Biomedizinische Fluoreszenzbildgebung mit Einzelphotonenempfindlichkeit. Biomedizinische Optik

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1 Biomedizinische Fluoreszenzbildgebung mit Einzelphotonenempfindlichkeit B. Ebert, R. Macdonald Fachbereich 8.3 Biomedizinische Optik in in vivo vivooptische Bildgebung und und Spektroskopie Laser-gestützte diagnostische und und analytische Methoden state-of-the-art Instrumentierung klinische Versuchsanordnungen physikalische Modelle, Methoden zur zur Datenanalyse Qualitätskontrolle in in der der Laboratoriumsmedizin (Hämatologie) Primärstandards für für die die Zellzählung Bestimmung von von Referenzwerten Standardisierung von von Referenzmethoden

2 Outline Time-Correlated Single Photon Counting Single photon imaging: iccd and emccd NIRS of human head perfusion monitoring (ICG) laser pulse mammography molecular imaging fluorescence-based imaging laser scanning fluorescence microscopy detection of tumors inflammatory diseases - rheumatoid arthritis Determination of analytes for cellular & molecular medicine ELISA

3 Time-Correlated Single Photon Counting Excitation: Pulses of Ti:Sa laser 80 MHz Signal (fluorescence): up to photons/s DTOF - Detector signal - random sequence of single-photon pulses - Photon flux is low; less than one photon per laser pulse detected - Signal shape is given by the distribution of these pulses within the laser period PMT APD CMOS single photon counter Time resolution limited by transit time spread of detector (30ps - 150ps FWHM with PMTs) single photon sensitivity high dynamic range and linearity high S/N count rates up to few MHz PC plug-in boards available

4 iccd / emccd: Bildgebung mit hoher Empfindlichkeit iccd EMCCD (Andor) Verstärkung von 1 bis 1000 Taktspannung ca. 20 V bis 40 V Variation der Verstärkung von 1 bis 1000 δ total = δ readout+ F * M *( δ dark + δ signal + δ cic ) Dark current noise, light signal noise and clock induced charge noise

5 Time-resolved near-infrared spectroscopy of the brain Principle of depth resolution short laser pulse scalp skull cortex time-of-flight distribution ~ 1 ns Analysis based on moments early photons late photons Multi-channel instrument 4 detection channels (time-correlated single photon counting) 3 wavelengths 680 nm 830 nm (ps diode lasers) time resolution 500 ps 900 ps N tot integral N tot <t> 2 V t t V = mean TOF t 2 t variance 2 BMWA-Projekt Time-domain NIR brain imager 10 / / 2005, H. Wabnitz Partner: PicoQuant (Berlin), Loptek Glasfasertechnik (Berlin)

6 Fluorescence: ICG bolus (healthy volunteer) N R,norm N F,norm <t> / ns fluorescence reflectance 50ps! prominent increase of <t> and V explanation: ECA ICA dye in intracerebral layer only longer average pathlength compared to homogenenous dye distribution dye mostly in extracerebral layer ICG bolus V / ns time / s improvement in quantification of bolus arrival?

7 Projekt FLUOROMAMM (BMBF) Bewilligungszeitraum: , D. Grosenick Partner Unterauftragnehmer Bayer Schering Pharma Ziele Entwicklung von Verfahren zur Fluoreszenzabbildung von Brusttumoren Aufbau eines Fluoreszenzmammographen und Anwendung in vivo Optisches Mammogramm (intrinsischer Kontrast) 1/N L y / cm x / cm Tumor Blutgefäß Brustwarze

8 Principle of Molecular Imaging Quantitation? fluorescence signal Disease Target Ligand Label fluorophore (NIR) Pathophysiological paradigm: Vasculature/perfusion Angiogenesis Inflammation Apoptosis Target: Cell-surface receptors Endothelial receptors Matrix proteins Proteolytic Enzymes Macrophages Ligand: Peptide Antibody Antibody fragments Oligonucleotides Small molecules modified from K. Licha, Schering AG

9 Functional Diagnostics on Cellular and Subcellular Levels Cells - Counting - Differentiation - Sorting - Validation - Localisation Flow cytometry (Bio-) Molecules Microscopic - Detection - Localisation - Quantification e.g. surface epitopes intra cellular mab mrna

10 Two-photon microscopy images of LS147T-cells Protoporphyrin IX (PpIX) fluorescence at λ = 635±20 nm and endogenous autofluorescence at λ = 535±17.5 nm 1 mm ALA 1 mm ALA FECH-1140 sirna treated cells untreated cells

11 FRET Nanometric Distance Measurements Measured FRET values are supported by theory when considering (... ) Molecular dynamics E = A A + D ( _ ) Molecular dynamics and different molecular brightness Fluorescence correlation spectrocopy of same sample contour length (nm) S. Rüttinger Confocal Microscopy and Quantitative Single Molecule Techniques for Metrology in Molecular Medicine Dissertation TU Berlin (2006), Type II polyproline labelled with Alexa Fluor 555 and Alexa Fluor 647 J.Biomed.Opt. 11, 2 (2006)

12 Receptor-Targeted Optical Imaging of Tumors with Near-Infrared Fluorescent Ligands SSTR2 Tumor, NIR38: Dose: 0,02 µmol/kg i. v. In-vivo Fluorescence imaging of molecular probes (peptides) Development of imaging measuring devices/procedures Test and characterisation of specific optical contrast agents Development of quantitative approaches pre contrast 6 h 6 h pre contrast Bayer Schering Pharma ITCC-Octreotid ITCC-(M 2,M 7 )Octreotid A. Becker, C. Hessenius, K. Licha, B. Ebert, U. Sukowski, W. Semmler, B. Wiedenmann, and C. Grötzinger nature biotechnology 19 (2001),

13 Fluorescence Imaging of Rheumatoid Arthritis Bayer Schering Pharma tasks: photo-physical characterisation of fluorescent contrast agents development of state-of-the-art instrumentation development of quantitative approachesobjective criteria

14 Prinzipskizze Rheumascanner APD Laser 730 nm / 750 nm 1 W Strahlaufweitungsoptik Langpassfilter λ pass 780 nm dichroitischer Strahlteiler 7 mm Scankopf F-Theta-Objektiv 200 mm 200 mm 1000 Linearität des abbildenden Systems 1000 Unterschiedlich konzentrierte Farbstofflösungen gemitteltes APD-Signal / mv Scanner lineare Regression Steigung 1.02 Kamera lineare Regression Steigung gemittelte CCD-Intensität / counts Fluorometerintensität / cps

15 Bildgebung mittels Scannersystem Probandenhand 1 0

16 Pilot Studies in Fluorescence Spectral Correction of Fluorescence Emission Spectra participating laboratories: NIST, NRC, BAM and PTB CCQM P58 Fluorescent ELISA Study participating laboratories: NPL, NIST BAM and PTB (14 Teilnehmer) Phase I: Determination of fluorophore concentrations in 96 well plates (Comparison of reader and camera based detection systems) Phase II: Determination of unknown concentrations in a sandwich type ELISA 96-well plate filled with 100 nm fluorescein in 200 µl sodium borate buffer ph = 9.3 scheme for the filling of wells ELISA measurement

17 CCQM P58: fluorescence measurements for the life sciences Koordination durch NPL / NIST) Bekannte Konzentrationen zur Kalibration norm. Fluoreszenzintensität Plate 2 PTB unbekannte Konzentrationen bekannte Konzentrationen Fit bekannter Konzentrationen Kontrollen Interferon-α Konzentration (ng/ml) unbekannte zu bestimmende Konzentrationen (400-fach verdünnte Ausgangslösung) Rückführbarkeit der Konzentration : Fluorometer, mit rückgeführtem Strahlungsnormal (Gigahertz-Optik GmbH, BN ) kalibriert

18 Zusammenfassung Fluoreszenz-basierte Messverfahren vielseitige Werkzeuge der Biomedizinischen Optik in vitro: Durchflusszytometrie, Mikroskopie in vivo: Molekulare Bildgebung, Endoskopie, Perfusionsmessungen, optische Mammographie hochempfindlich, hochspezifisch durch Markierung Entwicklung / Etablierung quantitativer Verfahren erforderlich, aber schwierig (insbesondere in vivo!) Definition klinisch relevanter Messgrößen weitestgehend offen