GFP - Klonierung in E.coli

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1 Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollegstufe Jahrgang: /2010 Memmingen Leistungskurs:...Biologie Kollegiatin:...Anja Rießenberger Facharbeit GFP - Klonierung in E.coli Abgegeben am Bewertung: Facharbeit: Note: Punkte: Mündliche Prüfung: Note: Punkte: Gesamtergebnis: Note: Punkte: Datum und Unterschrift des Kursleiters:

2 - 2 - Gliederung 1. Einleitung Allgemeines GFP E.coli Wie kommt die Qualle ins Bakterium? Methoden und Materialien Agar-Ampicillin-Platten Materialien Herstellung Ausstreichen der Agarplatten Anlegen einer Übernachtkultur Plasmidpräparation Materialien Durchführung Gelelektrophorese Materialien Durchführung Restriktionsverdau Restriktionsenzyme Durchführung Analyse durch Gelelektrophorese Ausblick Quellenverzeichnis Schülererklärung... 17

3 Einleitung The wonderful future that fluorescent proteins will bring us cannot be imagined at this point (gfp.conncoll.edu, 2009). Meine Aufgabe für diese Facharbeit bestand darin, Bakterien zum Leuchten zu bringen, was dadurch erreicht wird, dass ein grün fluoreszierendes Protein in ein E.coli Bakterium transformiert wird. 2. Allgemeines Im Folgenden eine kurze Beschreibung der Protagonisten dieser Facharbeit: 2.1 GFP Green Fluorescent Protein taucht ausschließlich in einer bestimmten Quallenart auf der Aequorea victoria. Für die Wichtigkeit der Entdeckung und Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins, GFP wurden 2008 Osamu Shimomura, Marty Chalfie und Roger Tsien mit dem Nobelpreis in der Chemie ausgezeichnet. M. ZIMMER (gfp.conncoll.edu, 2009) misst GFP sogar eine derart hohe Bedeutung in der Molekularbiologie bei, dass er es als Mikroskop des 21. Jahrhunderts bezeichnet hat. Abb. 1: Aquorea victoria (gfp.conncoll.edu, 2009)

4 E.coli Das in der menschlichen Darmflora vorkommende Escherichia coli ist das Haustier der Molekularbiologen. Lange Zeit war E.coli molekularbiologisch und genetisch der am besten untersuchte Organismus. Das Genom ist vollständig sequenziert und die meisten der 4288 Gene sind in ihrer Funktion charakterisiert. [ ] Genetisch veränderte E.coli - Stämme werden eingesetzt, um bestimmte Proteine [ ] zu produzieren. E.coli dient aber auch im Labor als Vermehrungssystem, etwa um bestimmte Gen-Sequenzen oder Vektoren zu klonieren ( 2009). Letzteres spielt im Folgenden eine tragende Rolle. Abb. 2: E.coli (microvet.arizona.edu, 2010) 3. Wie kommt die Qualle ins Bakterium - Methoden und Materialien Um die E.col i- Bakterien später unter ultraviolettem Licht leuchten lassen zu können, sind meherer Arbeitsschritte nötig: 3.1 Agar-Ampicillin-Platten Wie sie hergestellt werden und was dafür benötigt wird nun näher erklärt: Material Glasflasche 1,31 g Lactose-Agar

5 ml steriles Wasser Handschuhe 65 µl Ampicillin 5 sterile Petrischalen Herstellung Der Lactose-Agar wird mit dem sterilen Wasser in der Glasflasche vermengt. Danach wird die Mischung in der Mikrowelle so lange gekocht, bis eine klare Lösung entsteht. Anschließend wird dies autoklaviert. (SCHMITT, 2008: S. 14) Dieses Verfahren wird im Folgenden erläutert: Autoklavieren ist eines der wichtigsten Verfahren zur Keimabtötung. Das Autoklavierverfahren (121 C, 1 bar Wasserdampfüberdruck, 20 min) stellt einen sehr wichtigen Schritt bei mikrobiologischen und molekularbiologischen Experimenten dar. Mit diesem Verfahren töten Sie alle lebensfähigen Keime und sogar deren Dauerstadien sicher ab. Zusätzlich inaktivieren Sie auf diese Weise eine Reihe von Chemikalien wie z.b. Antibiotika ( a). Das Medium wird deswegen erst nach dem Autoklavieren mit dem Ampicillin beimpft. Durch die Ampicillin - Beimpfung wird erreicht, dass unerwünschte Bakterienkulturen sich nicht entwickeln können, sondern nur die gewollten ampicillinresistenten phat-gfpuv Bakterien wachsen. Weil Agar oberhalb von 50 C noch flüssig ist, wartet man so lange, bis es auf 60 C abgekühlt ist, um es dann vorsichtig in die Petrischalen bis zu einer Höhe von 2-3 mm zu gießen. Damit eine Kontamination vermieden wird, sollten die Platten sofort wieder mit dem Deckel verschlossen werden. Nun werden die Platten ein bis zwei Tage auf der Laborbank stehen gelassen, damit überschüssige Feuchtigkeit verdunstet. (SCHMITT, 2008: S. 14) 3.2 Ausstreichen der Agar-Platten Diese Technik wird z.b. angewendet für das Anlegen von Stammkulturen. Solche Stammkulturen auf Agaroberflächen stehen über Tage, Wochen oder einige Monate für Experimente zur Verfügung. Im Verlauf des Ausstriches kommt es zur Vereinzelung von Bakterienzellen. Also können auch mit dieser Technik Klone erhalten werden ( b) Material: Agarplatten Bunsenbrenner

6 - 6 - Platinimpföse 80%iger Alkohol zum Desinfizieren Zu allererst wird die Öse mit dem Bunsenbrenner abgeflammt, um eventuelle sich an der Öse befindliche Keime und Bakterien abzutöten. Mit der erkalteten Öse wird nun ein Teil einer phat-gfpuv-kolonie aufgenommen. Nachdem man mit einer Hand den Deckel einer Agarplatte geöffnet hat, wird dieser mit der Innenfläche nach unten auf die zuvor desinfizierte Arbeitsplatte gelegt. Nun wird die Öse auf die Agaroberfläche gelegt und ohne Druck oder Verkanten der Öse über die Agaroberfläche gezogen. Abb. 3: Ausstrichart auf Agaroberflächen ( c) Anschließend wird die Agarplatte wieder mit ihrem Deckel verschlossen und die Öse nochmals abgeflammt. Um Verwechslungen zu vermeiden und den Überblick zu behalten, sollten die Agarplatten außen mit Datum und Stamm beschriftet werden. Zuletzt werden diese Agarplatten bei 37 C mehrere Tage lang bebrütet. (vgl b) 3.3 Anlegen einer Übernachtkultur Dies ist wohl die einfachste Möglichkeit zur Anzucht von Bakterien. Hierfür beimpft man 3 ml des Kulturmediums in einem Kulturröhrchen mittels einer sterilen Pipettenspitze mit den zu züchtenden Bakterien und mit 65µl Ampicillin. Die Pipettenspitze wird kurz in die Stammkultur von phat-gfpuv eingetaucht und anschließend mit Hilfe des Abwerfers in das Kulturröhrchen eingeworfen. Dabei ist darauf zu achten, dass man mit keinem Teil der Pipette an den Behälter der Stammkultur und das Röhrchen stößt, um eine Kontamination zu vermeiden. (SCHMITT, 2008: S. 14) Anschließend wird das Kulturröhrchen in den Schüttler gestellt und bei 35 C 24 Stunden lang inkubiert. Erfolgreiches Bakterienwachstum kann am nächsten Tag daran erkannt werden, dass sich das Kulturmedium getrübt hat.

7 Plasmidpräparation Ein Plasmid ist DNA in Ringform und dient unter anderem dazu, Gene in andere Bakterien zu übertragen. Plasmid-DNA stellt nur einen Bruchteil der Gesamt-DNA einer Bakterienzelle dar, was es schwer macht, sie zu erreichen. ( d) Feuchte Zelle Trockenmasse 20% Wasser 80% Trockenmasse DNA Ribonukleinsäuren Membranen und Zellwand Protein Abb. 4: Darstellung der Anteile in einer Zelle ( d) Materialien Pipette und passende sterile Spitzen 1,5 ml Übernachtkultur Zentrifuge Sammelgefäß Eppendorf Caps 250 µl Puffer P1 250 µl Puffer P2 350 µl Puffer N3 Quiagen-Säule und 2 ml Eppendorfgefäß 0,5 ml Puffer PB 0,75 ml Puffer PE 50 µl Puffer TE

8 Durchführung Abb. 5: Schematische Übersicht zur Plasmidisolation ( e) Zunächst werden 1,5ml der Übernachtkultur in einem Epi für fünf Minuten bei 5000xg abzentrifugiert. Die Bakterien befinden sich danach am Boden des Epis, sichtbar als weißer Niederschlag. Der restliche Überstand wird nicht benötigt und deswegen in ein Sammelgefäß pipettiert. Die übrigen Zellen im Epi werden nun resuspendiert mit dem RNase A haltigen Puffer P1. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Zellklumpen übrig bleiben dürfen. Bei diesem Schritt werden die Zellmembranen aufgelöst. Jetzt ist das Plasmid aus der Zelle freigesetzt und das größere Chromosom bleibt in den Zellen zurück. Anschließend wird der Puffer P2 hinzugegeben. Diese Lösung wird durch Schwenken über der Längsachse des Gefäßes vorsichtig gemischt. Der Ansatz wird für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe des Puffers N3 wird das Epi fünf bis sechs Mal umgedreht, wobei die Lösung trübe werden kann. Bei maximaler Leistung wird die Lösung nun für zehn Minuten abzentrifugiert. Diesmal wird jedoch mit dem Überstand weitergearbeitet. Er enthält die gesuchten Plasmide, der Niederschlag lediglich die Zelltrümmer und wird deswegen

9 - 9 - verworfen. Dieser Überstand wird nun abpipettiert und auf eine Qiagen - Säule gegeben, die wiederum in das 2 ml Epi gesteckt wird. Hierbei sind dringend Scherkräfte zu vermeiden, da diese das Plasmid DNA - Molekül teilweise brechen können. Die Qiagen - Säule im Epi wird nun bei voller Leistung Sekunden lang zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen, weil die Plasmide auf der Säule hängen bleiben. Daraufhin wird die Säule mit dem Puffer PB gewaschen, wobei der Puffer auf die Säule gegeben wird und dies wiederum für 30 Sekunden bei voller Leistung zentrifugiert wird. Das Plasmid bleibt weiterhin auf der Säule hängen, Puffersalze und Proteine jedoch befinden sich im Durchlauf, der wieder verworfen wird. Anschließend wird der Puffer PE auf die QIAprep - Säule aufgetragen und nochmals bei voller Leistung Sekunden lang zentrifugiert. Der Durchlauf, in dem sich diesmal Puffersalze und Zellinhaltsstoffe befinden, wird abermals verworfen. Das Plasmid befindet sich nach wie vor auf der Säule. Um sicher zu gehen, dass wirklich alle Puffersalze aus der Säule entfernt wurden, wird die Säule nochmals für 60 Sekunden bei voller Leistung zentrifugiert. Schließlich wird die Säule in ein frisches, steriles Epi gesteckt und der Puffer TE darauf gegeben. Dadurch wird die Salzkonzentration auf der Säule erniedrigt und das Plasmid eluiert [=herausgelöst, ausgespült]. Danach wird der Ansatz für eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert und im Folgenden für eine Minute bei voller Leistung zentrifugiert. Diesmal enthält der Durchlauf die Plasmid-DNA. Abschließend werden 2 µl der Plasmidlösung in einer Agarosegelelektrophorese analysiert, um festzustellen, ob und wieviel Plasmid isoliert wurde. (vgl e) 3.5 Gelelektrophorese Die Gelelektrophorese wird im Labor bevorzugt dafür verwendet, um schnell nachzuweisen, ob eine Plasmidisolation oder ein Restriktionsverdau erfolgreich waren Materialien 0,2 g Agarose TAE-Puffer (1 fach) Schraubdeckelflasche Mikrowelle Handschuhe Agarosegelkammer Kunststoffkamm

10 Pipette mit dazugehörigen sterilen Spitzen sterile Eppis 3 µl Plasmidlösung 1 µl Gelladungspuffer Zentrifuge zweimal 5 µl Größenmarker 100 bp Plus Spannungsquelle Durchführung Um ein 1% iges Agarosegel zu erhalten, werden 20 ml des TAE-Puffers mit der Agarose in einer Schraubdeckelflasche vermengt. Anschließend wird dies (ohne Deckel) in der Mikrowelle solange erhitzt, bis keine Klümpchen mehr sichtbar sind. Beim Herausnehmen der nun heißen Schraubdeckelflasche empfiehlt es sich, Handschuhe zu tragen, um die Hand vor Verbrennungen zu schützen. Sobald die Schraubdeckelflasche auf einem schmelzfesten Untergrund zum Abkühlen gestellt worden ist, sofort den Deckel darauf schrauben, um zu vermeiden, dass zu viel der Gellösung verdunstet. Wenn die Flasche so weit abgekühlt ist, dass sie angenehm in die Hand genommen werden kann, wird das Gel vorsichtig in die Agarosegelkammer gegossen, so dass keine Löcher entstehen. Darauf folgend wird der Kunststoffkamm an dem Ende eingesetzt, an welchem der Minuspol der Spannungsquelle angeschlossen werden soll. Nachdem das Gel komplett abgekühlt ist, wird der Kamm vorsichtig herausgezogen und die Gelkammer so weit mit TAE-Puffer angefüllt, bis das ganze Gel und die entstandenen Probentaschen damit bedeckt sind. Nun werden die Plasmidlösung mit 38,5 µg/ml DNA-Konzentration und der Gelladungspuffer Loading Dye in ein steriles Epi pippetiert. Damit ein homogenes Gemisch entsteht, wird dies kurz mit Gegengewicht von 4 µl Wasser in die Zentrifuge gegeben. In die beiden äußersten Probentaschen werden je 5 µl Größenmarker pipettiert. Dies dient dazu, um einen Maßstab [zu haben], anhand dessen man beurteilen kann, welche Größe die nachgewiesenen [DNA-] Fragmente haben. (SCHMITT, 2008: S. 23) Die wieder aus der Zentrifuge herausgenommene Plasmid- / Markerlösung wird jetzt in eine der Geltaschen pipettiert. Anschließend wird die Spannungsquelle angeschlossen. Dabei ist zu beachten, dass der Minus-Pol an dem Ende angeschlossen wird, an der sich die beladenen Probentaschen befinden und die Spannung maximal sieben Volt je Zentimeter

11 Elektrodenabstand beträgt. In den nächsten Minuten kann beobachtet werden, wie die negativ geladene DNA zum Pluspol wandert. Dies wird durch den Gelladungspuffer sichtbar gemacht, welcher die DNA-Proben daran hindert, zu schnell wieder heraus zu diffundieren [ ] [und] meistens aus Glycerin und zwei verschiedenen Farbstoffen besteht. Das Glycerin erhöht die Dichte der Probenlösung im Vergleich zum Elektrophorosepuffer und führt somit dazu, dass die Proben, wenn sie einmal in die Geltaschen pipettiert wurden, auch dort liegen bleiben. Die anionischen Farbstoffe dienen der optischen Kontrolle während der Elektrophorese, da sie parallel zu den Nukleinsäuren durch das Gel wandern. (SCHMITT, 2008: S. 22) 3.6 Restriktionsverdau Eigentlich ist es ganz einfach. Man sucht sich aus der Enzymaktivitätsliste des Herstellers den passenden Puffer aus, pipettiert DNA, Wasser, Puffer und Enzym zusammen, mischt gut und inkubiert das Ganze für eine Stunde bei 37 C. Soweit die Theorie. Meistens funktioniert das auch. Meistens. (MÜLHARDT, 2003: S. 45) Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonucleasen Eine Definiton hierfür wäre (lat. restringere zurückziehen, öffnen): Enzym, das DNA an spezifischen Basensequenzen schneidet. (LINDER, 2006: S. 546) MÜLHARDT bezeichnet sie sogar als wahre Wunder der Biologie, [weil] sie (je nach Spezifität) vier bis acht Basenpaare in einem DNA-Strang erkennen [ ] [und] sie dabei von ungeheurer Präzision sind, denn sie schneiden nur ihre Zielsequenz und [ ] nichts anderes. (MÜLHARDT, 2003: S. 42) In diesem Fall werden das Restriktionsenzym mit voller Aktivität Hind III, der Restriktionsenzympuffer EcoR I mit Staraktivität und der dazugehörige Puffer Tango TM benötigt. Wo diese Restriktionsenzyme im Plasmid phat-gfpuv ansetzen, es dann auch schneiden und welche Basenpaare davon betroffen sind, wird in der folgenden Abbildung dargestellt. Hind III schneidet nach dem 141. Basenpaar und EcoR I nach dem 979. Basenpaar. Abb. 6: Vektorbeschreibung des Plasmids phat-gfpuv ( 2009)

12 Durchführung Mengenangaben: 1 µl Plasmidlösung 15 µl steriles, denaturiertes Wasser 2 µl zehnfach konzentrierter Puffer Tango TM 1 µl EcoR I 1 µl Hind III Bevor man mit den eigentlichen Arbeitsschritten beginnt, sollte man zuerst den Inkubator einschalten, damit sich dieser währenddessen auf 37 C erhitzen kann. Die verschiedenen Komponenten werden nacheinander in ein Eppendorf-Cap pipettiert. Allerdings ist bei den auf Eis gelagerten Restriktionsenzymen Vorsicht zu wahren, damit diese wirklich nur kurz angetaut und nicht vollständig aufgetaut werden! Nachdem das Gemisch abzentrifugiert worden ist, wird es für Minuten in den Inkubator gestellt. Damit man sich hierbei nicht die Finger verbrennt, sollte man darauf achten, nur das Epi zu berühren Analyse durch Gelelektrophorese Abb. 7: kontrastbearbeiteter Abb. 8: GeneRuler TM 100 bp Plus DNA Ladder Gelausschnitt (2009) ( a)

13 Wie in Abbildung 6 ersichtlich, schneidet Hind III nach 144 bp und EcoR I nach dem 979. bp. Was wiederum eine Basenpaarlänge von 835 für das herausgeschnittene Plasmidstück ergibt. In den oberen beiden Abbildungen werden Gel und Markerskala zur Orientierung gegenübergestellt. Nach einer Kontrastbearbeitung des Bildes vom fotografierten Gel unter ultraviolettem Licht werden im linken Bild das Bandenmuster des Markers (links) und das des Plasmids (rechts) deutlich sichtbar. Zu erkennen ist, dass das erste der drei Banden des Plasmids über der ersten Bande des Markers liegt, welcher bei 3000 beginnt. Das geschnittene Plasmid hat eine Gesamtlänge von 3500 bp. Die dritte Bande des Plasmids im Gel ist kaum sichtbar, weil dies das kleinste und damit leichteste DNA-Bruchstück des Plasmids ist. Es ist am weitesten durch das Gel gewandert und stoppte bei ungefähr 840 bp; der Länge, die das herausgeschnittene Plasmidstück haben sollte. Somit war der Restriktionsverdau zwar erfolgreich, jedoch ist die Menge der Plasmidbruchstücke für die Beendigung der GFP Klonierung in E.coli nicht ausreichend (die Bande bei 837 bp kann gerade mal als roter Schatten gesehen werden). 4. Ausblick Dass dieses Kapitel lediglich die Überschrift Ausblick trägt und nicht weiter bis zum Ende des Verfahrens führt, ist wohl meiner falschen Prioritätensetzung im vergangenen Jahr zuzuschreiben. Wäre dies anders gewesen, wäre noch genügend Zeit geblieben, den Restriktionsverdau erneut durchzuführen, um ein ausreichendes Ergebnis zu bekommen, mit welchem man hätte weiter arbeiten können. Bei einer ausreichenden Menge an Plasmidbruchstücken wird mit einer Elimination des DNA-Fragments aus dem Plasmid phat-gfpuv fortgefahren: zunächst wird das DNA- Fragment mit einem scharfen Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten, wobei noch überschüssige Agarose zum Verkleinern des Stücks zusätzlich entfernt werden sollte. Anschließend wird das Fragment in ein Reagenzglas gesteckt, gewogen und mit dem Puffer QG im Verhältnis 3 zu 1 angereichert wird, wobei der Puffer in µl und das DNA-Fragment in mg gemessen wird. Nun wird dies bei 50 C solange inkubiert, bis sich das Gel vollständig aufgelöst hat (ca. zehn Minuten). Danach muss kontrolliert werden, ob die Farbe der Mischung gelb ist. Wenn dies nicht der Fall ist und sich eine Orange- bis Lilafärbung zeigt, ist der ph-wert zu hoch und muss mit 10µl 3 M Natriumacetats, ph 5.0, ausgeglichen werden. Anschließend wird Propanol im Verhältnis 1:1 hinzugefügt und durch vorsichtiges

14 Schwenken untergemischt. Im Folgenden wird eine MinElute-Säule in ein 2ml Epi gesteckt, das Gemisch daraufgegeben und für eine Minute zentrifugiert, um die DNA zusammenzubinden. Nachdem der Überstand verworfen worden ist und die Säule zurück ins Epi gesteckt wurde, werden 500µl des Puffers QG hinzugegeben und das ganze für eine Minute zentrifugiert. Bevor nun zum Waschen der Säule 750µl des Puffers PE hinzugegeben werden, wird der Überstand abermals verworfen und die Säule wieder zurück ins Epi gesteckt. Dieser Überstand wird wieder verworfen und die Säule im Epi nochmals für eine Minute zentrifugiert. Nun wird die MinElute-Säule in ein steriles 1,5 ml Epi gesteckt. Um die DNA jetzt loszulösen, werden zuerst 10µl des Puffers EB direkt auf die Membran gegeben, das Ganze dann eine Minute lang stehen gelassen und anschließend eine Minute lang zentrifugiert. Die DNA hat sich von der Säule gelöst und befindet sich im Epi. (QUIAGEN, 2008) Darauf folgend wird eine Klonierung dieses isolierten DNA-Fragments in pjet1.2/blunt vorgenommen. Hierfür wird das CloneJet TM PCR Cloning Kit verwendet: Abb. 9: Vector Map pjet1.2/blunt ( b) The kit contains a novel, ready-to-use positive selection cloning vector pjet1.2/blunt. The vector contains a lethal restriction enzyme gene that is disrupted by ligation of a DNA insert into the cloning site. As a result, only bacterial cells with recombinant plasmids are able to form colonies. Recircularized pjet1.2/blunt vector molecules lacking an insert express a lethal restriction enzyme which kills the host E.coli cell after transformation. ( a)

15 Für ein Gesamtvolumen von 20µl werden folgende Komponenten benötigt: 10 µl 2 * Reaktionspuffer 2 µl PCR-Produkt 1 µl pjet1.2/blunt Klonierungsvektor 6 µl nukleasefreies Wasser 1 µl T4 DNA Ligase Alle Komponente werden nacheinander in ein Epi pipettiert und nach kurzem Schwenken drei bis fünf Sekunden lang zentrifugiert. Anschließend wird die Lösung bei 22 C für fünf Minuten inkubiert. Nun muss die Lösung unmittelbar für die Transformation von Bakterien verwendet werden ( b). Dies geschieht, wie folgt: Es gibt mehrere Möglichkeiten, kompentente Zellen herzustellen. Zum einen kann für ein schnelles Ergebnis das TransformAid Bacterial Transformation Kit verwendet werden. Hierbei werden bis zu 2,5 µl der Ligasen Reaktions - Mischung gebraucht, um 50 µl kompetente E.coli Zellen zu transformieren, die zuvor mit diesem Kit vorbereitet wurden. Zum anderen braucht man bis zu 5µl der Ligasen - Mischung um 50 µl derjenigen E.coli Zellen, die durch die Calcium-Chlorid-Methode kompetent gemacht wurden, zu transformieren. Zu Beginn werden Agar Ampicillin - Platten für mindestens 20 Minuten bei 37 C vorgewärmt. Nachdem die E.coli - Zellen wie zum Beispiel im Protokoll des TransformAid Bacterial Transformation Kit beschrieben kompetent gemacht wurden, werden 2,5 µl der Ligasen - Mischung in ein steriles Epi pipettiert und für zwei Minuten auf Eis gelegt. Darauf folgend werden 50µl der kompetenten E.coli - Zellen hinzugegeben und für fünf Minuten auf Eis inkubiert. Sofort im Anschluss muss das Gemisch auf die Agar Ampicillin - Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 C inkubiert. ( c) 5. Quellenverzeichnis Literaturverzeichnis (1) LINDER, 2006: Linder Biologie Gesamtband, S. 546, 22., neu bearbeitete Auflage, Braunschweig, Schroedel, ISBN (2) QIAGEN, März 2008: MinElute Handbook, S. 23 f

16 (3) MÜLHARDT Cornel, 2003: Der Experimentator, Molekularbiologie/Genomics, 4.Auflage, München, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN (4) SCHMITT Patrick, 2008: Einführung in die Grundarbeitstechniken der Molekularbiologie Internetquellen (1) : Gentechnik-Pflanzen-Umwelt, Lexikon, E.coli, (2) gfp.conncoll.edu, 2009: ZIMMER Marc, Green Fluorescent Protein, , (3) a: CloneJet TM PCR Cloning Kit, Description, b: ZILINSKIENE Jurgita, CloneJet TM PCR Cloning Kit Protocol, page 6 mplates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_k1232.pdf+clonejet%e2%84%a2+pcr+c loning+kit+sticky-end+cloning+protocol&cd=2&hl=de&ct=clnk&gl=de c: ZILINSKIENE Jurgita, CloneJet TM PCR Cloning Kit Protocol, page 8 mplates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_k1232.pdf+clonejet%e2%84%a2+pcr+c loning+kit+sticky-end+cloning+protocol&cd=2&hl=de&ct=clnk&gl=de (4) a: Dr. STUPPERICH Erich, Autoklavieren, Experimente, Autoklavieren.html b: Dr. STUPPERICH Erich, Ausstreichen, Experimente, Kultivierungstechniken, d: Dr. STUPPERICH Erich, Plasmidisolation, Experimente,

17 Abbildungsverzeichnis Deckblatt: Abbildung 1: gfp.conncoll.edu/, 2009: HADDOCK Steve, Aequorea victoria, Bioluminescence, Abbildung 2: mocrovet.arizona.edu/, 2010: The University Of Arizona 2007, Case 3: E.coli, CaseEcoli/ EcoliEM4.jpg Abbildung 3: c: Dr. STUPPERICH Erich, Ausstrichart auf Agaroberflächen, Experimente, Kultivierungstechniken, Abbildung 4: d: Dr. STUPPERICH Erich, Darstellung der Anteile in einer Zelle, Experimente, Abbildung 5: d: Dr. STUPPERICH Erich, Schematische Übersicht zur Plasmidisolation, Experimente Abbildung 6: : CLONETECH Laboratories, Inc., phat- GFPuv+ Vector Information, Abbildung 7: Ergebnis der Gelelektrophorese, 2009: kontrastbearbeiteter Gelausschnitt Abbildung 8: a: GeneRuler TM 100 bp Plus DNA Ladder, Products, Abbildung 9: b: pjet1.2/blunt, 6. Schülererklärung Erklärung des Kollegiatin: Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benützt habe. Schlegelsberg, den (Unterschrift der Kollegiatin)