Vorlesung Einführung in die Bioinformatik

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1 Vorlesung Einführung in die Bioinformatik Dr. Astrid Junker

2 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Was ist Genexpression? wie die genetische Information eines Gens (Abschnitt der DNA) zum Ausdruck kommt und in Erscheinung tritt, also wie der Genotyp eines Organismus oder einer Zelle als Phänotyp ausgeprägt wird Aktivierung der Gentranskription durch endogene, exogene Einflüsse Ziel der Genexpressionsanalyse Charakterisierung der Funktion von Genen, deren Interdependenzen, Interaktionen und Einfluss in verschiedenen Netzwerken (metabolische N., regulatorische N. etc.) Annahme: Genexpression korreliert mit Proteinsynthese Dr. Astrid Junker Folie # 2

3 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Messung der Genexpression Messung der mrna Konzentration in Zellen unter verschiedenen Bedingungen: gesundes vs. krankes Gewebe verschiedene Zell-/Gewebetypen Entwicklungsstadium: Embryo, Kind, Erwachsener Umwelt: Einfluss von Hitze, Ernährung, Therapie Subtypen einer Krankheit (z.b. teilweise Chemotherapieresistenz) Suche nach Genen mit gleicher Expression: (Koexpression, ) bzw. differenzieller Expression (, ) Co-Regulation Ähnliches Genmuster > ähnliche Funktion? Ähnliches Genmuster > ähnliche Regulation? Techniken: Northern Blotting, qrt-pcr, SAGE, Microarray... Dr. Astrid Junker Folie # 3

4 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Hin zur genomweiten Messung "Gene expression profiling" Idee: Messung der Aktivität von Genen / Transkripten unter verschiedenen Bedingungen Chip-Plattformen: Gen ~, Exon ~, Tiling arrays,... "Mutation profiling" Idee: Messung der genetischen Variabilität der Genomsequenz Chip-Plattformen: Matrix-CGH ~, SNP arrays, "Sequence profiling" Idee: Sequenzierung des Genomes eines Probanden Chip-Plattformen: Roche 454, Illumina Solexa,... Dr. Astrid Junker Folie # 4

5 Ergebnis der Experimente Dr. Astrid Junker Folie # 5

6 Micro-Arrays Grundidee Ziel: Parallele Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen/Genen (nur geringe Menge an biologischen Probenmaterial nötig) Grundidee: Probe: Oligonukleotide, PCR Produkte, cdna Vektoren/gereinigte Inserts, cdna-bibliotheken (auf Trägermaterial, z.bsp: Glasträger, Nylonmembran) Sample: cdna aus einer Zelle cdnas aus Zelle hybridisieren mit cdnas in Probe, je nach Menge gespotteter cdna > Information über Numkleinsäurenzusammensetzung im Sample Hersteller: Affymetrix, Agilent (customized array), Nimblegene, Rosetta Inpharmics etc. Dr. Astrid Junker Folie # 6

7 cdna libraries mrna > RT > cdna Repräsentiert Gesamtheit aller exprimierten Gene (Transkriptom) Klonierung in Plasmide Vermehrung in Bakterien > Clone für RNAs > Sequenz pro RNA Dr. Astrid Junker Folie # 7

8 Probenaufbereitung Dr. Astrid Junker Folie # 8

9 Sampleaufbereitung Dr. Astrid Junker Folie # 9

10 Ablauf Dr. Astrid Junker Folie # 10

11 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Ablauf Seite 11 Dr. Astrid Junker Folie # 11

12 Zweifarbenaufnahmen Dr. Astrid Junker Folie # 12

13 Sample Vorbereitung control test Dr. Astrid Junker Folie # 13

14 Zweifarbenaufnahmen Dr. Astrid Junker Folie # 14

15 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Auswertung Dr. Astrid Junker Folie # 15

16 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Auswertung Dr. Astrid Junker Folie # 16

17 Zweifarbenaufnahmen Dr. Astrid Junker Folie # 17

18 Probleme Dr. Astrid Junker Folie # 18

19 Probleme: Reproduzierbarkeit, Vergleichbarkeit Dr. Astrid Junker Folie # 19

20 Seite 20 Dr. Astrid Junker Folie # 20

21 MIAME I Dr. Astrid Junker Folie # 21

22 Andreas Stephanik, IPK Gatersleben 2004 MIAME II MIAME ist keine formale Spezifikation sondern Richtlinie für die Entwicklung von Datenbanken und Data Management Software zu Microarray Experimenten Beschreibung der konzeptionellen Struktur von Microarray Experimenten Freitext möglichst zusammen mit kontrolliertem Vokabular oder Ontologien (z.b. Taxonomie, Zelltypen, Begriffe zur Anatomie, Nomenklatur zu chem. Verbindungen) Kontrolliertes Vokabular: (Qualifier, Wert, Quelle), z.b.: (Qualifier : cell type, Wert : epithelial, Quelle : Gray s anatomy, 38th ed. ) Die Microarray Gene Expression Data (MGED) Gruppe entwickelt eine Ontologie für Microarray Experiment Beschreibungen Dr. Astrid Junker Folie # 22

23 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Datenbanken Dr. Astrid Junker Folie # 23

24 Genexpressionsdatenbanken Dr. Astrid Junker Folie # 24

25 Repository für Daten von Microarrays, Genexpressionsdaten, Protokolle der Experimente und zugehörige Publikationen nach MIAME/MAGE-ML Spezifikation ArrayExpress besteht aus 4 Hauptkomponenten: 1. Datenbank 2. Webbasiertes Query-Interface 3. Webbasiertes Daten-Submission-Tool und Annotations-Tool MIAMExpress 4. Online-Analyse-Tool Expression Profiler Datenimport direkt in Expression Profiler oder Export für lokale Analyse Daten-Submission-Tool besteht aus 3 Teilen: 1. Experiment, 2. Protokoll und 3. Array Vergabe von Accession-Numbers zur Referenzierung von mehreren Experimenten zu Array oder Protokoll Dr. Astrid Junker Folie # 25

26 ArrayExpress Seite 26 Dr. Astrid Junker Folie # 26

27 EBI ArrayExpress (Vergleich 10/06, 10/07, 03/10, 11/12) Dr. Astrid Junker Folie # 27

28 Zusammenfassung Dr. Astrid Junker Folie # 28

29 Affymetrix Kommerzielles Massenprodukt High density oligonucleotide Technologie Nur ein einzelner Kanal Sehr weit verbreitet. Dr. Astrid Junker Folie # 29

30 Affymetrix Probes and Probesets Immer mehrere Probes (Pairs) pro Probeset Dr. Astrid Junker Folie # 30

31 Affymetrix Perfect Matches und Mismatches Ein Mismatch für jeden Perfect Match, um unspezifische Hybridisierungen herausrechnen zu können. Ca. 30% der MM Intensitäten sind höher, als der zugehörige PM. Studien belegen, dass MMs mehr Rauschen verursachen, als zu eliminieren. Deshalb werden MMs oft komplett ignoriert. Dr. Astrid Junker Folie # 31

32 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Affymetrix Hybridisierung Zellen (Bereiche) auf jedem Gen-Chip-Array Millionen von DNA Strängen in jeder Zelle Redundanz!!! Eigentlicher Strang ca. 25bp Dr. Astrid Junker Folie # 32

33 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Affymetrix Hybridisierung Zellen (Bereiche) auf jedem Gen-Chip-Array Millionen von DNA Strängen in jeder Zelle Redundanz!!! Eigentlicher Strang ca. 25bp RNA Fragmente mit fluoreszenz-markierten Tags aus dem zu testenden Sample RNA Fragment hybridisiert mit DNA auf Gen-Chip Dr. Astrid Junker Folie # 33

34 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Affymetrix Hybridisierung Zellen (Bereiche) auf jedem Gen-Chip-Array Millionen von DNA Strängen in jeder Zelle Redundanz!!! Eigentlicher Strang ca. 25bp RNA Fragmente mit fluoreszenz-markierten Tags aus dem zu testenden Sample RNA Fragment hybridisiert mit DNA auf Gen-Chip Dr. Astrid Junker Folie # 34 Bestrahlung des Gen- Chip durch Laser > hybridisierte, fluoreszenz-markierte DNA-Fragmente beginnen zu leuchten

35 Affymetrix: GeneAtlas Personal Microarray System Hybridisierung (inkl. Fluidics Station), Scanner inkl. Bildauswertung Datenauswertung Dr. Astrid Junker Folie # 35

36 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Messfehler Dr. Astrid Junker Folie # 36

37 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Normalisierung Dr. Astrid Junker Folie # 37

38 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Normalisierung Ziel: Generierung von Expressionswerten per Gen auf Basis bereinigter, normalisierter Messwerte von Probenintensitäten > Vergleichbarkeit von Arrays Beinhaltet Background Correction, Normalization, Quantification / Summarization Grundannahme: Mehrheit der Gene ist nicht differentiell exprimiert Kein Standard für Datentransformationsschritte (z.b. verschiedene Normalisierungsverfahren) > Speicherung der Rohdaten notwendig Dr. Astrid Junker Folie # 38

39 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Methoden der Normalisierung Dr. Astrid Junker Folie # 39

40 Quantilen-Normalisierung Dr. Astrid Junker Folie # 40

41 Quantilen-Normalisierung Normalisierung über ein Set von Hybridisierungen. Annahme: Die meisten Gene sind in allen Experimenten gleich stark exprimiert. Die Chips haben gleiche Intensitätsverteilung Quantilen (statistisches Lagemaß) jedes Chips sind nach Normalisierung gleich 1) Matrix X: p x n (jedes Array ist eine Spalte, jedes Transkript / Gen ist eine Zeile) 2) Sortiere jede Spalte von X separat > Xsort 3) Weise jedem Feld in einer Zeile den jeweiligen arithmetischen Mittelwert der Zeile zu (X sort) 4) Bestimme Xn durch Reorganisieren der Spalten von X sort um die gleiche Sortierung wie im Inputvektor zu erhalten Dr. Astrid Junker Folie # 41

42 Rahnenführer (Beißbarth), Statistik in der Bioinformatik, TU Dortmund Quantilen-Normalisierung Dr. Astrid Junker Folie # 42

43 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Quantilen-Normalisierung Quantilen (statistisches Lagemaß) jedes Chips sind nach Normalisierung gleich. Jeder normalisierte Wert liegt in dem Vektor aus Mittelwerten im selben Quantil wie der ursprüngliche (nicht normalisierte) Wert. Dr. Astrid Junker Folie # 43

44 Werkzeuge zur Datenauswertung The R Project for Statistical Computing: free software environment for statistical computing and graphics Bioconductor: basierend auf R viele Programm-Pakete Open Source Hauptfokus lag auf Microarray Daten Erweiterung Mass Spec data, Flow Cytometry, Genomics Data, Dr. Astrid Junker Folie # 44

45 TM4 - Dr. Astrid Junker Folie # 45

46 TM4 - Überblick I Software von TIGR (The Institute of Genomic Ressearch): Microarrays have emerged as the premier tool for studying gene expression on a genomic scale. Advances in the precision of array printers and scanners as well as improved laboratory protocols allow for assays of tremendous complexity and scope. Scientist seeking to harness the potential of this technique are often challenged by the prodigious quantities of data produced. Well-designed, user-friendly software is the key to tracking, integrating, qualifying, and ultimately deriving scientific insight from the experimental results. In support of our ongoing work in microarray analysis of gene expression, we developed a suite of software that allow users in the laboratory to capture, manage, and analyze effectively data from DNA microarray experiments. Dr. Astrid Junker Folie # 46

47 TM4 - Überblick II 4 Hauptkomponenten: Microarray Data Manager (MADAM) TIGR Spotfinder: Bildanalyse Microarray Data Analysis System (MIDAS): Normalisierung, Filterung Multi Experiment Viewer (MeV): Interpretation der Ergebnisse Zusatzmodule: MIAME-compliant MySQL database Automated Microarray Pipeline ExpressConverter SlideMap Dr. Astrid Junker Folie # 47

48 TIGR Spotfinder Dr. Astrid Junker Folie # 48

49 MIDAS: Microarray Data Analysis System Dr. Astrid Junker Folie # 49

50 MIDAS: Microarray Data Analysis System Dr. Astrid Junker Folie # 50

51 MeV: MultiExperiment Viewer Dr. Astrid Junker Folie # 51

52 MeV: MultiExperiment Viewer Dr. Astrid Junker Folie # 52

53 MADAM: MicroArray DAta Manager Dr. Astrid Junker Folie # 53

54 Genevestigator online platform enabling researchers to globally explore public and proprietary expression data for research and clinical applications. web-based application to rapidly find out how genes are expressed in different tissues, stimuli, drug treatments, diseases, or genetic modifications. Results are processed from a large database of manually curated and quality-controlled microarrays and RNAseq samples from a large variety of tissues and conditions. Currently, data is available for human, mouse, rat, pig, drosophila, arabidopsis, barley, rice, wheat, tomato, tobacco, moss and soybean. Dr. Astrid Junker Folie # 54

55 Genevestigator Organism Studies Samples Conditions Genotypes Anatomy Neoplasm Human ,581 4,390 1, Mouse 358 7, Rat ,651 5, Pig 43 1, Drosophila 123 2, Arabidopsis ,749 1,656 1, Barley 56 1, Rice 124 2, Wheat 54 1, Maize Sorghum Physcomitrel la Soybean 46 3, Tomato Tobacco Yeast 63 1, E. coli Dr. Astrid Junker Folie # 55

56 Genevestigator Three tool sets, each containing several tools, are available: CONDITION SEARCH tools: find conditions that are relevant for your genes of interest GENE SEARCH tools: find genes that are specifically expressed in conditions of interest SIMILARITY SEARCH tools: find genes that are similar within a data space Dr. Astrid Junker Folie # 56

57 efp Browser Dr. Astrid Junker Folie # 57

58 Expressionsanalyse mittels RNA-Seq RNA-Seq: RNA-Sequenzierung Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung Bestimmung der Nukleotidabfolge der RNA basierend Hochdurchsatzmethoden (NGS) RNA in cdna übersetzen Anwendung der Methode zur DNA-Sequenzierung RNA-Seq entschlüsselt Informationen zur Genexpression: Expression unterschiedliche Allele eines Gens Identifikation posttranskriptionaler Modifikationen Vorteile von RNA-Seq: Geringes Hintergrundrauschen höhere Auflösung hohe Reproduktionsraten in technischen und biologischen Replikaten Dr. Astrid Junker Folie # 58

59 Dr. Astrid Junker Folie # 59

60 Sonja Taranzo, CIPF, Spain: Data analysis workshop for massive sequencing data, Granada, June 2011 Vgl. RNA-Seq - Microarrays Dr. Astrid Junker Folie # 60

61 Sonja Taranzo, CIPF, Spain: Data analysis workshop for massive sequencing data, Granada, June 2011 Vgl. RNA-Seq - Microarrays Dr. Astrid Junker Folie # 61

62 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Differentielle Expression Dr. Astrid Junker Folie # 62

63 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Analyse und Visualisierung Dr. Astrid Junker Folie # 63

64 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Clustering Dr. Astrid Junker Folie # 64

65 Kirsten/Groß, VL Biodatenbanken, Universität Leipzig Hierarchisches Clustering Dr. Astrid Junker Folie # 65

66 Funktionelle Klassifizierung ist eine internationale Bioinformatik-Initiative zur Vereinheitlichung eines Teils des Vokabulars der Biowissenschaften biologisches Wissen übersichtlich darzustellen Zuordnung von GO-Termini (Annotation) zu einzelnen Genen und ihren Proteinen Cellular Component Molecular Function Biological Process Dr. Astrid Junker Folie # 66

67 Gene ontology Arabidopsis thaliana TAIR Homo sapiens GO EBI Annotated gene products GO annotations The Gene Ontology (GO) provides a system for hierarchically classifying genes or gene products to terms organized in a graph structure called an ontology. Dr. Astrid Junker Folie # 67

68 GO Graph GO term > Knoten, Beziehung zw. GO terms > Kanten Beziehungen sind gerichtet Azyklischer Graph Quasi hierarchisch > child terms spezialisierter als parent terms Ein term kann mehrere parent terms haben Dr. Astrid Junker Folie # 68

69 Over-representation analysis Term-Enrichment-Analyse (Sind Gene bzw. zugeordnete GO terms angereichert?) Vergleich Vorkommen von GO terms zwischen Referenz-Set (genomweit) und Genliste (z.bsp. Liste von diff. Expr. Genen aus Microarry Exp.) Statistischer Test: Fisher Exakt Test (hypergeometr. Test) und entspr. Korrektur (Bonferroni) Dr. Astrid Junker Folie # 69

70 Over-representation analysis AgriGO ( Dr. Astrid Junker Folie # 70

71 Over-representation analysis Cytoscape BinGO Dr. Astrid Junker Folie # 71

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