Helicobacter pylori IgM ELISA

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1 Instructions for Use Helicobacter pylori IgM ELISA Enzyme immunoassays for the qualitative and quantitative determination of IgM antibodies against Helicobacter pylori in human serum and plasma. RE x8 2-8 C IBL GESELLSCHAFT FÜR IMMUNCHEMIE UND IMMUNBIOLOGIE MBH FLUGHAFENSTRASSE 52a D HAMBURG GERMANY Phone: +49 (0) IBL@IBL-Hamburg.com Fax: +49 (0)

2 ENGLISH 1. INTENDED USE Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative determination in human serum and plasma. 2. SUMMARY AND EXPLANATION Helicobacter pylori is a µm long twisted or helical gram-negative germ responsible for 80-90% of B- gastritis cases and suspected to a major cofactor for the development of gastric and duodenal ulcers. The classical detection methods of Helicobacter pylori like culturing from mucous membrane biopsies or an urease test are only successful in case of a relative high germ count and require an identification directly after the biopsy. Indirect immunofluorescence (IIF) is also used for the detection Helicobacter pylori infection. The colonisation of the gastric and duodenal mucous membranes with Helicobacter pylori can also be detected serologically using an enzyme immunoassay (ELISA) or by performing a Western Blot. Patients with confirmed exposition to Helicobacter pylori often show a positive serological result. Since antibodies persist for a longer time after a Helicobacter pylori infection seropositive individuals are also found in symptom-free patients. The number of seropositive values rises with age. Using the ELISA and the detection of IgA and IgG antibodies against specific proteins of Helicobacter pylori by Western Blotting it is possible to diagnose an acute infection with Helicobacter pylori, even if no germs can be found. 3. TEST PRINCIPLE Solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on the sandwich principle. The wells are coated with antigen. Specific antibodies of the sample binding to the antigen coated wells are detected by a secondary enzyme conjugated antibody (E-Ab) specific for human IgM. After the substrate reaction the intensity of the color developed is proportional to the amount of IgM-specific antibodies detected. Results of samples can be determined directly using the standard curve. 4. WARNINGS AND PRECAUTIONS 1. For in-vitro diagnostic use only. For professional use only. 2. Before starting the assay, read the instructions completely and carefully. Use the valid version of the package insert provided with the kit. Be sure that everything is understood. For further information (clinical background, test performance, automation protocols, alternative applications, literature, etc.) please refer to the IBL-Homepage. 3. In case of severe damage of the kit package please contact IBL or your supplier in written form, latest one week after receiving the kit. Do not use damaged components in test runs, but keep safe for complaint related issues. 4. Obey lot number and expiry date. Do not mix reagents of different lots. Do not use expired reagents. 5. Follow good laboratory practice and safety guidelines. Wear lab coats, disposable latex gloves and protective glasses where necessary. 6. Reagents of this kit containing hazardous material may cause eye and skin irritations. See MATERIALS SUPPLIED and labels for details. Material Safety Data Sheets for this product are available on the IBL- Homepage or upon request directly from IBL. 7. Chemicals and prepared or used reagents have to be treated as hazardous waste according to national biohazard and safety guidelines or regulations. 8. Avoid contact with Stop solution. It may cause skin irritations and burns. 9. Some reagents contain sodium azide (NaN 3 ) as preservatives. In case of contact with eyes or skin, flush immediately with water. NaN 3 may react with lead and copper plumbing to form explosive metal azides. When disposing reagents, flush with a large volume of water to avoid azide build-up. 10. All reagents of this kit containing human serum or plasma have been tested and were found negative for HIV I/II, HBsAg and HCV. However, a presence of these or other infectious agents cannot be excluded absolutely and therefore reagents should be treated as potential biohazards in use and for disposal. 5. STORAGE AND STABILITY The kit is shipped at ambient temperature and should be stored at 2-8 C. Keep away from heat or direct sun light. The storage and stability of specimen and prepared reagents is stated in the corresponding chapters. The microtiter strips are stable up to the expiry date of the kit in the broken, but tightly closed bag when stored at 2 8 C. Version 1 / / 5

3 ENGLISH 6. SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE Serum, Plasma (EDTA, Heparin) The usual precautions for venipuncture should be observed. It is important to preserve the chemical integrity of a blood specimen from the moment it is collected until it is assayed. Do not use grossly hemolytic, icteric or grossly lipemic specimens. Samples appearing turbid should be centrifuged before testing to remove any particulate material. Storage: 2-8 C -20 C Stability: 2 d > 2 d 7. MATERIALS SUPPLIED 4 x 2 ml CAL A-D 1 x 14 ml ENZCONJ IgM 1 x 12 x 8 MTP 1 x 14 ml TMB SUBS 1 x 14 ml TMB STOP 1 x 60 ml DILBUF 1 x 60 ml WASHBUF CONC 2 x FOIL 1 x BAG Standard A-D 1; 10; 25; 150 U/mL. Ready to use. Standard A = Negative Control Standard C = Weakly Positive Control Keep away from heat or direct sun light. Avoid repeated freeze-thaw cycles. Standard B = Cut-Off Control Standard D = Positive Control Contains IgM antibodies against Helicobacter pylori, PBS, stabilizers. Enzyme Conjugate IgM Red colored. Ready to use. Contains anti-human IgM, conjugated to peroxidase, proteincontaining buffer, stabilizers. Microtiter Plate Break apart strips. Coated with specific antigen. TMB Substrate Solution Ready to use. Contains TMB. TMB Stop Solution Ready to use. 0.5 M H 2 SO 4. Diluent Buffer Ready to use. Contains PBS Buffer, BSA, < 0.1 % NaN 3. Wash Buffer, Concentrate (10x) Contains PBS Buffer, Tween 20. Adhesive Foil For covering of Microtiter Plate during incubation. Plastic Bag Resealable. For dry storage of non-used strips. 8. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 1. RF Adsorbent (can be ordered separately from IBL under REF RE59059) 2. Micropipettes (Multipette Eppendorf or similar devices, < 3% CV). Volumes: 5; 50; 100; 500 µl 3. Calibrated measures 4. Tubes (1 ml) for sample dilution 5. 8-Channel Micropipettor with reagent reservoirs 6. Wash bottle, automated or semi-automated microtiter plate washing system 7. Microtiter plate reader capable of reading absorbance at 450 nm (reference wavelength nm) 8. Bidistilled or deionised water 9. Paper towels, pipette tips and timer 9. PROCEDURE NOTES 1. Any improper handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The indicated pipetting volumes, incubation times, temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only. 2. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Allow all reagents and specimens to reach room temperature (18-25 C) and gently swirl each vial of liquid reagent and sample before use. Mix reagents without foaming. 3. Avoid contamination of reagents, pipettes and wells/tubes. Use new disposable plastic pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange caps. Always cap not used vials. Do not reuse wells/tubes or reagents. 4. Use a pipetting scheme to verify an appropriate plate layout. Version 1 / / 5

4 ENGLISH 5. Incubation time affects results. All wells should be handled in the same order and time sequences. It is recommended to use an 8-channel Micropipettor for pipetting of solutions in all wells. 6. Microplate washing is important. Improperly washed wells will give erroneous results. It is recommended to use a multichannel pipette or an automatic microplate washing system. Do not allow the wells to dry between incubations. Do not scratch coated wells during rinsing and aspiration. Rinse and fill all reagents with care. While rinsing, check that all wells are filled precisely with Wash Buffer, and that there are no residues in the wells. 7. Humidity affects the coated wells/tubes. Do not open the pouch until it reaches room temperature. Unused wells/tubes should be returned immediately to the resealed pouch including the desiccant. 10. PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS Preparation of Components Dilute/ Component dissolve 60 ml Wash Buffer ad 600 ml Diluent bidist. water 1:10 Remarks Storage Stability Warm up at 37 C to dissolve crystals. Mix vigorously. 2-8 C 8 w Dilution of Samples Relation Sample to be diluted with Relation Remarks Serum / Plasma generally Diluent Buffer 1:101 e.g. 5 µl µl Samples containing concentrations higher than the highest standard have to be diluted further Treatment with RF-Absorbent In order to avoid interferences of specific IgG and rheumatoid factors, patient sera should be treated with RF absorbent (REF RE59059). Do not treat standards and controls with RF-Absorbent! 1. Pipette 20 µl of RF-Absorbent to 400 µl of 1:101 diluted sample. Mix well. 2. Incubate 1 min (< 15 min) at RT (18-25 C). Do not incubate > 15 min to avoid adsorption of specific antibodies. Pretreated samples may be turbid. 11. TEST PROCEDURE Pipette 100 µl of each Standard and diluted sample into the respective wells of the Microtiter Plate. In the qualitative test only Standard B is used. Cover plate with adhesive foil. Incubate 60 min at C. Remove adhesive foil. Discard incubation solution. Wash plate 3 x with 300 µl of diluted Wash Buffer. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. Pipette 100 µl of Enzyme Conjugate into each well. Cover plate with new adhesive foil. Incubate 30 min at C. Remove adhesive foil. Discard incubation solution. Wash plate 3 x with 300 µl of diluted Wash Buffer. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. For adding of Substrate and Stop Solution use, if available, an 8-channel Micropipettor. Pipetting should be carried out in the same time intervals for Substrate and Stop Solution. Use positive displacement and avoid formation of air bubbles. Pipette 100 µl of TMB Substrate Solution into each well. Incubate 20 min at C in the dark (without adhesive foil). Stop the substrate reaction by adding 100 µl of TMB Stop Solution into each well. Briefly mix contents by gently shaking the plate. Color changes from blue to yellow. Measure optical density with a photometer at 450 nm (Reference-wavelength: nm) within 60 min after pipetting of the Stop Solution. Version 1 / / 5

5 ENGLISH 12. QUALITY CONTROL The test results are only valid if the test has been performed following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards must be found within the acceptable ranges as stated on the QC Certificate. If the criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation the following technical issues should be proven: Expiration dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 13. CALCULATION OF RESULTS The obtained OD of the standards (y-axis, linear) are plotted against their concentration (x-axis, logarithmic) either on semi-logarithmic graph paper or using an automated method. A good fit is provided with cubic spline, 4 Parameter Logisitcs or Logit-Log. For the calculation of the standard curve, apply each signal of the standards (one obvious outlier of duplicates might be omitted and the more plausible single value might be used). The concentration of the samples can be read from the standard curve. The initial dilution has been taken into consideration when reading the results from the graph. Results of samples of higher predilution have to be multiplied with the dilution factor. Samples showing concentrations above the highest standard have to be diluted as described in PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS and reassayed. Typical Calibration Curve OD 450 nm (Example. Do not use for calculation!) Standard A U/mL 1 Mean B 10 OD C D INTERPRETATION OF RESULTS Helicobacter pylori IgM (U/mL) U/mL Interpretation The results themselves should not be the only reason for any < 8 negative therapeutical consequences. They have to be correlated to other 8-12 equivocal clinical observations and diagnostic tests. > 12 positive 15. EXPECTED VALUES In an in-house study, apparently healthy subjects showed the following results: Interpretation Ig Isotype n positive equivocal negative IgM % 2.8 % 95.8 % 16. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Specimen collection has a significant effect on the test results. See SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE for details. For cross-reactivities, see PERFORMANCE. Azide and thimerosal at concentrations > 0.1 % interfere in this assay and may lead to false results. The following blood components do not have a significant Hemoglobin 8.0 mg/ml effect (+/- 15 % of expected) on the test results up to the Bilirubin 0.3 mg/ml concentrations stated below: Triglyceride 5.0 mg/ml Version 1 / / 5

6 ENGLISH 17. PERFORMANCE Analytical Specificity No cross-reactivities were found (Cross Reactivity) to: RSV, Adenovirus, Yersinia Precision Mean (U/mL) CV (%) Intra-Assay Inter-Assay Linearity Range (U/mL) Serial dilution up to Range (%) / Recovery % % Recovery after spiking (n = 3) Method Comparison Rel. Sensitivity > 95 % versus ELISA Rel. Specificity > 95 % Version 1 / / 5

7 DEUTSCH 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay zur qualitativen und quantitativen Bestimmung in humanem Serum und Plasma. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Helicobacter pylori, ein gramnegatives, spiralförmiges Bakterium mit Flagellen, das die Mukosa des Magens und des Dünndarms besiedelt, wurde 1984 von Warren und Marshall entdeckt. Seitdem weiß man, daß H. pylori ein primärer Verursacher bei der Entwicklung von Magen- und Dünndarm-Ulzera, chronisch aktiver Gastritis, primärem gastrischen B-Zell-Lymphom sowie Adenokarzinom des Magens ist. Beim Dünndarmulkus wurde eine Infektionsrate von 93% und beim Magenulkus von 80% gefunden. Die Behandlung der Patienten mit Kombinationen von H2-Blockern, Wismut und Antibiotika führte zu Heilungsraten von bis zu 90%. Wenn die H. pylori-infektion erfolgreich behandelt ist, liegt die Häufigkeit einer Reinfektion bei unter 0.5% / Jahr. Im Jahre 1994 stellte die NIH Consensus Conference fest, daß H. pylori einen peptischen Ulkus auslöst, zu dessen Behandlung eine antimikrobielle Therapie empfohlen wird. Es gibt eine Reihe von anerkannten Methoden zur Diagnose von H. pylori-infektionen. Bis vor kurzem war die Methode der Wahl die Endoskopie und Biopsie gekoppelt mit einem schnellen Ureasetest sowie Kulturanzüchtung und Histologie. Diese Methoden erfordern jedoch spezielle Geräte und sind personalintensiv. Da man erkannte, daß die H. pylori-infektion mit einer systemischen Immunantwort verbunden ist, wurden als preiswerte Alternative Enzymimmunoassays sowie als Bestätigungstests Western Blots zum Nachweis von IgG-, IgA- und IgM-Antikörpern gegen den Erreger entwickelt. Gegenüber der KBR sowie Latex-Agglutinationsmethoden lassen sich einzelne Immunglobulinklassen differenzieren; wodurch Aussagen über das Stadium der Erkrankung möglich sind. Die Spezifität und die Sensititvität der Tests konnte durch Verwendung von gereinigten Antigenen unter Einschluß der hochmolekularen CagA- und VagA-Proteine verbessert werden. 3. TESTPRINZIP Sandwich-Enzymimmunoassay (ELISA). Die Wells der Mikrotiterstreifen sind mit Antigen beschichtet. Die spezifischen Antikörper der Probe binden an die Antigen-beschichteten Wells und werden von einem zweiten enzymmarkierten Antikörper (E-Ab), der gegen humanes IgM gerichtet ist, detektiert. Die Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion ist proportional zur IgM-Konzentration. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. Weitere Informationen (klinischer Hintergrund, Testcharakteristika, Automatisierung, alternative Anwendungen, Literatur, etc.) finden Sie auf der IBL-Homepage. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 9. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid (NaN 3 ) als Konservierungsmittel. Bei Kontakt mit den Augen oder der Haut gründlich mit Wasser abspülen. NaN 3 kann mit Blei und Kupfer explosive Azide bilden. Bei Entsorgung über das Abwasser gut spülen, um Azidanreicherung zu vermeiden. 10. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf HCV, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Version 1 / / 5

8 DEUTSCH Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8 C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Serum, Plasma (EDTA, Heparin) Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung: 2-8 C -20 C Haltbarkeit: 2 d > 2 d 7. KOMPONENTEN DES KITS 4 x 2 ml CAL A-D 1 x 14 ml ENZCONJ IgM 1 x 12 x 8 MTP 1 x 14 ml TMB SUBS 1 x 14 ml TMB STOP 1 x 60 ml DILBUF 1 x 60 ml WASHBUF CONC 2 x FOIL 1 x BAG Standard A-D 1; 10; 25; 150 U/mL. Gebrauchsfertig. Standard A = Negativkontrolle Standard C = Schwach positive Kontrolle Vor Hitze und Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Standard B = Cut-Off Kontrolle Standard D = Positivkontrolle Enthält IgM Antikörper gegen Helicobacter pylori, PBS, Stabilisatoren. Enzymkonjugat IgM Rot gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält anti-humanes IgM, konjugiert mit Peroxidase, Protein-Puffer, Stabilisatoren. Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. Beschichtet mit spezifischem Antigen. TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält TMB. TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. 0.5 M H 2 SO 4. Verdünnungspuffer Gebrauchsfertig. Enthält PBS Puffer, BSA, < 0.1 % NaN 3. Waschpuffer, Konzentrat (10x) Enthält PBS Puffer, Tween 20. Haftklebefolie Zur Abdeckung der Mikrotiterplatte während der Inkubation. Plastikbeutel Wiederverschließbar. Zur Aufbewahrung der nicht gebrauchten Streifen. 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. RF Adsorbens (kann separat bei IBL bestellt werden unter REF RE59059) 2. Mikropipetten (Multipette Eppendorf oder ähnliche, < 3% VK). Volumina: 5; 50; 100; 500 µl 3. Messzylinder 4. Röhrchen (1 ml) zur Probenverdünnung 5. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 6. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 7. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 8. Bidest. Wasser 9. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr Version 1 / / 5

9 DEUTSCH 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jedes Reagenz, jeden Standard und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 5. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 6. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 7. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. TESTVORBEREITUNGEN Vorbereitung der Komponenten Verd./ rekonst. Komponente 60 ml Waschpuffer ad 600 ml Diluent bidest. Wasser 1:10 Bemerkungen Auf 37 C erwärmen, um Kristalle aufzulösen. Gründlich mischen. 2-8 C Verhältnis Lagerung Haltbarkeit 8 w Probenverdünnung zu Verhältnis Probe mit Bemerkungen verdünnen Serum / Plasma immer Verdünnungspuffer 1:101 z.b. 5 µl µl Proben mit Konzentrationen über dem höchsten Standard müssen weiter verdünnt werden Behandlung mit RF-Adsorbenz Die Standards und Kontrollen dürfen nicht mit RF-Adsorbenz behandelt werden! µl RF-Adsorbenz zu 400 µl der 1:101 verdünnten Probe pipettieren. Gut mischen min (< 15 min) bei RT (18-25 C) inkubieren. Nicht > 15 min inkubieren, da sonst auch spezifische Antikörper adsorbieren. Die behandelten Proben können trüb sein. Version 1 / / 5

10 DEUTSCH 11. TESTDURCHFÜHRUNG Je 100 µl von jedem Standard und jeder verdünnten Probe in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. Im qualitativen Assay wird nur Standard B verwendet. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 60 min bei C inkubieren. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 3 x mit je 300 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 100 µl Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. Platte mit neuer Folie abdecken. 30 min bei C inkubieren. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 3 x mit je 300 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. Substrat- und Stopplösung möglichst mit einer 8-Kanal-Pipette pipettieren und Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. 100 µl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren. 20 min bei RT (18-25 C) im Dunkeln inkubieren. (Ohne Haftklebefolie.) Die Substratreaktion durch Zugabe von 100 µl TMB Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. Die Farbe wechselt von blau nach gelb. Die optische Dichte mit einem Photometer innerhalb von 60 min nach Zugabe der Stopplösung bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge: nm). 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Rest gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP- Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Alle Standards des Kits müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (linlog) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können von der Standardkurve abgelesen werden. Die standardmäßig durchzuführende Verdünnung ist in dem oben beschriebenen Auswerteverfahren bereits berücksichtigt. Wenn Proben anders oder weiter verdünnt wurden, müssen die Ergebnisse mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Typische Standardkurve OD 450 nm (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard U/mL Mittelwert OD A B C D Helicobacter pylori IgM (U/mL) Version 1 / /

11 DEUTSCH 14. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE U/mL Interpretation < 8 negativ 8-12 grenzwertig > 12 positiv Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. 15. NORMWERTE In einer eigenen Studie zeigten offensichtlich gesunde Probanden die folgenden Ergebnisse: Interpretation Ig Isotyp n positiv grenzwertig negativ IgM % 2.8 % 95.8 % 16. GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -LAGERUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Azid und Thimerosal in Konzentrationen > 0.1 % stören im Assay und führen evtl. zu falschen Ergebnissen. Die folgenden Blutbestandteile haben bis zu der Hämoglobin 8.0 mg/ml angegebenen Konzentration keinen signifikanten Einfluss Bilirubin 0.3 mg/ml auf die Testergebnisse (+/- 15 %): Triglyceride 5.0 mg/ml 17. TESTCHARAKTERISTIKA Analytische Spezifität Es wurden keine Kreuzreaktionen (Kreuzreaktivität) gefunden gegen: RSV, Adenovirus, Yersinia Präzision Mittelwert (U/mL) VK (%) Intra-Assay Inter-Assay Bereich (U/mL) Höchste Bereich (%) Linearität Verdünnungsstufe / Wiederfindung % % Wiederfindung nach Spiken (n = 3) Methodenvergleich Rel. Sensitivität > 95 % versus ELISA Rel. Spezifität > 95 % Version 1 / / 5

12 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL - Hamburg GmbH Flughafenstr. 52A, D Hamburg, Germany IBL - Transatlantic LLC th Street, Osceola, WI 54020, USA Tel.: + 49 (0) Fax: ibl@ibl-hamburg.com WEB: Tel.: +1 (715) Fax: ibl@ibl-transatlantic.com WEB: LIABILITY: Complaints will only be accepted in written and if all details of the test performance and results are included (complaint form available from IBL or supplier). Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer. Symbols Version 3.1 /