-DNA dephosphoryliert (CIPen). Prinzip: Nach dem Restriktionsverdau bleiben an den 5 -Enden der DNA-Fragmente Phosphatreste zurück, die für die Ligation benötigt werden. Entfernt man diese beim Vektor mit einer Phosphatase, kann keine Selbst-Ligation mehr stattfinden. Das DNA-Fragment, das man in den Vektor einschleusen will, besitzt dagegen noch beide Phosphatreste und kann daher seinerseits immer noch mit der Vektor-DNA ligieren. Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z. B. bei 37 C für 1 h Abstoppen der Reaktion z.b. durch Zugabe von EDTA (Einstellen auf 5 mm ph 8) und durch Hitzedeaktivierung z.b. bei 75 C für 10 min. bzw. bei 65 C für 1 h. Ligation Vektor und Insert-DNA: Applikation für ThermoStat plus/thermomixer comfort Konstruieren neuer DNA-Moleküle im Labor Der im Rekombinationsexperiment benutzte Vektor lässt sich für das Spleißen vorbereiten, in dem man ihn mit einem Restriktionsenzym an einer einzigen spezifischen Stelle aufschneidet. Wird ein Enzym verwendet mit versetzten Schnittstellen, entstehen komplementäre einzelsträngige Enden, die eine spezifische Affinität zueinander besitzen und daher als kohäsive Enden bezeichnet werden. Jedes DNA-Fragment kann in dieses Plasmid eingebaut werden, wenn es die gleichen kohäsiven Enden besitzt. Um ein solches Fragment aus einem größeren DNA-Stück herzustellen, muss man nur das gleiche Restriktionsenzym verwenden, das zur Öffnung der Plasmid-DNA benutzt wurde. DNA-Fragmente und geöffnetes Plasmid können sich durch Basenpaarung aneinander lagern und durch eine DNA- Ligase, die die Bindung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNA-Ketten katalysiert, verknüpft werden. Die DNA-Ligase braucht eine freie OH-Gruppe am 3 -Ende der einen DNA-Kette und eine Phosphatgruppe am 5 -Ende der anderen. Diese Reaktion nennt man Ligation. Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z.b. bei 16 C für 1 h 4 h oder bei 12 C ü.n.

6 Seite 6 No. 201 Transformation: Applikation für ThermoStat plus + IsoTherm System/Thermomixer comfort/compact + IsoTherm System Konstruktion eines rekombinaten Moleküls Das interessierende DNA-Fragment wird kovalent an einen DNA-Vektor gebunden. Die wesentliche Eigenschaft eines Vektors besteht darin sich in einem passenden Wirt autonom zu replizieren. Plasmide und der Phagen I sind z.b. die Vektoren der Wahl für eine Klonierung in E.coli. Einschleusung in Wirtszelle/Transformation Viele Bakterien- und Eukaryotenzellen nehmen nackte DNA-Moleküle aus dem Medium auf. Der Wirkungsgrad ist zwar gering (er liegt bei ungefähr einem von 10 6 DNA-Molekülen), aber bei geeigneten experimentellen Bedingungen kann ein beträchtlicher Teil der Zellen so transformiert werden. Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei verschiedenen Temperaturen z.b. auf Eis/IsoTherm System für 45 min.; bei 37 C für 5 min. (oder bei 43 C für 3 min.)/thermostat plus; Eis/IsoTherm System für 5 min. Bakterien werden vor dem Ausstreichen auf die Agarplatte, bei 37 C für ca. 1 h hochgeschüttelt um z. B. die Antibiotikaresistenz auszubilden. cdna-bibliotheken: RNA-Isolierung: Thermomixer compact/thermomixer comfort Bindung von PolyA + -RNA an Oligo-dT-Nukleotiden von etwa 20 Basen, die an eine Matrix gebunden sind. Die Matrix kann aus Cellulose, magnetischen Kügelchen oder Latexkügelchen bestehen. z.b. Dynabeads Oligo (dt)25: Bindung der PolyA + -RNA an die Beads unter mischen der Probe Reverse Transkription: ThermoStat plus/thermomixer compact/thermomixer comfort Synthese von cdna aus mrna mittels reverser Transkription Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z. B. bei 42 C für 1 h Abstoppen der Reaktion durch Hitzedeaktivierung z. B. bei 70 C für 30 min. 2.Strang Synthese: ThermoStat plus/thermomixer comfort unter Verwendung der DNA-PolymeraseI aus E.coli. Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z. B. bei 16 C für 2 h Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von EDTA/Glykogen klonierfähige ds DNA Anzucht von Organsimen Bakterienanzucht in 2 ml Eppendorf Reaktionsgefäßen Applikation für Thermomixer compact/thermomixer comfort Applikationen zu diesem Thema sind bereits in Verbindung mit LidBac entstanden ( Durchführung: Inkubation: bei 37 C, 1400 rpm, ü.n. Anzucht von Hefen in 2 ml Eppendorf Reaktionsgefäßen Applikation für Thermomixer compact/thermomixer comfort Durchführung: Inkubation: bei 30 C, 1400 rpm, ü.n.

7 Seite 7 No. 201 Nick Translation Radioaktiv/Nonradioaktiv Labeling von DNA Methoden zur Herstellung markierter Sonden Applikation für ThermoStat plus/thermomixer comfort Prinzip: Template DNA wird mit DNase in Gegenwart von Mg 2+ -Ionen angedaut. Unter diesen Bedingungen schneidet das Enzym nur einen der beiden Stränge, so bleibt die Doppelstrang-Struktur erhalten. Im zweiten Schritt bearbeitet man das Template mit DNA-Polymerase in Gegenwart von Nukleotiden, von denen eins markiert ist. Die Polymerase erkennt die Schnitte und verlängert dort das freie 3 -Ende, während das 5 -Ende gleichzeitig abgebaut wird. Die Markierung erfolgt wahlweise über den Einbau radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierter Nukleotide. Durchführung: Inkubation bei 12 C 15 C für 15 min. 45 min. Inaktivierung bei 70 C für 10 min. Random Priming Applikation für ThermoStat plus + IsoTherm System/Thermomixer compact/comfort + IsoTherm System Prinzip: Denaturierung von doppelsträngiger Template-DNA, danach Hybridisierung mit random Primern, die anschließend als Primer für eine DNA-Polymerase (z. B. Klenow-Fragment) dienen. Die Markierung erfolgt wahlweise über den Einbau radioaktiv oder nicht-radioaktiv markierter Nukleotide. Durchführung: Denaturierung bei 95 C für 3 min. Anschließend Abkühlen der Probe auf Eis/IsoTherm System für 3 min. Inkubation bei 37 C/Raumtemperatur für 1 2 h Inaktivierung bei 70 C für 10 min. 5 -Markierung mit Polynucleotidkinase Prinzip: Die Markierung erfolgt durch den Austausch des Phosphatrestes am 5 -Ende durch ein radioaktives Phosphat. Durchführung: 1. Dephosphorylierung Inkubation des Reaktionsansatzes bei einer bestimmten Temperatur z. B. bei 37 C für 1 h Abstoppen der Reaktion z.b. durch Hitzedeaktivierung z.b. bei 75 C für 10 min. bzw. bei 65 C für 1 h 2. Markierung mit [γ- 32 P]-ATP Inkubation bei 37 C für 10 min. 30 min. Abstoppen der Reaktion mit 0,5 M EDTA 3 -Markierung mit Terminaler Transferase Prinzip: Die Markierung erfolgt durch die Terminale Desoxynucleotidyl Transferase, die unspezifisch Desoxynukleotide an das 3 -Ende von einzel- und doppelsträngiger DNA hängt. Durchführung: Inkubation bei 37 C für 30 min. Abstoppen der Reaktion: bei 70 C für 10 min.

8 Seite 8 No. 201 Präparation von genomischer DNA DNA-Aufreinigung Eppendorf Perfect gdna Blood Mini: Proteinase K Verdau Durchführung: Inkubation des Reaktionsansatzes bei 70 C, 900 rpm für 10 min. Lösen von genomischer DNA nach Phenol-Chloroform-Aufreinigung und EtOH-Fällung Durchführung: Langsamer Prozess der ca. 1 bis 2 Tage dauert. Kann durch vorsichtige Bewegung (300 rpm) bei Raumtemperatur oder 65 C beschleunigt werden. DNA-Fragmente aus Agarosegelen isolieren Eppendorf Perfectprep Gel Cleanup (Zentrifugationsmethode) Auflösen des Agarosegelstückes Durchführung: mischen des Ansatzes bei 50 C, 1000 rpm für 5 min. 10 min. Mit Glasmilch (Silica-Material) Glas bindet DNA in der Anwesenheit hoher Konzentrationen chaotroper Salze und kann nach einem Waschschritt mit Salz-Ethanol-Puffer (geringe Salz-Konz.) wieder eluiert werden. Durchführung: Versetzen des Agarosestückes mit Hochsalzpuffer und mischen des Ansatzes bei 50 C, 1000 rpm für 5 min. Glasmilch zugeben und bei Raumtemp. für 5 min inkubieren (leichtes mischen verbessert die Bindungseffizienz) Zentrifugieren, waschen, zentrifugieren, trocknen, eluieren Aufreinigung von biotinylierten Proben mit Bead-Technologie Prinzip der Bead-Technologie An ein bestimmtes Trägermaterial (bead) sind Moleküle einer bestimmten Identität immobilisiert. Die Technologie basiert auf der Bindung eines bestimmten Moleküls an immobilisierte Proben. Die Bindung kann eine Hybridisierungsreaktion oder eine Ag/Ak-Reaktion darstellen. Ein leichtes Mischen der Probe verbessert die Bindungseffizienz. Dynabeads Streptavidin von Dynal Biotech Grundprinzip: Bindung der biotinylierten DNA an die Beads Durchführung: mischen des Reaktionsansatzes bei Raumtemperatur für ca. 10 min. Plasmid-DNA Aufreinigung Eppendorf Perfectprep Plasmid Kit Durchführung: Erwärmung des Elutionspuffer Eine bessere Plasmid-DNA-Ausbeute kann erreicht werden, wenn der Elutionspufffer auf 65 C bei Plasmid DNA < 30 kb bzw. auf 85 C bei Plasmid DNA > 30 kb erhitzt wird. eppendorf is a registered trademark Order no. AA05 7PW 011/D1/1T/0303/NEUH Printed in Germany Chlorine-free bleached paper

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