3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
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- Bettina Giese
- vor 8 Jahren
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1 3.2. Ergebnisse Probenentnahme Von 100 Rotfüchsen waren 78 Tiere mit Schildzecken und 41 mit Flöhen befallen. Bei 15 Füchsen konnte weder ein Zecken- noch ein Flohbefall festgestellt werden. Beim überwiegenden Teil der Füchse wurden bis zu 10 Zecken abgesammelt (Tab. 9). Eine jahreszeitliche Abhängigkeit des Ektoparasitenbefalls konnte nicht festgestellt werden. Tab. 9: Anzahl abgesammelter Zecken pro Fuchs Zecken > 20 Füchse Unter den insgesamt 593 Ixodes-Zecken waren 142 Nymphen und 451 Adulte. Die Bestimmung der Zecken ergab eine Befallsintensität mit I. ricinus von 92,6 %, mit I. hexagonus von 6,6 % und mit I. canisuga von 0,8 %. Eine Zuordnung zu den einzelnen Spezies erfolgte nur bei den Nymphen und den geschlechtsreifen Weibchen und Männchen. Die Flöhe wurden nicht in Spezies unterteilt. Der positive Tetrazyklinnachweis in den Kieferknochen in 72% der untersuchten Tiere bewies die hohe Aufnahmerate von ausgelegten Tollwutködern. Die Ergebnisse der Probenentnahme sind in der Tab. 10 (siehe Anhang) zusammengefasst Bakteriologische Untersuchungen zum Nachweis von B. burgdorferi s.l. Die kulturelle Anzucht zum Nachweis von Borrelien in Hautproben von Rotfüchsen gelang nicht. In den Kulturröhrchen von 26 Füchsen (Tab. 10, siehe Anhang) konnten aber unbewegliche, spirochätenähnliche Organismen im Dunkelfeldmikroskop
2 (Fa. Zeiss) bei facher Vergrößerung festgestellt werden (Abb. 5). Nach ca. 1 Woche wurden diese in der Subkultur wieder nachgewiesen. In der Tab. 3 ist die Zuordnung der Füchse zu den beiden Medien mit den entsprechenden Antibiotikazusätzen zu erkennen. Tab. 3: Wachstum der spirochätenähnlichen Gebilde in Abhängigkeit vom Medium und von Antibiotikazusätzen Fuchs BSK II-Medium MKP-Medium 7 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 16 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 19 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 21 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 31 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 36 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 46 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 49 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 51 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 52 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 55 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 59 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 62 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 63 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 74 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 77 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 78 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 79 + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 80 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 81 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 82 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 83 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 84 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 89 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) 97 + (5-Fluorouracil+Kanamycin) + (Rifampicin+5-Fluorouracil+Amphotericin B) 98 + (5-Fluorouracil+Kanamycin)
3 BSK II-Medium: 11 mal + (5-Fluorouracil + Kanamycin) 5 mal + (Rifampicin + 5-Fluorouracil + Amphotericin B) MKP-Medium: 8 mal + (5-Fluorouracil + Kanamycin) 6 mal + (Rifampicin + 5-Fluorouracil + Amphotericin B) Diese spirochätenähnlichen Gebilde wuchsen bei 15 Tieren im BSK II-Medium, bei 13 Tieren im MKP-Medium und bei 2 Tieren in beiden Medien. Beim Fuchs 63 waren sie im BSK II-Medium und beim Fuchs 97 im MKP-Medium sowohl in der Hemmstoffkombination (5-Fluorouracil + Kanamycin) als auch (Rifampicin + 5-Fluorouracil + Amphotericin B) sichtbar. Nach erfolgreicher Anzüchtung auf Tryptose-Agar waren zwei Kolonieformen bei Henry scher Beleuchtung sichtbar. Zum einen waren es starktexturierte, bazillenähnliche Kolonien und zum anderen feintexturierte Kolonien, die denen der Corynebakterien ähnelten. Nach Verbringen in Kulturmedium konnten nach einigen Tagen die unbeweglichen, spiralförmigen Gebilde reproduziert werden. Diese wurden dann in der PCR analysiert und gaben keine Hinweise für das Vorliegen von Borrelien. Elektronenmikroskopisch waren unspezifische Flagellenbündel zu erkennen (Abb. 6). Abb. 5: unbewegliche, spirochätenähnliche Gebilde im Dunkelfeldmikroskop (Originalvergrößerung 1:400)
4 Abb. 6: elektronenmikroskopische Aufnahme der spirochätenähnlichen Gebilde Serologische Untersuchungen zum Antikörper-Nachweis mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Anti-Borrelia-IgG konnte im Blutserum der immunisierten Füchse (Vorversuch) nachgewiesen werden. Die Ratio lag im Bereich von 1,32 bis 1,44. Die Vollblutseren aller untersuchten Rotfüchse waren sowohl im Viramed -Testkit als auch im laboreigenen ELISA-Test seronegativ Untersuchungen zum Antigen-Nachweis in den Zecken mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IIFT) Einsatz polyklonaler Antikörper Mit dem Hyperimmunserum gegen B. garinii, Stamm 1 B 29, reagierten von 100 Zeckenproben 45 positiv (Tab. 11, 13)
5 Einsatz monoklonaler Antikörper Mit den monoklonalen AK gegen OspA reagierten von 100 Zeckenproben 18 positiv (Tab. 11, 13). Kontrollzecken: Alle 17 negativen Kontrollzecken reagierten sowohl mit den polyklonalen AK als auch mit den monoklonalen AK negativ. Von den 4 positiven Kontrollen reagierten 2 Zecken mit beiden AK positiv Spezifischer B. burgdorferi s.l. DNS-Nachweis in den Zecken und Hautproben mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Analytische Spezifität und Sensitivität der PCR Alle 15 getesteten Stämme der Spezies B. burgdorferi s.l. zeigten die erwarteten Amplifikationsprodukte von 259 bp (JS 1/2; Abb. 7), 308 bp (SL 1/2) und 662 bp (nested-pcr: außen) bzw. 392 bp (nested-pcr: innen). Die 17 mituntersuchten Kontrollzecken reagierten regelmäßig negativ (Spezifität 100 %). Zur Überprüfung der Sensitivität wurden Zeckengemische bzw. Hautproben vom Rotfuchs mit vier unterschiedlichen Borrelienkonzentrationen (100 fg; 10 fg; 1 fg; 0,1 fg B. burgdorferi s.l.-dns) versetzt (Abb. 8). Die beiden PCR aus dem Vorversuch konnten bis zu 10 fg Borrelien-DNS (10 Borrelien) nachweisen. Die nested-pcr erwies sich dagegen mit einer Nachweisgrenze von 1 fg Borrelien-DNS (< 1 Borrelie) am empfindlichsten. Die nachfolgenden Untersuchungsergebnisse beziehen sich daher auf die nested-pcr
6 Spur: Abb. 7: Amplifikationsprodukte verschiedener Stämme von B. burgdorferi s.l. oben Spur 1: leer unten Spur 1: leer Spur 2: Negativkontrolle (Wasser) Spur 2: 100 bp DNS-Längenstandard Spur 3: Positivkontrolle Spur 3: B. afzelii (97 B 3) Spur 4: B. garinii (1 B 29) Spur 4: B. afzelii (97 B 3) Spur 5: B. burgdorferi s.s. (93 B 22) Spur 5: B. afzelii (97 B 3) Spur 6: B. afzelii (97 B 3) Spur 6: B. burgdorferi s.s. (B 31) Spur 7: B. burgdorferi s.s. (B 31) Spur 7: B. burgdorferi s.s. (93 B 22) Spur 8: B. burgdorferi s.s. (93 B 22) Spur 8: B. afzelii (97 B 3) Spur 9: B. afzelii (97 B 3) Spur 9: B. garinii (1 B 29) Spur 10: B. garinii (1 B 29) Spur 10: B. burgdorferi s.s. (93 B 22) Spur 11: 100 bp DNS-Längenstandard Spur 11: Positivkontrolle Spur 12: leer Spur 12: Negativkontrolle (Wasser)
7 Spur: Abb. 8: Bestimmung der Nachweisgrenze in der nested-pcr Primersatz: außen Primersatz: innen oben Spur 1: Negativkontrolle (Wasser) unten Spur 1: 100 bp DNS-Längenstandard Spur 2: Positivkontrolle Spur 2: Positivkontrolle Spur 3: 0,1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 3: 0,1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 4: 1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 4: 1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 5: 10 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 5: 10 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 6: 100 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 6: 100 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 7: 100 bp DNS-Längenstandard Spur 7: Negativkontrolle (Wasser) Spur 8: Positivkontrolle (B. burgdorferi) Spur 8: Positivkontrolle Spur 9: 0,1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 9: 0,1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 10: 1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 10: 1 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 11: 10 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 11: 10 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 12: 100 fg B. burgdorferi s.l.-dns Spur 12: 100 fg B. burgdorferi s.l.-dns
8 Untersuchungsergebnisse der PCR In der nested-pcr waren 19 % der Zecken (Abb. 9) und 7 % der Hautproben (Abb. 11) positiv (Tab. 11, 12, 13). Die PCR-Produkte der Zeckenuntersuchung wurden im Southern-Blot-Verfahren bestätigt (Abb. 11). Zusammenfassend sind in der Tab. 13 die positiven Ergebnisse der Zeckenuntersuchung mittels IIFT und PCR gegenübergestellt. Tab. 13: Gegenüberstellung der IIFT- und PCR-Ergebnisse der 100 Zecken von 31 Rotfüchsen pos. Ergebnisse IIFT/polyklonale AK IIFT/monoklonale AK PCR IIFT/polyklonale AK IIFT/monoklonale AK PCR
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