Klonierung von GFP in E.coli

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1 Bernhard-Strigel-Gymnasium Memmingen Kollegstufe Jahrgang: /2009 Leistungskurs:...Biologie Kollegiatin:...Nicole Makowski Facharbeit Klonierung von GFP in E.coli Abgegeben am: Bewertung: Facharbeit: Note: Punkte: Mündliche Prüfung: Note: Punkte: Datum und Unterschrift des Kursleiters: Eingetragen in das Kursblatt:

2 Inhaltsverzeichnis: 1. Einleitung Material Laborgeräte Chemikalien Methoden Herstellen der Agar-Ampicillin-Platten Ausstreichen der Agarplatten Anlegen einer Übernachtkultur Plasmidpräparation Isolation vom Plasmiden Durchführung der Gelelktrophorese Färbung und Auswertung des Gels Restriktionsverdau der Plasmide mit EcoRI und HindIII Eliminieren des DNA-Fragments aus dem Plasmid phat-gfpuv Klonierung des isolierten DNA-Fragments in pjet1.2/blunt Transformation chemisch kompetenter Zellen Ergebnisse Fehleranalyse des Restriktionsverdaus Anwendung der Cracking-Methode Plasmidisolation Analyse der Plasmidisolation durch Gelelektrophorese Nachwort Quellenverzeichnis Literaturverzeichnis Internetquellen Schülererklärung...19 Anhang 1

3 1. Einleitung Das Thema meiner Facharbeit entstand während eines Praktikums in der 12. Klasse im Biotechnologie Labor des Bernhard-Strigel-Gymnasiums. Wir lernten dort verschiedene Methoden mit dem Bakterium E.coli zu experimentieren wie zum Beispiel in den Themenbereichen der Plasmidisolation, Verdünnungsreihen oder der Transformation von Plasmiden. Die Idee meiner Facharbeit bestand darin, ein DNA-Fragment aus seinem Plasmid mittels Restriktionsenzymen zu schneiden, es daraus zu entfernen, in ein anderes neues Plasmid zu klonieren und in ein Bakterium einzusetzen. Das Besondere an dieser Arbeit war, aus meinem Plasmid phat-gfpuv, das GFP-Konstrukt, das aus einer Qualle kommt, aus dem phat rauszuholen und in ein E.coli Bakterium zu transformieren. GFP (grün fluoreszierendes Protein) wird im Labor sehr häufig verwendet, da es die besondere Eigenschaft besitzt unter UV-Licht zu leuchten. 2. Material 2.1. Laborgeräte Petrischalen Autoklav Bunsenbrenner Impföse Drigalski-Spatel Inkubator Eppendorfcap Pipetten + passende Spitzen Reagenzglas Vortexer Gelelektophorese-Apparatur Gelkamm Schraubdeckelflasche Rührfisch MinElute Säule UV-Leuchttisch Mikrowelle Spannungsquelle Laborwaage 2.2. Chemikalien Agar Steriles Wasser Ampicillin Plasmid phat-gfpuv 2

4 Bakterium E.coli Kits der Firma Quiagen (P1, P2, N3, PB, PE) Gelladungspuffer Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII Elektrophoresepuffer (TAE-Puffer) Ethidiumbromidlösung Puffer Tango Quiagen Puffer QG, EB Isopropanol T4 DNA-Ligase 2 x Reaktionspuffer Enzym, das DNA stumpf macht Nukleasen freies Wasser TransformationAid Bacterial Transfotma- Vektor pjet1.2/blunt tions kit DNA Größenstandart Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM Methoden 3.1. Herstellen der Agar-Ampicillin-Platten Zur Herstellung von in meinem Fall 5 Agarplatten wird zu 1,31 g Lactose-Agar 65 ml Wasser hinzugegeben. Anschließend wird diese Mischung bei 121 C autoklaviert. Mit diesen Verfahren werden die lebensfähigen Keime und deren Dauerstadien abgetötet. ( a) Der Agar wird nach dem Autoklavieren mit 65 µl Ampicillin beimpft, da das Bakterium mit dem Plasmid phat-gfpuv, das eine Ampicillin-Resistenz erhält nur auf Nährböden mit Ampicillin wachsen kann. Als nächstes wird der Agar in flüssigem Zustand (bei C) in 5 sterile Petrischalen ausgegossen. Die Agarplatten lässt man einen Tag bei Raumtemperatur trocknen. Hinweis: Es empfiehlt sich Handschuhe zum Gießen der Platten zu tragen, da der Agar im flüssigen Zustand noch heiß ist Ausstreichen der Agarplatten Mit einer durch einen Bunsenbrenner ausgeglühten Impföse werden Bakterien, die das Plasmid phat-gfpuv enthalten, entnommen und auf die Ampicillin-Agarplatten mittels Drigalski- Spatel ausgestrichen. Die Agarplatten werden dann bei 37 C über Nacht bebrütet. Durch die Ampicillin-Resistenz der Plasmide sollten auf den Ampicillin-Nährböden nach dem Bebrüten Bakterienkolonien entstehen. 3

5 3.3. Anlegen einer Übernachtkultur Dazu wird eine Einzelkolonie der Agarplatte mittels einer Impföse mit 65 µl Ampicillin in ein Kulturmedium übergeimpft. Das sich in dem Reagenzglas befindende Kulturmedium wird danach über Nacht bei 35 C unter Schütteln inkubiert. Befindet sich am daraufliegendem Tag eine trübe Konsistenz in dem Reagenzglas, so sind die Bakterien gewachsen Plasmidpräparation Plasmide und Vectoren sind wichtige Hilfsmittel der Molekularbiologen. Mit ihrer Hilfe werden gezielt Gene in Organismen eingeschleust. So entsteht ein gentechnisch veränderter Organismus, der neue Eigenschaften erhalten hat ( b) Isolation von Plasmiden Alle essentiellen Gene von Organismen sind auf der DNA kodiert. Aus diesem Grund wird die DNA für Experimente mit Genen isoliert. Die Länge der DNA ist bei jedem Organismus unterschiedlich ( c). Die DNA des Plasmids phat-gfpuv, bei der die Isolation durchgeführt werden soll, beträgt 3,5kB. Zur Durchführung der Plasmidisoaltion wird das Original-Protokoll des Quiaprep-Kits aus dem Protokoll von Herrn SCHMITT (2005: S. 19) verwendet. Zu aller erst werden 1,5 ml von der ein Tag zuvor angelegten Übernachtkultur in ein steriles Eppendorfcap pipettiert und für 5 min. abzentrifugiert. Der Überstand, der Mediumbestandteile enthält wird weggeworfen. Die restliche Lösung des Eppendorfcaps, die aus Bakterienzellen besteht wird nun mit 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Nach diesem Vorgang sollte sicher gestellt werden, dass keine Zellklumpen im Eppendorfcap sichtbar sind. 250 µl Puffer P2 werden nun hinzugegeben und das Eppendorfcap muss 3-4 mal vorsichtig geschwenkt werden, weil die DNA sonst zerrissen wird. Als nächstes schwenkt man ebenfalls bei der Zugabe von 350 µl Puffer N3 das Eppendorfcap 4-6 mal vorsichtig. Die Lösung erscheint in einer trüben Konsistenz und wird für 10 min. bei 13,000 rpm zentrifugiert. 850 µl vom Überstand, der das notwenige Plasmid enthält wird durch Pippettieren auf eine QIAprep-Säule übergeführt und für s lang zentrifugiert. Die sich unterhalb der QIA-prep Säule und in dem Eppendorfcap befundene Lösung wird weggeworfen. Die QIAprep-Säule muss dann durch Hinzufügen von 0,75 ml Puffer PE und erneutem Zentrifugieren für s gewaschen werden. Derselbe Schritt erfolgt dann mit 0,5 ml Puffer PB. Die restiche Lösung des Eppendorfcaps wird jetzt bei 1 min. zentrifugiert um den Rest des Reinigungspuffers zu entfernen. Zum Schluss muss die QIAprep- Reinigungssäule in ein neues 1,5 ml steriles Eppendorfcap gesteckt werden. Um die DNA 4

6 komplett aus der Reinigungssäule zu erhalten, fügt man 50 µl Wasser hinzu. Das Eppendorfcap lässt man 1 min. lang stehen und zentrifugiert es dann für 1 min. ab. Der Rest, der sich nun im Eppendorfcap befindet, ist die Plasmid-Lösung. Die folgende Abbildung stellt den Ablauf bildlich dar. Abbildung 1: Plasmidisolation in bildlicher Darstellung 5

7 Durchführung der Gelelektrophorese Die Agarose-Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, mit der DNA- Fragmente zwischen 0,5 und 25kB (=kilo-basen) Länge voneinander getrennt und identifiziert werden können. Das Prinzip der Elektrophorese beruht darauf, dass geladene Moleküle, wie z.b. DNA im elektrischen Feld wandern. Die Auftrennung erfolgt in einem elektrischen Gleichstromfeld unter konstanten ph-wert (-> Elektrophoresepuffer), wobei die Fragmente je nach Ladung, Masse und Gestalt unterschiedlich schnell durch das Agarosegel wandern. (SCHMITT, 2005: S. 20) Zur Durchführung der Gelelektrophorese wird das Protokoll Durchführung der Gelelektrophorese vom Biotechnologie Labor verwendet (SCHMITT, 2005: S ). Um 1%-ges Agarosegel herzustellen, werden 0,2 g Agarose mit TAE-Puffer auf 20 ml in einer Schraubdeckelflasche aufgegossen. Da flüssige Agarose stark zum Siedeverzug neigt, gibt man einen Rührfisch in die Schraubdeckelflasche hinzu. Das Agarosegel wird dann unter Beobachtung in der Mikrowelle aufgekocht, bis eine klare Flüssigkeit zu sehen ist. Hinweis: Da das Gel beim Aufkochen sehr heiß wird, sollten bei diesem Vorgang Handschuhe getragen werden. Die heiße Mischung wird nun vorsichtig in eine Gelkammer gegossen und der Gelkamm wird eingesetzt. Sobald das Gel abgekühlt ist, nimmt man den Gelkamm wieder raus und gibt TAE- Puffer hinzu, bis die Gelelektrophoreseapparatur knapp bedeckt ist. Durch das Entfernen des Gelkamms bilden sich in dem Gel Taschen, in die links und rechts außen 5 µl des Markers O Gene Ruler 1kb DNA Ladder #SM0313 pipettiert werden. Gleichzeitig mischt man 5 µl Plasmidlösung mit 2 µl Gelladungspuffer in ein steriles Eppendorfcap und füllt diese ebenfalls in die Geltaschen zwischen die beiden äußeren Marker. Die Spannungsquellen werden dann unter Beachtung der Polung angeschlossen. Die DNA ist negativ geladen und wandert daher vom negativem zum positivem Pol. Das Gel lässt man so lange laufen, bis die blauen Banden fast am anderen Ende des Gels angelangt sind Färbung und Auswertung des Gels Die verbreiteste Methode, DNA in Agarosegelen sichtbar zu machen, ist die Färbung mit Etiduimbromid(EtBr). (MÜHLHARDT: 2003: S. 55) Aufgrund des krebserregenden Potentials von Etidiumbromid werden die Färbung des Gels und das Übertragen auf den UV-Leuchttisch durch die Lehrkraft durchgeführt. Auf dem Gel sind dann unter UV-Anregung die Banden der Plasmide zu sehen. Das folgende Bild zeigt DNA-Banden im Agarosegel nach dem Durchlaufen des Gels. 6

8 Abbildung 2: Beispiel einer Gelelektrophorese (de.wikipedia.org, 2008 ) 3.5. Restriktionsverdau der Plasmide mit EcoRI und HindIII Restriktionsnucleasen, oder abgekürzt "Restriktionsenzyme", sind eine der wichtigsten Hilfsmittel in der Molekularbiologie. Ohne sie wäre ein gezieltes Zerschneiden chromosomaler DNA nicht möglich. Da sie an den Fragmentenden häufig überlappende Enden tragen, die miteinander "verklebt" werden können, ermöglichen sie eine Neukombination von DNA- Fragmenten aus verschiedenen Organismen. So können neue biochemische Eigenschaften hergestellt werden. Zum Beispiel kann einem Bakterium die Fähigkeit zur Produktion eines menschlichen Genproduktes wie Insulin vermittelt werden. ( d) Der Restriktionsverdau wird mit den Enzymen EcoRI und HindIII und den entsprechenden Puffern am Plasmid phat-gfpuv durchgeführt. Da die Gesamtlänge dieses Plasmids 3,5kB beträgt und dieses Plasmid jeweils eine Schnittstelle für EcoRI (bei 141bp) und HindIII (bei (979bp) besitzt, sollten nach dem Restriktionsverdau 2 DNA-Fragmente von 2662bp und 838bp erscheinen. Das folgende Bild zeigt das Plasmid phat-gfpuv mit seinen Schnittstellen der im Plasmid vorhandenen Enzyme. 7

9 Abbildung 3: Vektorbeschreibung des Plasmids phat-gfpuv ( Zur Durchführung des Restriktionsverdaus wird das Protokoll der Internetadresse e verwendet. Aus der Internetseite (2006 a und 2006 b) kann man entsprechende Puffer für bestimmte Restriktionsenzyme finden. In diesem Versuch wird für beide Restriktionsenzmye EcoRI und HindIII der Puffer Tango verwendet. Um ein Gesamtvolumen von 20 µl zu erhalten, setzt man 1 µl Plasmidlösung, 15 µl steriles, demineralisiertes Wasser, 2 µl des 10-fach konzentrierten Puffers Tango, sowie jeweils 1 µl von der Restriktionslösung EcoRI und Hind III ein. Die Mischung wird gut durchgemischt, abzentrifugiert und anschließend für min. bei 37 C inkubiert. Hinweis: Die Restriktionsenzyme sollten immer auf Eis gekühlt werden, damit sie ihre Aktivität nicht verlieren. Die Analyse des Restriktionsverdaus lässt sich mittels einer Gelelektrophorese nachweisen. Die Durchführung erfolgt wie bei Um bei dieser Gelelktrophorese aber ein 0,8 %-ges Gel zu herzustellen, wird 0,16 g Agarose mit TAE-Puffer auf 20 ml aufgegossen Eliminieren des DNA-Fragments aus dem Plasmid phat-gfpuv Das Wort Eliminieren kommt aus dem Lateinischen und bedeutet: entfernen, tilgen ( 1888). 8

10 Mit dem Verfahren der Elimination soll das durch die beiden Restirktionsenzmye EcoRI und HindIII geschnittene DNA-Fragment aus der Gelektrophorese gewonnen werden. Zur Durchführung der Elimination wird das MinElute Gel Extraction Kit Protocol using a microcentrifuge aus dem MinElute Handbook der Firma Quiagen (2003 a: S. 23) verwendet. Vor Beginn ist zu beachten: - Die gelbe Farbe des Puffers QG zeigt den ph-wert 7.5 an - Vor dem Gebrauch wird Ethanol (96-100%-ges) zu Puffer PE hinzugegeben - Alle Zentrifugationsschritte werden bei 10,000 x g auf einer konventionellen Tischplatte bei Raumtemperatur ausgeführt Zu aller erst wird das gewünschte DNA-Fragment aus dem Agarosegel mit einem sauberen und scharfen Skalpell entfernt. Dabei soll die Größe des Gelanteils beim Entfernen aus der Agarose minimiert werden. Anschließend wiegt man den Geltanteil in einem farblosen Eppendorfcap. Man fügt dann 3 Volumen des Puffers QG zu 1 Volumen des Gels (100 mg oder etwa 100 µl). Beispielsweise werden 300 µl des Puffers QG zu jeden 100 mg des Gels hinzugegeben. Für >2% Agarosegel gibt man 6 Volumen des Puffers QG hinzu. Der maximale Betrag des Gelanteils sollte 400 mg betragen. Für Gelanteile > 400 mg wird mehr als ein Eppendorfcap verwendet. Das Eppendorfcap wird anschließend bei 50 C für 10 min. inkubiert. Damit sich das Gel schneller auflöst, wird das Eppendorfcap jede 2-3 min. während der Inkubation geschüttelt. Hinweis: Das Agarosegel muss vollständig gelöst werden. Für > 2%-ges Gel erhöht man die Inkubationszeit. Nachdem der Geltanteil vollständig aufgelöst ist, sollte die Farbe der Lösung im Eppendorfcap eine gelbe Farbe haben. Hinweis: Bei orange oder violetter Farbe wird 10 µl von 3 M Natrium Acetat mit dem ph-wert 5,0 hinzugegeben und resuspendiert. Die Farbe der Lösung sollte dann gelb erscheinen. 1 Gelvolumen von Isopropanol wird zur Probe hinzugegeben und das Eppendorfcap muss einige Male vorsichtig geschwenkt werden. Beispielsweise werden zu 100 mg Agarosegelmasse 100 µl Isoporpanol hinzugegeben. Bei diesem Arbeitsschritt soll nicht zentrifugiert werden. Als nächstes stellt man die MinElute Säule in ein mitgeliefertes 2 ml Eppendorfcap und stellt diesen anschließend in ein Gestell. Um DNA zu binden, pipettiert man die Probe in die MinElute Säule und zentrifugiert diese für 1 min. Um eine maximalen Gewinn zu erhalten, überführt man die ganze Probe in die Säule. Das maximale Volumen der Säule beträgt 800 µl. Bei mehr als 800 µl muss weniger von der Probe entnommen und dann zentrifugiert werden. Der Überstand wird weggeworfen und die MinElute Säule wird wieder auf das Eppendorfcap gesetzt. Nun werden 500 µl Puffer QG hinzugeben. Die Lösung wird für 1 min. zentrifugiert. Der Überstand wird weggeworfen 9

11 und für eine 1 min. bei 10,000 x g zentrifugiert. Hinweis: Das restliche Ethanol von Puffer PE wird nicht vollständig aufgelöst sein, sofern der Überstand nicht vor dem Zentrifugieren entfernt wird. Die MinElute Säule wird in eine neues steriles Eppendorfcap gesteckt. Als nächstes gibt man 10 µl Puffer EB oder Wasser in die Mitte des Eppendorfcaps, lässt das es für 1 min. stehen und zentrifugiert es für 1 min. ab. Die sich befundene Lösung im Eppendorfcap ist das gewünschte DNA-Fragment. Hinweis: Es soll sicher gestellt werden, dass der Puffer direkt in die Mitte des Eppendorfcups fällt um eine Elimination der DNA sicher zu stellen. Das Durchschnittsvolumen der Lösung sollte zwischen 9 und 10 µl betragen. Das Eliminationsverfahren hängt vom ph-wert ab, wobei es bei einem ph-wert zwischen 7.0 und 8.5 am wirksamsten ist. Bei Gebrauch von Wasser sollte sicher gestellt werden, dass sich der ph-wert in diesem wirksamen Bereich befindet. Das Wasser sollte bei 20 C gelagert werden, da die DNA durch das Fehlen von Puffer zerstört werden könnte. Wenn das gereinigte DNA- Fragment dann auf einem Gel nachgewiesen werden soll, fügt man 1 Volumen von geladenem Farbstoff zu 5 Volumen von der gereinigten DNA hinzu. Das Ganze wird dann resuspendiert und auf das Gel aufgetragen. Das folgende Bild zeigt das Verfahren der Elimination. Abbildung 4: Eliminationsverfahren nach Quiagen (2003 b: S. 17) 10

12 3.7. Klonierung des isolierten DNA-Fragments in pjet1.2/blunt Eine Klonierung ist die Einführung eines DNA-Fragments in einem Vektor, der die massenhafte Vermehrung dieser DNA ermöglicht (MÜHLHARDT: 2003 S. 117). Der Klonierungsvektor, der bei diesem Versuch verwendet wird, ist pjet1.2/blunt. Abbildung 5: pjet1.2/blunt Cloning Vector ( e) Dieser Vektor enthält einen offenen Bereich, in den man DNA-Fragmente rein klonieren kann so wie z.b. das mit den Enzymen EcoRI und HindIII geschnittene DNA-Fragment, das in diesem Versuch rein kloniert werden soll. Zur Durchführung der Klonierung wird das Protokoll CloneJet PCR Cloning Kit Sticky-End Cloning Protocol der Internetadresse (2006 c: S. 5) verwendet. Um ein Gesamtvolumen von 18 µl zu erhalten, setzt man 10 µl von 2x Reaktionspuffer, 1 µl des PCR-Produkts, 1 µl des Enzyms, das die DNA stumpf macht sowie 6 µl Nukleasen freies Wasser ein. Die Mischung wird kurz geschüttelt und dann für 3-5 s zentrifugiert. Als nächstes inkubiert man die Mischung bei 70 C für 5 min. und lässt sie anschließend kurz auf Eis abkühlen. Dann wird die Ligation hergestellt, indem man 1 µl des Vektors pjet1.2/blunt und 1 µl von T4 DNA-Ligase zu den 18 µl der davor hergestellten Mischung hinzu gibt. Das Gesamtvolumen der Mischung sollte jetzt 20 µl betragen. Die Mischung wird kurz für 3-5 s geschüttelt und abzentrifugiert. Anschließend inkubiert man die Ligationsmischung für 5 min. bei einer Raumtemperatur von 22 C. 11

13 Hinweis: Die Inkubationszeit kann auf 30 min. verlängert werden, wenn die maximale Anzahl an Transformanten benötigt wird. Die Ligationsmischung wird dann für die Transformation sofort verwendet Transformation chemisch kompetenter Zellen Durch das Verfahren der Transformation wird das Plasmid pjet1.2/blunt mit dem reinklonierten DNA-Fragment in das Bakterium E.coli gebracht. Die Transformation kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden. Eine der häufigsten Methoden ist die Calcium-Chlorid Methode, für die man kompetente Zellen benötigt. Diese Methode lässt sich in den Facharbeiten aus dem Bereich der Mikrobiologie aus dem Jahr 2008 von DZIUK Martha ( a S. 9 ff) und KRIEGER Jana ( b S.10 ff) sehr genau beschrieben finden. Die Transformation kann aber auch auf andere Weise hergestellt werden. Das Protokoll CloneJet PCR Cloning Kit Transformation der Internetadresse (2006 d, S. 6) weist auf zwei weitere Methoden hin. Bei einer der zwei Methoden benötigt man kompetente Zellen, die mit dem TransformationAid Bacterial Transformations Kit der Firma Fermentas hergestellt werden. Dazu werden 2,5 µl der Ligationsmischung in ein neues steriles Eppendorfcap über pippetiert und für 2 min. auf Eis abgekühlt. 50 µl der kompetenten Zellen werden dann hinzu pipettiert und für 5 min. auf Eis inkubiert. Die sich befundene Mischung im Eppendorfcap wird auf Agar- Ampicillin-Platten (s. 3.1.) ausgestrichen und bei 37 C über Nacht bebrütet. Auf den Agar- Ampicillin-Platten sollten am nächsten Tag E.coli Bakterien wachsen, die das Plasmid pjet1.2/blunt mit dem GFP-Kobnstrukt, das mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII geschnitten wurde enthalten. Wenn die Bakterien unter UV-Licht leuchten, war die Transformation erfolgreich. In der zweiten Methode, die in diesem Protokoll beschrieben wird, pippetiert man Chloroform zu der Ligationsmischung hinzu. Von dieser Mischung gibt man 1 µl zu 50 µl der kompetenten Zellen hinzu und transformiert das Ganze. Hierbei sollten wie auch bei der zuvor erwähnten Methode die Bakterien unter UV-Licht leuchten. 4. Ergebnisse Es entstanden während der Facharbeit einige Fehler bzw. sind einige Komplikationen aufgetreten, die im Folgenden untersucht werden sollen. 12

14 Zum einen wurde die Facharbeit aufgrund des Zeitmangels bis zum Abgabetermin der Facharbeit praktisch nur bis zu dem Punkt 3.5. Restriktionsverdau der Plasmide mit EcoRI und HindIII durchgeführt. Es haben sich aber auch bis zum Restriktionsverdau einige Fehler ergeben, die im Folgenden erläutert werden. Zu aller erst ist zu beachten, dass die folgenden Punkte nicht nach der Reihenfolge gegliedert sind, in der man sie durchführen würde, sondern nach der Reihenfolge der Arbeitsschritte, die im Labor durchgeführt wurden. Die korrekte Reihenfolge sollte eigentlich wie folgt aussehen: Plasmidisolation, Analyse der Plasmidisolation durch Gelelektrophorese, Cracking-Methode und Fehleranalyse des Restriktionsverdaus Fehleranalyse des Restriktionsverdaus Nach dem Restriktionsverdau des Plasmids phat-gfpuv mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (s.2.5) analysierte man das Ergebnis auf einem 8.0%-igen Agarosegel. Das folgende Bild zeigt das Ergebnis von diesem Verdau. Abbildung 6: Ergebnis des Restriktionsverdaus vom Das Bild lässt außer die beiden Marker außen links und außen rechts undeutliche Banden erkennen. Die Bande von EcoRI und HindIII lässt erkennen, dass der Restriktionsverdau nicht erfolgreich war da nichts zu erkennen ist. Da die anderen Banden meiner Arbeitskollegin aber auch sehr schlecht zu erkennen sind, ist die Wahrscheinlichkeit, dass es sich hierbei um einen erfolglosen Restriktionsverdau handelt eher unwahrscheinlich. Folgende Aspekte könnten zum Misslingen der Plasmidisolation geführt haben: - Das benutzte Wasser hatte einen ph-wert von >7 und war deshalb sauer - Die Bakterien enthielten zu wenige Palsmide, die isoliert wurden - Die Kits, die man bei der Plasmidisolation verwendete waren nicht sauber 13

15 4.2. Anwendung der Cracking-Methode Zu alles erst wurde die Cracking-Methode angewendet. Dieses Verfahren dient zu schnellen Untersuchung vieler Klone auf Plasmide. Im cracking-verfahren werden Bakterien aus Kolonien oder aus Flüssigkulturen im cracking-puffer aufgeschlossen. Dieser Zellaufschluss wird in der Agarosegelelektrophorese analysiert. Nach Anfärben des Agarosegels mit Ethidiumbromid erkennt der Experimentator, ob Plasmide in den Klonen vorhanden sind oder nicht. ( f) Zur Durchführung wird das Protokoll aus der Internetadresse (2006, g) jedoch in verkürzter Form verwendet. Für die Cracking-Methode benötigt man 50 µl einer Übernachtkultur, die man in einem Eppendorfcap für 2 min. bei rpm abzentrifugieren lässt. Der Überstand, der das Medium enthält wird verworfen. Als nächstes gibt man 75 µl Cracking Puffer in das Eppendorfcap hinzu und inkubiert es 5 min. bei 70 C. Das Eppendorfcap wird dann 5 min. auf Eis abgekühlt und anschließend für 5 min. bei rpm abzentrifugiert. Von dem Überstand, der Plasmide enthält werden 8 µl mit 2 µl Gelladungspuffer in einem neuen Eppendorfcap gemischt. Um das Ergebnis sichtbar zu machen wird eine Gelelektrophorese durchgeführt. Das Ergebnis der Cracking-Methode ist in Abbildung 7 zu sehen. Abbildung 7: Cracking-Methode vom Aus dem Bild kann man erkennen, dass keine der Banden Plasmide enthält, da keine der Banden außer die Marker sichtbar sind.. Auch die Banden vom Plasmid phat-gfpuv (Nicole 1 und Nicole 2) enthalten keine Plasmide. Die Banden hätten dicke Bereiche aufzeigen sollen, wenn Plasmide vorhanden wären. Aus diesen Bild kann erschlossen werden, dass das 14

16 Misslingen des Restriktionsverdaus aufgrund der geringen Menge an Plasmiden in Bakerien nicht gelungen ist. Die Bakterien waren also für meine Experimente nicht geeignet Plasmidisolation Durch die Cracking-Methode, die eine geringe Menge an Plasmiden in den Bakterien festgestellt hat, wurden neue Bakterien verwendet. Zur Sicherheit wurden bei dieser Plasmidisolation auch neue Kits und neues Wasser verwendet. Die Plasmidisolation wurde wie bei beschreiben durchgeführt. Zum Schluss wurden aber zuerst 0,5 ml Puffer PB und dann 0,75 ml Puffer PE hinzugegeben Analyse der Plasmidisolation durch Gelelektrophorese Das Ergebnis der Plasmidisolation wurde mit einer Gelelektrophorese wie bei beschrieben analysiert. Das folgende Bild zeigt das Ergebnis der Gelelektrophorese. Abbildung 8: Gelfoto vom Obwohl beim Durchlaufen der Gels keine blauen Banden auf dem Gel, die eigentlich durch das Gel durchlaufen sollten, zu sehen waren, war die Plasmidisolation, wie das Foto zeigt 15

17 erfolgreich. Die dicken Banden 4 und 5 (Nicole B und Nicole A) zeigen, dass in den neuen Bakterien Plasmide vorhanden waren. Der Grund warum die Banden jedoch nicht sehr dick sind, könnte entweder an der ungenauen Arbeitsweise bei der Plasmidisolation gelegen haben oder weil Schmutzteile mit auf das Gel übertragen wurden. Somit belegt die Analyse der Gelelektrophorese, dass der Fehler bei der Plasmidisolation an den Bakterien lag, da in ihnen keine Plasmide vorhanden waren. 5. Nachwort Trotz der vielen im Labor verbachten Stunden und der harten Arbeit hat es mit sehr viel Spaß gemacht zusammen mit meinen Kollegiatinnen, Herrn Schmitt und Herrn Weber im Labor zu arbeiten. Leider sind nicht sind alle unsere Versuche so geendet, wie wir es gern wollten, doch dafür freute man sich um so mehr über einen Erfolg. Ich hoffe, dass ich zusammen mit meinen Kollegiatinnen Herr Schmitt und Herr Weber nicht allzu viele Nerven gekostet haben und dass sie wegen uns nicht die Freude am Experimentieren im Bereich der Genetik verloren haben. 6. Quellenverzeichnis 6.1. Literaturverzeichnis (1) MÜHLHARDT, Cornel, 2003: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics.4 Auflage, München, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN (2) SCHMITT Patrick, 2005: Einführung in die Grundarbeitstechnicken der Molekularbiologie 6.2. Internetquellen (1) : CLONTECH Laboratories Inc, phat-gfpuv+ Vector Information (2) a: Fermentas International Inc., Canada [Stand: ] 16

18 (3) b: Fermentas International Inc., Canda [Stand: ] (4) c: Fermentas International Inc., Canda, CloneJet PCR Cloning Kit, Sticky-End Cloning Protocol (5) d: Fermentas International Inc., Canda, CloneJet PCR Cloning Kit, Transformation (6) e: Fermentas International Inc, Canada, Map and Features of pjet1.2/blunt Cloning Vector [Stand: ] (7) a: DZIUK Martha, Facharbeit 2008, Herstellung kompetenter Zellen und Nachweis durch Blau-Weiß-Selektion (8) b: KRIEGER Jana, Facharbeit 2008, Herstellung kompetenter Zellen und Überprüfung des Kompetenzerhaltes (9) a: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] (10) b: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] (11) c: STUPPERICH Erhrd Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] (12) d: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] 17

19 (13) e: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] (14) f: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] (15) g: STUPPERICH Erhard: Netzwerk Universität Gymnasien Industrie, Ulm [Stand: ] ml (16) : Meyers Konversations-Lexikon [Stand: ] (17) www1.qiagen.com, 2003 a: Qiagen, MinElute Handbook, MinElute Gel Extraction Kit Protocol, using a microcentrifuge (18) www1.qiagen.com, 2003 b: Quiagen, MinElute Handbook, The MinElute Procedure (19) de.wikipedia.org, 2008: Wikimedia Foundation Inc, San Francisco, Datei: Gel electrophoresis 2.jpg [Stand: ] imestamp= Abbildungen Abbildung 1: Plasmidisolation, selber erstellt 18

20 Abbildung 2: de.wikipedia.org, 2006: Wikimedia Foundation Inc., San Francisco, Datei: Gel electrophoresis 2.jpg [Stand: ] Abbildung 3: : CLONETECH Laboratories, Inc., phat-gfpuv+ Vector Information [Stand: ] Abbildung 4: www1.qiagen.com, 2003: Qiagen, MinElute Handbook Abbildung 5: :pjet1.2/blunt Cloning Vector Abbildung 6: Ergebnis des Restriktionsverdaus im Labor vom Abbildung 7: Cracking-Methode im Labor vom Abbildung 8: Gelfoto im Labor vom Schülererklärung Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe. Memmingen, den (Unterschrift des Kollegiaten) 19