Pädiatrische Endokrinologie und Diabetologie

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1 Pädiatrische Endokrinologie und Diabetologie Bearbeitet von Olaf Hiort, Thomas Danne, Martin Wabitsch 1. Auflage Buch. xi, 08 S. Hardcover ISBN Format (B x L): 19,3 x 26 cm Weitere Fachgebiete Medizin Klinische und Innere Medizin Endokrinologie Zu Inhaltsverzeichnis schnell und portofrei erhältlich bei Die Online-Fachbuchhandlung beck-shop.de ist spezialisiert auf Fachbücher, insbesondere Recht, Steuern und Wirtschaft. Im Sortiment finden Sie alle Medien (Bücher, Zeitschriften, CDs, ebooks, etc.) aller Verlage. Ergänzt wird das Programm durch Services wie Neuerscheinungsdienst oder Zusammenstellungen von Büchern zu Sonderpreisen. Der Shop führt mehr als 8 Millionen Produkte.

2 Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie Stefan A. Wudy, Sabine Wenderhold-Reeb, Michaela F. Hartmann, Werner F. Blum.1 Besonderheiten der Hormonbestimmung bei Kindern und Stellenwert der pädiatrisch-endokrinologischen Analytik 70.2 Prinzipien der Hormonbestimmungsmethoden Bioassays Radiorezeptorassays Immunoassays Chromatografische und massenspektrometrische Nachweismethoden 73.3 Zuverlässigkeit und Validierung von Hormonassays 7.4 Prä- und postanalytische Aspekte bei der Hormonbestimmung 7. Praktische Aspekte Kasuistik zur Diagnostik des 21-Hydroxylasemangels im Neugeborenenalter Fallstricke bei der Bestimmung von Wachstumsfaktoren 78 Literatur 79

3 70 Kapitel Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie.1 Besonderheiten der Hormonbestimmung bei Kindern und Stellenwert der pädiatrischendokrinologischen Analytik Die pädiatrische Endokrinologie ist auch ein»laborfach«, das das Gebiet der endokrinen Analytik beinhaltet. Im Vergleich mit der Endokrinologie der Erwachsenen gelten für die pädiatrische Endokrinologie viele Besonderheiten. Viele angeborene Hormonstörungen manifestieren sich bereits in der Kindheit und stellen differenzialdiagnostische Herausforderungen dar. Oft wird vergessen, dass praktisch alle kommerziell erhältlichen Hormonassays nur für Erwachsene entwickelt worden sind. Die unkritische Anwendung solcher Assays bei Kindern birgt oft Probleme. Die ständige Dynamik von Wachstum und Entwicklung des kindlichen Organismus schafft wechselnde analytische Anforderungen. Ferner müssen altersbezogene Referenzbereiche einbezogen werden. Dies alles muss bei der Auswahl von Methoden zur endokrinen Diagnostik bei Kindern berücksichtigt werden, da sonst Fehlmessungen und Fehlinterpretationen unvermeidlich sind. Bedauerlicherweise haben Entwicklungen der letzten Jahre dazu geführt, dass Labormethoden aus der pädiatrischen Endokrinologie in Disziplinen abgewandert sind oder abgezogen wurden, in denen vorrangig die Interessen und Bedürfnisse Erwachsener bedient werden. Vermeintlich aus Kostengründen oder Argumenten der besseren Effizienz hat man so vielen pädiatrisch-endokrinologischen Laboren die Existenzgrundlage entzogen. Dass dies oft mit erheblichen Qualitätsverlusten in der pädiatrisch-endokrinologischen Analytik einhergeht, bemerken die praktisch tätigen pädiatrischen Endokrinologen, da nur sie mit den Diskrepanzen zwischen Laborbefunden und klinischen Befunden konfrontiert sind. Wie jedoch die jüngsten Entwicklungen auf dem Sektor der Bewertung klinischer und analytischer Leistungen (einheitlicher Bewertungsmaßstab, EBM; Gebührenordnung für Ärzte, GOÄ) zeigen, liegt eine adäquate Honorierung der besonderen Anfordernisse der pädiatrisch-endokrinologischen Laborbestimmungen noch in ferner Zukunft. Bei aller vermeintlichen Ratio ökonomischer Diskussionen darf man das Wohl der einem anvertrauten Patienten nicht vergessen. Qualität ist nicht gleichbedeutend mit Luxus!! Fehlmessungen mit konsekutiver Fehlinformation des Patienten und seiner Eltern können für die Betroffenen desaströse Auswirkungen entfalten. Das pädiatrisch-endokrinologische Labor ist ein entscheidendes technisch-diagnostisches Instrument des pädia- trischen Endokrinologen, vergleichbar dem Herzkatheter eines Kardiologen oder dem Endoskop eines Gastroenterologen. Kein Vertreter der beiden letztgenannten Spezialgebiete würde ohne weiteres sein technisches Instrument aus der Hand geben. Da der pädiatrische Endokrinologe in besonderem Maße von den Labormethoden abhängig ist, um eine richtige Diagnose zu stellen oder den Patienten zu führen, sind gründliche Kenntnisse der Hormonbestimmungsmethoden von essenzieller Bedeutung. Theorie und Praxis des pädiatrischen Hormonlabors sind Kernbestandteile der derzeitigen europäischen Ausbildungsrichtlinien für die Kinderendokrinologie und -diabetologie (Hindmarsh 2001). Ferner muss der pädiatrische Endokrinologe die von ihm angewendeten Labormethoden genau kennen und auf diese gegebenenfalls Einfluss nehmen können. Dies setzt einen ungehinderten Zugang zum Laborbereich oder besser ein eigenes Labor voraus. Dieses Kapitel gibt pädiatrischen Endokrinologen einen Überblick über die verfügbaren Hormonbestimmungsmethoden und führt sie in deren Grundlagen ein..2 Prinzipien der Hormonbestimmungsmethoden Die Konzentrationen der Hormone in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben sind i. Allg. gerade im Kindesalter sehr niedrig, was besonders sensitive Bestimmungsmethoden erforderlich macht. Diese beruhen meist auf der Basis von Immunoassays. In besonderen Situationen kommen andere Verfahren wie Bioassays, Radiorezeptorassays oder chemische bzw. physikalisch-chemische Nachweismethoden infrage. Bei der Hormonbestimmung im Blut (Serum oder Plasma) ist die tageszeitliche (zirkadiane) Abhängigkeit der Konzentration zu beachten. Viele Hormone liegen sowohl frei als auch an ein Trägereiweiß gebunden vor. Aufgrund des Konzentrierungseffektes sind bestimmte Hormon- und vor allem deren Metabolitenkonzentrationen im Urin höher als im Blut (Ausnahme Peptidhormone). Des Weiteren stellt Urin per se schon eine»gereinigte«flüssigkeit dar. Zu unterscheiden ist die Bestimmung der Hormone aus Spontanurin oder Sammelurin. Urinbestimmungen aus z. B. 24-h-Urin geben zusätzlich eine zeitlich integrale Information. Die Schwankungen durch tageszeitlich unterschiedliche Konzentrationen entfallen bei dieser Bestimmungsmethode. Vielfach erlaubt eine Metabolitenbestimmung aus Sammelurin Rückschlüsse auf die Sekre-

4 .2 Prinzipien der Hormonbestimmungsmethoden 71 tionsrate des Prähormons, des eigentlichen Hormons oder die eingenommene Menge eines Medikamentes (z. B. eines Hormonpräparates)..2.1 Bioassays Der Bioassay (biologischer Assay) stellt ein Verfahren dar, bei dem die Wirkung eines Hormons auf einen lebenden Organismus oder in vitro in Zellsystemen durch direkte Gabe untersucht wird. Die Messung der Effekte erfolgt qualitativ oder quantitativ. Wegen der oft aufwändigen Durchführung kommen Bioassays heute in der Labordiagnostik nur noch selten und nur bei speziellen Fragestellungen zum Einsatz..2.2 Radiorezeptorassays Der Radiorezeptorassay ist eine Methode zur Rezeptoranalyse, mit der die Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von Hormonen untersucht werden können. Dem Assay liegt eine Hormon-Rezeptor-Interaktion zugrunde, die sättigbar, kompetitiv und reversibel ist. Durch radioaktivmarkierte Hormone werden in direkten Bindungsversuchen zwischen der spezifischen Bindung an den Rezeptor (hohe Affinität) und der unspezifischen Bindung an z. B. Gewebe (geringe Affinität) unterschieden..2.3 Immunoassays Die meisten Hormonassays werden heutzutage nach dem Prinzip des kompetitiven Bindungsassays durchgeführt. Der Prototyp des kompetitiven Bindungsassays ist der Radioimmunoassay (Radioimmunoassay, RIA;. Abb..1). Die fundamentalen Bestandteile eines RIA sind: 1. radioaktiv-markiertes (»heißes«) Hormon, der sog. Tracer, 2. unmarkiertes (»kaltes«) Hormon, das im Standard und in der Probe enthalten ist und 3. der spezifische Antikörper. Radioisotope des Tritiums (Betastrahler) oder des Jods (Gammastrahler) werden in das Steroid- oder Proteohormon eingebaut (»Markierung«), was die Immunreaktivität des Hormons nicht beeinflussen sollte. Der Tracer und der Analyt bzw. das Standardhormon konkurrieren nun um die Bindungsstellen am Antikörper. Die Mengen an eingesetztem Tracer und Antikörper bleiben konstant. Für die Standardkurve werden die Konzentrationen an Standardhormon schrittweise erhöht. Die Reaktionen laufen nun in den Teströhrchen so lange ab, bis sich ein Reaktionsgleichgewicht eingestellt hat. Danach wird das ungebundene, freie Hormon von den Antikörperhormonkomplexen abgetrennt. Die von den gebundenen Antikörperhormonkomplexen emittierte Radioaktivität wird gemessen und die Standardkurve erstellt. Ausgehend von Standard 0, bei dem eine maximale Tracermenge vom Antikörper gebunden wird, nimmt mit steigender Konzentration an Standardhormon die Menge an antikörpergebundenem Tracer reziprok ab (. Abb..2). Die beim RIA verwendeten Antikörper gehören hauptsächlich zu der Gammaglobulin-(IgG)-Klasse der Immunglobuline und sind entweder monoklonaler oder polyklonaler Natur. Um die Kreuzreaktivität mit strukturähnlichen Hormonen gering zu halten, sollte der Antikörper spezifisch für das zu untersuchende Hormon sein. Dies wird erreicht über die sog. Paratope im variablen Bereich der V-Domäne beim Antikörper, die ein bestimmtes Epitop beim Hormon erkennen und nach dem Schlüssel-Schloss- Prinzip binden. Die Bindung erfolgt über nonkovalente Kräfte. Daher sind, wie bei einer Enzym-Substrat-Reaktion, die Bindungen reversibel.. Abb..1. Schematische Darstellung eines Radioimmunoassays Antikörper. Zur Präzipitation der Antigen-Antikörper-Komplexe wird (RIA). Kompetitive Bindung des unmarkierten und des radioaktivmarkierten ein zweiter unspezifischer Antikörper verwendet Antigens um die Bindungsstellen am spezifischen ersten

5 72 Kapitel Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie. Abb..2. Linearisierter Plot mit Standarddaten eines Radioimmunoassays (RIA). Der Hormongehalt einer Probe kann über die X-Achse ermittelt werden, die die prozentuale Bindung (hier 0%) angibt. Kalkulationen von der Regressionslinie werden generell mithilfe eines Computers durchgeführt. Ak Antikörper, H Standardhormon, H* radioaktiv-markiertes Hormon Zur Herstellung von Antikörpern wird das reine Hormon in bestimmte Tierspezies injiziert. Kleine Moleküle (Haptene) wie Steroide, Peptidhormone oder Prostaglandine besitzen kaum oder keine Antigenität. Sie müssen für die Immunisierung kovalent an einen immunogenen Carrier (wie z. B. Albumin oder Hämozyanin) gekoppelt werden, um eine immunologische Antwort zu erzielen. Um eine starke Immunantwort zu provozieren, werden Hormone (Proteohormone oder carriergekoppelte Hormone) zusammen mit einem Adjuvans (z. B. komplettes Freund- Adjuvans) injiziert. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist komplizierter. Wie bei der Gewinnung polyklonaler Antikörper wird eine bestimmte Tierspezies (meistens Mäuse) mit hormon- oder carriergekoppeltem Hormon immunisiert. Danach werden Milzzellen, die nur einen einzigen Antikörpertyp sezernieren (aus einem einzigen B-Zellklon = monoklonal), isoliert und mit Myelomazellen fusioniert. Diese immortalisierten Hybridomazellen verbleiben in Kultur und stellen somit eine kontinuierliche Antikörperquelle dar. Vor der Radioaktivitätsmessung ist es erforderlich, die Antikörperhormonkomplexe vom freien, ungebundenen Hormon zu trennen. Eine geeignete und bei vielen kommerziell erhältlichen Kits verwendete Methode ist die Festphasentrennung. Hierbei sind die Wände der eingesetzten Teströhrchen vor- ab mit dem spezifischen Antikörper beschichtet. Ein Zentrifugationsschritt ist nicht erforderlich und das ungebundene Hormon wird mit dem Überstand dekantiert. Bei der Adsorptionsmethode bindet das freie Hormon an bestimmte Oberflächen, wie z. B. dextranumhüllte Aktivkohle oder Silikate, das dann durch Zentrifugation von der gebundenen Fraktion getrennt wird. Die Methode der Präzipitation basiert auf der Zugabe eines zweiten Antikörpers, der den ersten spezifisch erkennt und bindet. Durch Zentrifugation pelletiert der Antikörperhormonkomplex am Boden des Teströhrchens und das freie Hormon bleibt im Überstand. Weitere analytische Verfahren, die auf dem gleichen Prinzip des Radioimmunoassays basieren, sind Proteinbindungsassay, Szintillationsassay, Enzymimmunoassay (EIA), Fluoroimmunoassay (FIA) und Chemolumineszenzassay (CIA). Dem Proteinbindungsassay fehlt die Spezifität des Immunoassays. Beim EIA, FIA und CIA ist das radioaktive Hormon durch einen enzym-, fluoroeszein-, oder luminolmarkierten Liganden ersetzt. Die Quantifizierung erfolgt beim FIA durch ein Fluorometer und beim CIA durch ein Luminometer, während beim EIA durch den Enzym- Substrat-Abbau die Werte im Photometer errechnet werden. Im Gegensatz zu den kompetitiven Assays, bei denen der Antikörper durch seine konstante Konzentration limitierend wirkt, wird beim Antikörper-Exzessimmunoassay der spezifische Antikörper im Überschuss zugegeben. Der immunoradiometrische Assay (IRMA) und der enzymgebundene immunosorbente Assay (ELISA;. Abb..3) stellen solche Exzessimmunoassays dar. Bei beiden Assays findet die sog. Sandwichtechnik Anwendung, bei der der Ligand bzw. das Hormon von zwei Antikörpern an unterschiedlichen Epitopen gebunden wird. Der erste Antikörper (Fängerantikörper) ist dabei kovalent oder adsorptiv an eine feste Phase gekoppelt. Der zweite Antikörper (Detektionsantikörper) ist beim IRMA radioaktiv markiert und beim ELISA mit einem Enzym konjugiert, das ein colorimetrisch nachweisbares Substrat abbaut. Nichtradioaktive Verfahren wie ELISA verbreiten sich immer mehr, weil sie kostengünstiger und ungefährlicher für Personal und Umwelt sind. Allerdings ist der ELISA i. Allg. weniger sensitiv als der RIA.

6 .2 Prinzipien der Hormonbestimmungsmethoden 73. Abb..3. Schematische Darstellung eines ELISA (enzymgebundener Schritt bindet ein enzymgekoppelter Antikörper sekundär an das Antibilisierte immunosorbenter Assay). Im ersten Schritt bindet der immogen. Im dritten Schritt kommt es durch das Enzym zum Substratumsatz, Antikörper das in Lösung schwimmende Antigen. Im zweiten anhand dessen die Antigenkonzentration bestimmt werden kann. Abb..4. Prinzip des gaschromatografischen Analysevorganges. nung des Stoffgemisches (2). Am Säulenausgang erfolgt die Detek- Das Probengemisch (im Lösungsmittel A gelöste Stoffe B tion und über die Auswerteinheit die Aufzeichnung in einem Gas- und C) wird verdampft (1). In der Säule (Kapillare) erfolgt die Auftren- chromatogramm (3).2.4 Chromatografische und massenspektrometrische Nachweismethoden Chromatografische Trennverfahren erlauben die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Die Proben werden i. Allg. in einer flüssigen oder gasförmigen sog. mobilen Phase aufgenommen und dann über die stationäre Phase geleitet. In Abhängigkeit von der Wechselwirkung zwischen dem Analyten sowie mobiler und stationärer Phase eluieren die Komponenten in einer charakteristischen zeitlichen Abfolge. Es gibt zahlreiche unterschiedliche chromatografische Techniken. Derzeit finden chromatografische Techniken vor allem im Rahmen der Gaschromatografie (GC;. Abb..4) sowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (»high performance liquid chromatography«, HPLC) mit unterschiedlichen Detektionsverfahren Anwendung. Ein Massenspektrometer ist ein Gerät mit dessen Hilfe Moleküle in gasförmige Ionen überführt werden. Die Ionen werden entsprechend ihrem Verhältnis Masse zu Ladung (m/z) im Hochvakuum aufgetrennt. Die relative Häufigkeit (Intensität) dieser Ionen wird aufgezeichnet. Grundsätzlich weisen alle Massenspektrometer den gleichen Aufbau auf. Sie bestehen aus einem Einlasssystem, der Ionenquelle, einem Analysator in dem die entstandenen Ionen massenspezifisch getrennt werden und der Registriereinheit, dem Detektor (. Abb..). Bei der GC-MS-Kopplung (Gaschromatografie mit massenspektrometrischer Detektion) werden, im Gegensatz zu den klassischen Detektoren der GC (wie z. B. dem Flammenionisationsdetektor), direkte, strukturbezogene Daten der zu analysierenden Substanzen erhalten. Die GC übernimmt die Aufgabe, die Substanzen aus dem Probengemisch aufzutrennen. Identifizierung und Quantifizierung erfolgen mittels der Massenspektrometrie. In der Steroidanalytik stellt die GC-MS-Kopplung eine bewährte Technik dar, um Steroidmetaboliten sicher zu identifizieren oder neu zu beschreiben. So handelt es sich z. B. bei der GC-MS-Multisteroidanalyse aus Harn um ein nichtinvasives, hochspezifisches und rasches Analysenverfahren, das immer dann eingesetzt werden sollte, wenn Störungen im Steroidstoffwechsel vermutet werden (. Abb..6). Leistungsfähige Methoden erlauben die simultane Bestimmung von ca. 0 Harnsteroidmetaboliten in einem sog. Steroidprofil. Aus der Konstellation der Me-. Abb... Funktionelle Komponenten eines Massenspektrometers

7 74 Kapitel Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie a b. Abb..6. GC-MS-Harnsteroidprofile (Scanläufe) eines Patienten mit 21-Hydroxylasemangel (a) und einem gesunden Mäd Pregnantriol). Die Exkretion der Glukokortikoidmetaboliten ist PT Pregnantriol) und des 21-Deoxykortisols (11-O-PT 11-Oxochen (b). Die arabischen Zahlen geben interne Standards an. Das eher niedrig. THF Tetrahydrokortisol, α-thf α-tetrahydrokortisol, Steroidprofil des Patienten wird dominiert durch die Metaboliten THE Tetrahydrokortison, 11-OH-An 11-Hydroxyandrosteron) des 17-Hydroxyprogesteron (17-OH-PO 17-Hydroxypregnanolon; tabolite kann nichtselektiv (vorurteilsfrei) auf die zugrunde liegende Störung im Steroidstoffwechsel geschlossen werden. Die GC-MS-Harnsteroid-Profilanalyse erlaubt die Diagnostik praktisch aller adrenaler Enzymstörungen im Steroidstoffwechsel. Die Steroidbestimmungen im Harn gewährleisten auch als zeitlich integrale Parameter eine exzellente Therapiekontrolle. Wenn statt vollständiger Massenspektren nur die Ionenströme einzelner ausgewählter Massen registriert werden, erzielt man eine erhebliche Steigerung der Empfindlichkeit. Verwendet man stabilisotopmarkierte Analoga der Analyten als interne Standards, spricht man von Isotopenverdünnungs-/Gaschromatografie-Massenspektrometrie (ID/GC-MS). Auf dem Prinzip der ID/GC-MS beruhen Methoden, die in der Qualitätssicherung den Goldstandard zur Überprüfung von Immunoassays darstellen (Referenzmethoden). Schaltet man zwei Massenspektrometer hintereinander, spricht man von Tandemmassenspektrometrie oder MS- MS. Die zu bestimmende Probe wird im ersten Massenspektrometer ionisiert. Dabei entsteht eine sehr große Anzahl verschiedener Ionen, von denen jene Masse im ersten Massenspektrometer ausgewählt wird, die die substanzspezifischen Ionen enthält. Die ausgewählten Ionen werden dann in eine Stoßkammer geleitet, wo sie mit einem neutralen Gas zusammenstoßen und weiter zerfallen. Diese Zerfallsprodukte werden im nachgeschalteten zweiten Massenspektrometer weiter aufgetrennt und registriert. Die meisten Tandemmassenspektrometer sind sog. Triple- Quadropolgeräte. Die Tandemmassenspektrometrie hat z. B. Einzug gehalten in das Neugeborenenscreening. Die Kopplung mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC-MS- MS) macht diese Technik für Anwendungen im klinischen Bereich interessant. Im Rahmen eines einzigen Messvorganges können ein komplexes Metabolitenprofil erstellt und potenziell bis zu ca. 30 Stoffwechseldefekte erkannt werden (z. B. Phenylketonurie, Fettsäureoxidationsdefekte, Organoazidopathien). Auf dem Gebiet der Steroidanalytik wurden Anwendungen der HPLC-MS-MS für Serumsteroide beschrieben. Auf dem Gebiet der Harnsteroidanalytik reicht das analytische Potenzial der HPLC-MS-MS nicht an das der GC-MS heran.

8 .4 Prä- und postanalytische Aspekte bei der Hormonbestimmung 7.3 Zuverlässigkeit und Validierung von Hormonassays Die analytischen Methoden werden nach ihrer Qualität in Routine- und Referenzmethoden eingeteilt. Bei Routinemethoden handelt es sich um Methoden mit einer für die Anwendung hinreichende Praktikabilität und Zuverlässigkeit. Unter einer Referenzmethode versteht man ein sorgfältig geprüftes Messverfahren zur Bestimmung einer oder mehrere Parameter, bei dem alle Bedingungen und Abläufe exakt beschrieben sind. Darüber hinaus wird eruiert, welches Messverfahren aufgrund seiner Richtigkeit und Präzision geeignet ist, andere Methoden zur Bestimmung derselben Parameter auf Genauigkeit zu überprüfen. Wichtige Kriterien zur Beurteilung der Leistungsfähigkeit einer Methode sind Präzision, Richtigkeit, Sensitivität und Spezifität. Die Präzision eines Assays gibt die Reproduzierbarkeit der Messung eines Analyten in verschiedenen Konzentrationsbereichen an. Man unterscheidet: 4 Intraassaypräzision (Wiederholpräzision oder Präzision in Serie).Sie ist ein Parameter für die Übereinstimmung der Messergebnisse unter Wiederholbedingungen. 4 Interassaypräzision (Präzision von Serie zu Serie). Sie gibt die Übereinstimmung der Messergebnisse bei Bestimmungen aus dem gleichen Material und in demselben Laboratorium in konsekutiven Serien an. Die Richtigkeit beschreibt die Übereinstimmung zwischen dem Mittelwert von Wiederholungsmessungen und dem wahren Wert. Als Oberbegriff für Präzision und Richtigkeit wird der Begriff Genauigkeit verwendet. Die analytische Spezifität einer Methode charakterisiert ihr Potenzial, nur den gesuchten Analyten zu erfassen. Andere Probenbestandteile sollen das Ergebnis der Analyse nicht verfälschen. Unter analytischer Sensitivität versteht man die Eigenschaft einer Methode, benachbarte Konzentrationswerte zu unterscheiden. Sie zeigt, inwieweit sich ein Wert in Abhängigkeit vom Signal des zu messenden Systems verändert. Unter Nachweisgrenze versteht man die untere Grenze des Messbereiches. Diese wird als das sicher vom Untergrund zu unterscheidende Messergebnis definiert. Nach der Entwicklung eines Assays zur Hormonbestimmung muss zur korrekten Interpretation der Ergebnisse auch der Einfluss mehrerer physiologischer Variablen berücksichtigt werden (. Tab..1). Einige Hormone zeigen eine zirkadiane Rhythmik, andere zeigen z. B. einen stressabhängigen Anstieg. Hormonbestimmungen sind teilweise erheblich methodenabhängig. Referenzwerte können nicht ohne weiteres von Labor zu Labor übertragen werden. Es ist daher nötig, für zu messende endokrine analytische Parameter Referenzwerte in einer gesunden Population zu erstellen. Die Umrechnung konventioneller Einheiten in SI-Einheiten zeigt folgende Referenztabelle (. Tab..2). Tab..1. Einfluss physiologischer Parameter auf Hormonkonzentrationen Parameter Zirkadiane Rhythmik Schlaf Pubertät Stress und Belastung Nahrungsaufnahme Alter Geschlecht Menstruationszyklus Körpergewicht Hormone Wachstumshormon, adrenale Steroide Wachstumshormon, Prolaktin LH, FSH, gonadale Steroide, adrenale Steroide, Wachstumshormon, IGF-I, IGFBP-3 Wachstumshormon, Cortisol, Prolaktin Insulin, Glukagon, Wachstumshormon Sexualsteroide, DHEA-S, IGF-I, IGFBP-3 Östradiol, Testosteron, Leptin LH, FSH, Östradiol, Progesteron Wachstumshormon, Leptin DHEA-S Dehydroepiandrosteronsulfat, FSH follikelstimulierendes Hormon, IGF-I»insulin-like growth factor I, IGFBP-3»insulin-like growth factor binding protein 3, LH luteinisierendes Hormon Im Idealfall sollte zur Erstellung des Referenzbereiches die gleiche Methode Einsatz finden wie bei der Bestimmung der Proben und der Einfluss von Parametern wie Geschlecht, Alter und Tageszeit berücksichtigt werden..4 Prä- und postanalytische Aspekte bei der Hormonbestimmung Bereits präanalytisch können sich die zu bestimmenden Messparameter verändern. Man unterscheidet endogene und exogene Einflussfaktoren: 4 Zu den endogenen Einflussfaktoren zählen unabänderliche biologische Gegebenheiten oder unabänderliche individuelle Eigenschaften. Beispiele hierfür sind das Geschlecht, das Patientenalter, Biorhythmen, genetische Einflüsse oder Schwangerschaft. 4 Exogene Einflussgrößen lassen sich zumindest auf lange Sicht beeinflussen durch den Patienten oder den Arzt. Beispiele hierfür sind Lebensgewohnheiten, die Ernährung, Körpergewicht, der Grad der körperlichen Aktivität, psychisch und stressbedingte Veränderungen etc.

9 76 Kapitel Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie. Tab..2. Referenztabelle zur Umrechnung konventioneller Einheiten in SI-Einheiten Substanzen Konventionelle Einheit Umrechnungsfaktor SI-Einheit Steroidhormone Aldosteron ng/dl 0,0277 nmol/l 3α-Androstandiolglukuronid ng/dl 0,021 nmol/l Androstendion ng/dl 0,0349 nmol/l Androsteron ng/dl 0,0349 nmol/l Kortikosteron ng/dl 0,0289 nmol/l Kortisol µg/dl 27,6 nmol/l Kortison µg/dl 0,0277 µmol/l 18-Hydroxykortikosteron ng/dl 0,0276 nmol/l Dehydroepiandrosteron (DHEA) ng/dl 0,0347 nmol/l Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) µg/dl 0,026 µmol/l 11-Desoxykortikosteron ng/dl 0,03 nmol/l 11-Desoxykortisol ng/dl 0,0289 nmol/l 21-Desoxykortisol ng/dl 0,0289 nmol/l Dihydrotestosteron (DHT) ng/dl 0,0344 nmol/l 17β-Östradiol (E 2 ) pg/ml 3,67 pmol/l Östriol (E 3 ) ng/ml 3,47 nmol/l Östron (E 1 ) pg/ml 3,7 pmol/l Etiocholanolon mg/24h 3,443 µmol/24h 17-Hydroxypregnenolon ng/dl 0,03 nmol/l 17-Hydroxyprogesteron µg/l 3,03 nmol/l Pregnanediol mg/24h 3,120 µmol/24h Pregnanetriol mg/24h 2,972 mmol/24h Pregnenolon ng/dl 0,0316 nmol/l Progesteron ng/dl 0,0318 nmol/l Testosteron ng/dl 0,0347 nmol/l Peptidhormone Adrenokortikotropes-Hormon (ACTH) pg/ml 0,2202 pmol/l Angiotensin II pg/ml 0,97 pmol/l Angiotensinogen ng/ml 0, nmol/l Argininvasopressin pg/ml 0,922 pmol/l Kalzitonin (human) pg/ml 0,2926 pmol/l Cholezystokinin (33) pg/ml 0,21 pmol/l C-Peptid mg/dl 33,3 nmol/l 6

10 .4 Prä- und postanalytische Aspekte bei der Hormonbestimmung 77. Tab..2 (Fortsetzung) Substanzen Konventionelle Einheit Umrechnungsfaktor SI-Einheit Follikelstimulierendes Hormon (FSH) mie/ml 44 ng/ml Gastroinhibitorpeptid pg/ml 0,2006 pmol/l Gastrin pg/ml 0,4 pmol/l Glukagon pg/ml 0,2869 pmol/l Wachstumshormon (STH) ng/ml 0,046 nmol/l «Insulin-like growth factor I (IGF-I) ng/ml 0,131 nmol/l «Insulin-like growth factor II (IGF-II) ng/ml 0,134 nmol/l Insulin µie/ml 7,17 pmol/l Luteinisierendes Hormon (LH) mie/ml 7 ng/ml Pankreaspolypeptid pg/ml 0,2390 pmol/l Parathormon (PTH) pg/ml 0,11 pmol/l Plazentalaktogen (human) mg/l 46,30 nmol/l Prolaktin ng/ml 44,4 pmol/l Sekretin pg/ml 0,3272 pmol/l Thyreoideastimulierendes Hormon (TSH) µie/ml Vasopressin pg/ml 0,99 pmol/l 1,2-Dihydroxyvitamin D (1,2(-OH) 2 D) pg/ml 2,4 pmol/l Dopamin pg/ml 6,3 pmol/l Epinephrin (Adrenalin) pg/ml,4 pmol/l 2-Hydroxyvitamin D (2-OHD) ng/ml 2, nmol/l Norepinephrin (Noradrenalin) pg/ml,91 pmol/l Renin (Plasmareninaktivität) ng/h/l 0,77 pmol/h/l Serotonin µg/dl 0,067 µmol/l Thyroxin (Tetraiodothyronin) (T 4 ) µg/dl 12,87 nmol/l Thyroxin, freies (FT 4 ) ng/dl 12,87 pmol/l Triiodothyronine (T 3 ) ng/dl 0,014 nmol/l Triiodothyronin, freies (FT 3 ) ng/ml 1,4 pmol/l Umrechnung konventioneller Einheiten in SI-Einheiten: mit dem Umrechnungsfaktor multiplizieren. Umrechnung der SI-Einheiten in konventionelle Einheiten: durch den Umrechnungsfaktor dividieren

11 78 Kapitel Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie Für eine Reihe von Parametern sind besondere Störfaktoren zu beachten, die bereits bei der Blutentnahme (z. B. Körperlage, Tageszeit der Probennahme), beim Probentransport (geeignete Temperatur, Lichtempfindlichkeit) zu beachten sind. Bestimmte Parameter erfordern spezielle konservierende Maßnahmen (z. B. Säurezusatz bei Bestimmung von Katecholaminen im 24-h-Urin). Analytische Interferenzen können bedingt sein durch Einflüsse von Hämolyse oder Trübungen aber auch durch Medikamente. Zufällige und systematische Fehler können die Analysenergebnisse beeinflussen. Um diese so weit als möglich zu minimieren, sind Qualitätskontrollmaßnahmen erforderlich. Die Ergebnisse von Qualitätskontrollmessungen müssen dokumentiert werden. Es sollte in den Laboratorien ein Regelwerk vorgehalten werden, das eine Qualitätsnachweisführung erlaubt. In der Ergebnismitteilung muss eine eindeutige Zuordnung zum Patienten erfolgen. Ferner müssen das Untersuchungsmaterial eindeutig angegeben und die Resultate unmissverständlich mitgeteilt werden. Die Analysenresultate müssen dokumentiert werden.. Praktische Aspekte..1 Kasuistik zur Diagnostik des 21-Hydroxylasemangels im Neugeborenenalter Bei einem reifen männlichen Neugeborenen wird am 4. Lebenstag das Neugeborenenscreening abgenommen und im Fersenblut ein erhöhter Wert für 17-Hydroxyprogesteron festgestellt. Zur Konfirmationsdiagnostik wird das Baby in einer Universitätskinderklinik vorgestellt. Mit dem dort vorgehaltenen Immunoassay für 17-Hydroxyprogesteron wird ein erhöhter Wert von 832 ng/dl gemessen und der Verdacht auf ein adrenogenitales Syndrom (AGS) geäußert. Daraufhin holen die Eltern eine zweite Meinung an einer weiteren Universitätskinderklinik ein. Bei der dort durchgeführten Untersuchung findet sich mit dem in diesem Haus vorgehaltenen Assay ein Serum-17-Hydroxyprogesteronwert von 194 ng/dl. Im Serum beträgt die Natriumkonzentration 138 mmol/l und die Kaliumkonzentration, mmol/l. Zeitgleich wird eine Spontanurinprobe ( ml) zur Erstellung eines Harnsteroidprofils eingesendet. Dieses zeigt eine für ein Neugeborenes unauffällige Metabolitenkonstellation, die AGS-Parameter sind nicht erhöht, die Kortisolmetaboliten sind normal, das Profil wird dominiert von sog. Foetalzonensteroiden (während der Neugeborenenperiode ausgeschiedene - en-steroide). Kommentar: Die Antikörper der Immunoassays für 17-Hydyroxyprogesteron zeigen eine erhebliche Kreuzreaktivität gegenüber den in großer Menge vom Neugeborenen produzierten Foetalzonensteroiden der Nebennierenrinde. Die physikalisch-chemische Bestimmungsmethode der GC-MS ist unabhängig vom Phänomen der Kreuzreaktivität und damit wesentlich spezifischer...2 Fallstricke bei der Bestimmung von Wachstumsfaktoren»Insulin-like growth factor-i«-(igf-i-)messungen im Serum werden vor allem in der Diagnostik von Wachstumsstörungen eingesetzt. IGF-I (und IGF-II) sind in der Zirkulation an IGF-Bindungsproteine (IGFBP-1 bis -6) gebunden. Die IGFBP interferieren in Immunoassays massiv und müssen durch geeignete Maßnahmen ausgeschaltet werden. Eine etablierte Methode ist die Blockierung durch einen Überschuss an IGF-II. In Serum oder Ethylendiamintetraacetat-(EDTA-)Plasma sind IGF-I und IGFBP relativ stabil, was die Probenbehandlung und -verschickung (bei Raumtemperatur) einfach macht. Das quantitativ dominierende IGFBP ist IGFBP-3. Der wichtigste Regulator für IGF-I und IGFBP-3 ist das Wachstumshormon (STH, somatotropes Hormon), das einen stimulierenden Effekt hat. Bei einem ausgeprägten STH- Mangel sind IGF-I und IGFBP-3 erniedrigt, bei Akromegalie und hypophysärem Gigantismus erhöht. Bei der Interpretation der Ergebnisse muss die starke Altersabhängigkeit mit einem hohen Gipfel während der Pubertät, besonders von IGF-I, berücksichtigt werden. Neben STH beeinflussen eine Reihe anderer Hormone und Faktoren die IGF-I- und IGFBP-3-Spiegel im Serum: 4 Erniedrigte Werte finden sich vor allem bei Nahrungskarenz, Malabsorption, schweren Erkrankungen (systemische entzündliche Erkrankungen, maligne Erkrankungen), nach schwerem Trauma, bei Leberinsuffizienz, bei unbehandeltem Diabetes mellitus oder bei Hypothyreose. 4 Erhöhte Werte finden sich bei Niereninsuffizienz, Pubertas praecox oder ausgeprägter Adipositas im Kindesalter (trotz niedrigem STH).! Die Interpretation der Serumspiegel muss notwendigerweise solche Störungen berücksichtigen. Dies wird häufig übersehen. IGF-I- und IGFBP-3-Messungen werden auch zum Monitoring einer STH-Therapie eingesetzt. Supranormale Wer-

12 Literatur 79 te von IGF-I sollten wegen des potenziell stimulierenden Effekts auf Neoplasien vermieden werden. Ein unzureichender Anstieg während der STH-Therapie kann auf Non-Compliance hinweisen. In diesem Zusammenhang ist die Pharmakodynamik zu berücksichtigen. Bei Patienten mit Wachstumshormonmangel fallen nach Aussetzen der STH-Gaben die IGF-I-Spiegel relativ rasch (1 3 Tage) auf niedrige Ausgangswerte zurück. IGFBP-3 ist in dieser Hinsicht robuster. Der Abfall zieht sich über Tage bis eine Woche hin. Literatur Blum WF, Schweizer R (2003) Insulin-like growth factors and their binding proteins. In: Ranke MB (ed) Diagnostics of endocrine function in children and adolescents, 3rd edn. Karger, Basel, pp Hindmarsh PC (2001) The european training syllabus in paediatric endocrinology and diabetes. Horm Res 6: Sόlyom J, Wudy SA, Homoki J (1994) Hormondiagnostik im Kindesalter. Marseille, München Wudy SA, Hartmann MF (2004) Gas chromatography-mass spectrometry profiling of steroids in times of molecular biology. Horm Metab Res 36: