Labor Physik und Photonik. Lasertechnik - Versuch 5 - Technische Optik Mikroskop

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1 ZUR GESCHICHTE DES MIKROSKOPS: HISTORISCHE UND NEUZEITLICHE MIKROSKOP - HERSTELLER GRUENDERZEIT Ende des 19. Jahrhunderts beginnt die Zeit der großen Firmengründungen. Das etabliert sich als wissenschaftliches und technisches Instrument, der bau wird lukrativ. In schneller Folge werden nun e für die verschiedensten wissenschaftlichen Zwecke entwickelt. Die Leistungsfähigkeit der Objektive und Okulare wird auf ein ungeahntes Niveau gesteigert. Verschiedene Zubehörteile wurden angeboten. Der europäische Standardtubus von 160 mm Länge setzt sich durch. Objektivrevolver, Grob- und Feintriebe zur Scharfstellung und die Beleuchtungseinrichtungen werden perfektioniert. CARL ZEISS 1846 lässt sich Carl Zeiss in Jena nieder und befasst sich mit dem Bau einfacher und zusammengesetzter e. Mit den Mathematikern Wilhelm Barfuss und Ernst Abbè sowie dem Glasfachmann Otto Schott begründet Carl Zeiss den 1/7

2 wissenschaftlichen bau. Zum ersten Mal werden objektive aufgrund von optischen Berechnungen entwickelt. ERNST LEITZ 1869 übernimmt Ernst Leitz in Wetzlar das von Carl Keller gegründete "Optische Institut". Die Einführung der Serienproduktion, welche dank wissenschaftlich optischer Berechnungsgrundlagen möglich wurde, lässt die Firma in kürzester Zeit zu einer der erfolgreichsten dieses Industriezweiges heranwachsen. Leitz bringt 1882 ein eigenes Ölimmersionssystem heraus, das qualitativ gut und preisgünstig ist. CARL REICHERT 1876 beginnt Carl Reichert in Wien e nach Leitz'schem Vorbild zu bauen. Berühmt wird sein umgekehrtes, das sich als Metallmikroskop im technischen Bereich durchsetzt. Das erste Exemplar wird an die Firma Krupp in Essen ausgeliefert. Grosse Verdienste erwirbt sich die Firma Reichert auch durch die Einführung von Fluoreszenzmikroskopen. Große hersteller heute (alphabetisch): Leica, Nikon, Olympus, Zeiss 1 ZUR VORBEREITUNG 1.1 Begriffe und Methoden der ie und Mikrometrie Begriffe, die Sie kennen sollten: Tubuslänge, Abbildungsmaßstab, Objektiv, Okular, Blenden, Schärfentiefe, Auflösung, Vergrößerung, Köhler-Beleuchtung Methoden in der ie Die jeweilige Wahl der Methode richtet sich nach der Art des Objektes (durchsichtig, undurchsichtig) und hat ansonsten eine Kontrastverbesserung zum Ziel: 2/7

3 Durchlicht-ie / transmitted light microscopy Hellfeld / brightfield Dunkelfeld / darkfield Polarisiertes Licht / polarized light Phasenkontrast / phase contrast Interferenz-Kontrast / interference contrast (Speckle-Interferometrie) Auflicht-ie / reflected light microscopy Hellfeld / brightfield Dunkelfeld / darkfield Fluoreszenz / fluorescence Polarisiertes Licht / polarized light Die Standard-Bauform eines s ist so gestaltet, dass das Objekt von oben betrachtet wird, d.h. der Objekttisch befindet sich unterhalb des Objektivs. Das Licht wird entweder auch von oben, d.h. von der Betrachtungsseite, zugeführt (Auflicht), oder von unten durch das Objekt hindurch (Durchlicht). Daneben gibt es noch das entsprechende Gegenstück, ein Umgekehrtes. Es ist verbreitet in der Metallurgie. Das Objekt liegt oben auf dem (zu betrachtende Seite unten) und wird von unten beleuchtet und betrachtet. Die Beleuchtung erfolgt immer von der Betrachtungsseite her, man spricht von Auflicht. Messen mit dem Was ist Mikrometrie? Hierzu zählen alle denkbaren Messungen, die mit einem durchgeführt werden: Lineare Messung, Flächenmessung, Volumenmessung. Messung von Länge (x-komponente, y-komponente, und Berechnung der resultierenden Länge), (Schicht-) Dicke, Bohr-/ Ätztiefe (z-achse). Durchmesser, Winkel. Serienmessung z.b. von parallelen Linien, Ketten-Messung; Partikelzählung (z.b. Zellen in 3/7

4 biologischen Präparaten) innerhalb einer definierten Teilfläche, Verschiebung, Drehung, Geschwindigkeitsmessung bei langsamen Bewegungen. Messung durch kalibrierte Verschiebung des Objektes in x-, y- oder z-richtung, evtl. auch Drehung, oder durch Vergleichsmessung mit einem bekannten, kalibrierten Objekt. Den Vergleichsmaßstab hierzu liefert dabei ein Objekt- Mikrometer, ein Okular- Mikrometer, und/oder wie bei uns die Geometrie des CCD- Bildsensors einer Digital-Kamera als Bestandteil eines Kameraund Software-gestützten Meßsystems. Daneben sind folgende Messarten, zum Teil nur mit einem Spezial- oder Spezial-Zubehör, möglich: Farbmessung, Dichtemessung (Mikro-Densitometrie); Fluoreszenzmessung. Mikro-Profilmessung mittels Speckle- Interferometrie oder mittels konfokaler ie. Vorbereitung zum Messen: Kalibrierung Wir beschränken uns hier auf Längen- und Tiefenmessungen und die Bestimmung daraus abgeleiteter Größen. Vor der eigentlichen Messung muss die Messvorrichtung (, xyz-tisch, Kamera) kalibriert werden. Ohne Kalibrierung oder wenigstens gleichzeitige Aufnahme eines bekannten Objektes ist keine Messung möglich (notwendig ist die Berücksichtigung aller -Parameter wie Objektiv- und Zwischenlinsen-Vergrößerung, Okularmaßstab, Pixelabstand auf dem Kamera-Bildsensor, Kamera-Mikrometer, etc.). Zur Durchführung der Kalibrierung gehören: Aufnahme eines kalibrierten Objektes, z.b. linearer Maßstab, Kreis, Winkel, Rechteck / Quadrat, Stufe (Höhe, z-achse, z.b. ein Objekt mit einer Linienstruktur mit bekannter Schichtdicke). Kalibrieren der Verschiebung des Objekttisches in x-, y- und z- Richtung, z.b. mit Objekttisch-Mikrometer (Stage-micrometer). Daraus folgt dann die Kalibrierung des s mit seinen 4/7

5 Objektiven und Zwischenlinsen und der CCD- Kamera, sowie, falls auch noch vorhanden, der Meß-Okulare. Ziel der Kalibrierung ist ein verlässlicher Mikrometerwert der benutzten Objektiv-Okular-/Kamera- Kombination, d.h. man benötigt einen Zusammenhang zwischen einer definierten Strecke im Präparat (in der Objektebene) und dem entsprechenden Maß in der Bildebene, z.b. in Form eines Teilstrichabstands der benutzten Okular-Strichplatte, falls vorhanden, bzw. heute eher als Pixelabstand der Kamera (in x- und y- Richtung, weil diese möglicherweise unterschiedlich sind). Als Pixel werden die einzelnen Bildelemente des Kamera-Bildsensors bezeichnet. Bildanalyse Heute schon weit verbreitet ist ein Bildverarbeitungs- und Analysesystem (image processing and analysis system) auf der Basis einer meist digitalen CCD Kamera (häufig mit Fire Wire Schnittstelle oder Camera-Link- Schnittstelle). Das aufgenommene und gespeicherte Bild alleine reicht jedoch noch nicht. Hinzu kommen noch: Speicherung der Kalibrierdaten, Automatisierung der Meßabläufe, Archivierung der Meßergebnisse zusammen mit den Abbildungen des Objektes, und häufig auch eine Nachbearbeitung der Aufnahmen zur Optimierung für die Bildauswertung. 1.2 Grundlagen der ie und des mikroskopischen Messens Gegenüber einer einfachen Lupe erreicht man mit einem eine viel höhere Vergrößerung. In der historischen Grundform besteht das Gerät aus zwei Positivlinsen, einer Objektivlinse mit kleiner Brennweite nahe am Objekt und einer Lupe als Okular. Dabei erzeugt das Objektiv ein reelles Zwischenbild, das durch die Lupe vergrößert gesehen wird. Die Objektlage ist dabei außerhalb der Brennweite des Objektivs. Benutzt man allgemein eine Lupe, um das Auge bei der Betrachtung von Bildern zu unterstützen, die durch ein weiteres optisches System (Objektiv) erzeugt werden, so nennt man diese Lupe ein Okular. Man 5/7

6 benutzt dabei in der Regel Linsenkombinationen, um z.b. mit 2 Linsen Farb-(quer)fehler auszugleichen. Bei Beobachtung mit dem Auge richtet man das so ein, dass das Zwischenbild gerade innerhalb der Objektbrennweite oder genau im Abstand der Objektbrennweite des Okulars entsteht. Befindet sich das Auge nahe dem Okular, so sieht man ein virtuelles Bild, das umgekehrt und stark vergrößert ist. Die Objektivlinse wirkt als Eintrittspupille des optischen Systems. Das Bild der Objektivöffnung, das durch das Okular erzeugt wird, ist die Austrittspupille. Am Ort der Austrittspupille ist die Bestrahlungsstärke maximal, dies ist deshalb die optimale Position für die Eintrittspupille des Auges. Eine spezielle Blende, die als Feldblende wirkt, befindet sich am Ort des Zwischenbildes. Das Auge sieht dann beide scharf abgebildet, was dem Bildfeld eine scharf definierte Grenze gibt. Benutzt man das zusammen mit einer Kamera, so benötigt man ein reelles Endbild. In diesem Fall liegt das Zwischenbild außerhalb der Okularbrennweite, das Okular projiziert in diesem Fall das Bild auf den Film oder den Bildaufnahme-Chip der Kamera. Alternativ dazu kann ein Zwischenobjektiv und ein Spiegelsystem mit Spiegelumschaltung oder Strahlteiler eingefügt werden, so dass der Strahl wahlweise zur Kamera oder zum Okular oder über einen Strahlteiler aufgeteilt in beide Richtungen (unter Helligkeitsverlust) gleichzeitig geleitet werden kann. Bei optimaler Auslegung und Einstellung kann dann die einstellung (Fokussierung) gegenüber der beim direkten Betrachten mit dem Auge gleich bleiben. Dies ist exakt nur möglich bei einem im Unendlichen liegenden Zwischenbild, d.h. es gibt einen Bereich mit parallelem Strahlengang, in den Zusatz-Elemente ohne Störung des Bildes eingefügt oder aus dem sie wieder entfernt werden können. Diese Art von en setzt sich langsam immer mehr durch. Gesamtvergrößerung Betrachtet man das Endbild mit dem Auge, so kann man die Vergrößerung des s wie im Fall der Lupe definieren. Es gilt: 6/7

7 1.3 Die Winke 7/7