Aus dem Institut für Veterinär-Anatomie des Fachbereiches Veterinärmedizin der freien Universität Berlin Laboratorium Prof. Dr. K.-D.

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1 Aus dem Institut für Veterinär-Anatomie des Fachbereiches Veterinärmedizin der freien Universität Berlin Laboratorium Prof. Dr. K.-D. Budras In Zusammenarbeit mit der Veterinär-chirurgischen Klinik der Universität Zürich Direktor Prof. Dr. J. A. Auer DIE WUNDHEILUNG DES RUSTERHOLZSCHEN KLAUENGESCHWÜRES BEIM RIND Licht- und transmissionselektronenmikroskopische Auswertung einer kontrollierten klinischen Studie zur Wundheilung und zum Einfluss von Biotin auf den Heilungsverlauf INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin vorgelegt von Tina Eggers Tierärztin aus Itzehoe Berlin 2001 Journal-Nr. 2504

2 Inhaltsverzeichnis 2 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Dekan: Erster Gutachter: Zweiter Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. F. G. Schmidt Univ.-Prof. Dr. K.-D. Budras Univ.-Prof. Dr. J. A. Auer (Zürich) Tag der Promotion: Gefördert durch Fa. Hoffmann-LaRoche AG, Basel (Schweiz)

3 3 Meinen lieben Eltern,...

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5 5 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS Seite A EINLEITUNG B LITERATURÜBERSICHT Die Klaue Die äußere Haut von Mensch und Tier Definition und Übersicht über den Bau der Klaue, sowie ihre Gliederung nach Schichten und Segmenten Definition der Klaue Gliederung nach Schichten Gliederung nach Segmenten Struktur der Klaue im Bereich des Ballens Klauenbein Unterhaut (Subkutis) Ballenlederhaut (Dermis) Dermoepidermaler Übergang (Basalmembran) Oberhaut (Epidermis) Stratum basale Stratum spinosum Stratum granulosum Verhornungsgrenze Stratum corneum mit jungen und älteren Hornzellen Vorgang der Hornbildung Definitionen "Keratinisierung" und "Verhornung" Keratine und andere spezifische Syntheseprodukte der verhornenden Epidermiszellen Keratine Intermediärfilament-assoziierte Proteine und Keratohyalingranula Membrane coating material in membrane coating granules Marginales Band und cornified cell envelope

6 Inhaltsverzeichnis 6 2 Die Wundheilungsvorgänge an der äußeren Haut Ziele und Definition der Wundheilung Verletzung, Insult Blutstillung, Hämostase Entzündung Proliferation Fibroplasie Blutgefäßneubildung Wundkontraktion Reepithelialisation bzw. epidermale Regeneration Reifung und Umformung Das RUSTERHOLZsche Klauengeschwür Synonyma Wesen und Definition Vorkommen Ursachen, begünstigende Faktoren und Ätiologie Entstehung, Pathogenese und Strukturveränderungen Symptome und Komplikationen Therapie Prognose Prophylaxe Das Biotin Geschichte Chemie Vorkommen, Bioverfügbarkeit und Bedarf Metabolismus Biochemie Funktion als prosthetische Gruppe Coenzym unabhängige Funktionen Biotinmangel

7 7 Inhaltsverzeichnis 4.7 Biotinsupplementierung Rind Schwein Pferd C MATERIAL UND METHODEN Untersuchungsmaterial Tiere Vorbereitungen durch die Schweizer Kollegen Material Untersuchungsmethoden Lichtmikroskopie Herstellung und Färbung von Gefrierschnitten Semidünnschnitte Vorbereitende Tätigkeiten Einbettung in Epon Semidünnschneiden und Färben der Präparate Paraffinschnitte Probenaufbereitung Einbettung in Paraffin Herstellung von Paraffinschnitten Histologische Übersichtsfärbungen Doppelfärbung mit Hämatoxylin-Eosin Trichromfärbung nach MASSON-GOLDNER Histochemische Nachweise Färbung mit der Perjodsäure-Schiff-Reaktion nach MCMANUS Bindegewebsfärbung nach LADEWIG Pikrosiriusrotfärbung, modifiziert nach CONSTANTINE Fibrinfärbung mit Martiusgelb-Scarlett-Blue Keratinfärbung nach PAPANICOLAOU Mitosendarstellung mit der Feulgen-Nuklear-Reaktion Lichtmikroskopische Auswertung und Dokumentation

8 Inhaltsverzeichnis Transmissionselektronenmikroskopie Probenvorbereitung Durchführung der Ultradünnschnitt-Technik Kontrastierung Transmissionselektronenmikroskopische Auswertung und Dokumentation Extraktion und gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine der verhornten Epidermis Prinzip Probenvorbereitung und Proteinextraktion Herstellung homogener Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacryl- Amid-Gele Auftrennung und Darstellung der Proteine Statistische Methoden zur Beurteilung des Heilungserfolges unter Biotineinfluß Übertragung der Qualitätseigenschaften in statistisch nutzbare Zahlenwerte Statistische Aufarbeitung der Werte mit SPSS Version D. UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE Status am Tag Befunde in der Dermis Die Dermis im Wundzentrum am Tag Die Dermis in der Wundperipherie am Tag Befunde in der epidermalen Matrix Die epidermale Matrix im Wundzentrum am Tag Die epidermale Matrix in der Wundperipherie am Tag Befunde in der verhornten Epidermis Die verhornte Epidermis im Wundzentrum am Tag Die verhornte Epidermis in der Wundperipherie am Tag Elektrophoretische Bestimmung der Zellproteine im Horn am Tag

9 9 Inhaltsverzeichnis 2. Exemplarische Befunde vom Tier 28 am Tag Befunde in der Dermis am Tag Befunde in der epidermalen Matrix am Tag Befunde in der verhornten Epidermis am Tag Exemplarische Befunde vom Tier 28 am Tag Befunde in der Dermis am Tag Befunde in der epidermalen Matrix am Tag Befunde in der verhornten Epidermis am Tag Exemplarische Befunde vom Tier 28 am Tag Befunde in der Dermis am Tag Befunde in der epidermalen Matrix am Tag Befunde in der verhornten Epidermis am Tag Befunde am Tag Befunde in der Dermis Die Dermis im Wundzentrum am Tag Die Dermis in der Wundperipherie am Tag Befunde in der epidermalen Matrix Die epidermale Matrix im Wundzentrum am Tag Die epidermale Matrix in der Wundperipherie am Tag Befunde in der verhornten Epidermis Die verhornte Epidermis im Wundzentrum am Tag Die verhornte Epidermis in der Wundperipherie am Tag Elektrophoretische Bestimmung der Zellproteine im Horn am Tag Befunde an Tag Befunde in der Dermis Die Dermis im Wundzentrum am Tag Die Dermis in der Wundperipherie am Tag Befunde in der epidermalen Matrix Die epidermale Matrix im Wundzentrum am Tag

10 Inhaltsverzeichnis Die epidermale Matrix in der Wundperipherie am Tag Befunde in der verhornten Epidermis Die verhornte Epidermis im Wundzentrum am Tag Die verhornte Epidermis in der Wundperipherie am Tag Elektrophoretische Bestimmung der Zellproteine im Horn am Tag Biotinbedingte strukturelle Unterschiede im Ablauf der Wundheilung Statistik: Entwicklung der histologischen Qualität im Verlauf der Wundheilung unter Biotineinfluß E. DISKUSSION Methodik Mikrozirkulation und Integrität des dermalen Bindegewebes Veränderungen am dermoepidermalen Grenzbereich Intrazelluläre strukturelle Veränderungen in der Epidermis Epidermale Matrix Stratum corneum: Zellproteine und marginales Band Veränderungen der epidermalen Interzellularspalten Unterschiede zur Wundheilung in der äußeren Haut Wirkung einer Biotinsupplementation auf den Heilungsverlauf 129 F. ZUSAMMENFASSUNG G. SUMMARY H. ABBILDUNGEN I. SCHRIFTTUM

11 11 Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGEN IM TEXTTEIL µm, µl, µg Mikrometer, -liter, -gramm A Ampère Abb. Abbildung ACC Acetyl-CoA-Carboxylase AE 1/3 Antizytokeratin AGJ annular gap junction, Nexus AK Antikörper AMP Adenosin-Monophosphat Aqua dest. destilliertes Wasser ATP Adenosin-Triphosphat cgmp zyklisches Guanin- Monophosphat CK Zytokeratin cm Zentimeter CoA Coenzym A D Dermis DNA Desoxyribonukleinsäure, engl. Desoxyribonuleic Acid DTT Dithiothreitol E lebende epidermale Matrix Fa. Firma G1 usw. Geschwürprobe Nr. 1 usw. GMP Guanin-Monophosphat gr. griechisch H verhornte Epidermis, Horn IFAP Intermediärfilamentassoziierte Proteine K1 Referenzprobe Nr. 1 Kap. Kapitel kd Kilodalton LM Lichtmikroskop(ie) LMW Low Molecular Weight M Maximalwert m Minimalwert bzw. Milli- MCC Methylcrotonyl-CoA- Carboxylase MCG membrane coating granule MCM membrane coating material, Interzellularkitt MG Molekulargewicht min mrna MSB N nm OsO4 PAG PAS- PC PCC ph pi QF rer RNA Sc SDS SH- Ss ST0 usw. T0 usw. TEM TEMED Tris U/min. V W w/w WL Minute(n) messenger-rna, Boten- RNA Martiusgelb-Scarlett-Blue Anzahl Versuchstiere Nanometer Osmiumtetroxid Polyacryl-Amid-Gel Periodic-Acid-SCHIFF- (reaktion) Pyruvat-Carboxylase Propionyl-CoA- Carboxylase Potentio Hydrogenii isoelektrischer Punkt Qualitätsfaktor rauhes endoplasmatisches Retikulum Ribonukleinsäure, engl. Ribonuleic Acid Stratum corneum Natrium Dodecylsulfat, engl. Sodium Dodecyl Sulfat Sulfhydryl-, Schwefelhydroxid Stratum spinosum Summe der Einzelnoten vom Tag 0 usw. Tag 0 usw. Transmissionselektronen -mikroskop(ie) Tetramethylethylenendiamin Trishydroxyethyl- Aminomethan-HCl Umdrehungen pro Minute Volt Watt wässrig in Wasser weiße Linie

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13 203 DANKSAGUNG Meinem Lehrer und Doktorvater, Herrn Prof. Dr. K.-D. Budras, danke ich für die Überlassung des Themas der Dissertation, seine wissenschaftliche Unterstützung und seinen fachlichen Rat. Dr. Ch. Mülling danke ich für die Betreuung, seine Unterstützung, seinen fachlichen und menschlichen Rat. Der Firma Hoffmann-LaRoche danke ich für die finanzielle Unterstützung. Herrn Dr. Ch. Lischer und seinen Kollegen danke ich für die Probenentnahme. Frau M. Sachtleben und Frau Ch. Schiel danke ich für die Unterrichtung und Hilfe in den transmissionselektronenmikroskopischen Techniken und für Fotoarbeiten. Frau M. Schaerig und Frau I. Küster-Krehan danke ich für die Hilfe und zahlreichen praktischen Tipps bei der Probenbearbeitung für die Lichtmikroskopie. Frau K. Hindorf und Frau G. Schröer danke ich für Fotoarbeiten. Herrn Dr. S. Reese danke ich für die Bearbeitung der ersten TEM-Proben. Herrn Prof. Dr. E. Reinwald und Frau B. Alex danke ich für Einblicke in die gradientengelelektrophoretischen Techniken und praktischen Tipps für die SDS- PAG-Elektrophorese. Frau Dr. G. Arndt danke ich für die hilfreiche Unterstützung bei der statistischen Datenverarbeitung. Mitgliedern und Sympathisanten der Arbeitsgemeinschaft "Zehenendorgan" danke ich für ermutigende Gespräche, anregende Diskussionen, praktische Tipps und immerwährende Hilfe bei Computerproblemen. Dr. C.-H. Lammers danke ich für die Beschaffung wichtiger Literaturquellen aus den USA. K.-H. Patzwaldt danke ich für das Korrekturlesen von Teilen des Manuskriptes. Herrn Dr. P. Ossent danke ich für die Durchsicht des Abbildungsteiles. Janet Lassan danke ich für die Übersetzung der Zusammenfassung. Tom, danke, dass es Dich gibt.

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15 205 LEBENSLAUF Name: Tina Eggers Geburtsdatum: Geburtsort: Itzehoe Eltern: Dr. med. Boie Eggers Renate Eggers, geb. Jepsen : Besuch der Wolfgang-Ratke-Grundschule in Wilster : Besuch der Kaiser-Karl-Schule in Itzehoe : Zeugnis der Allgemeinen Hochschulreife : Ausbildung zur veterinärmedizinisch-technischen Assistentin an der Lehranstalt für VMTA in Oberschleißheim bei München mit Abschluss : Beschäftigung am Institut für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität der Landwirtschaftskammer Schleswig- Holstein in Kiel : Studium der Veterinärmedizin an der FU Berlin mit Abschluss Staatsexamen : Studienjahr an der Ecole Nationale Vétérinaire in Alfort bei Paris, Frankreich, im Rahmen des ERASMUS- Austauschprogrammes : Approbation als Tierärztin seit : WS 1997/1998: WS 1998/1999: WS 1999/2000: WS 2000/2001: Doktorandin am Institut für Veterinär-Anatomie der Freien Universität Berlin Lehrauftrag für die Präparierübungen I, Anatomie des Hundes am Institut für Veterinär-Anatomie Lehrauftrag für die Präparierübungen II, Anatomie der Huftiere am Institut für Veterinär-Anatomie Lehrauftrag für die Präparierübungen II, Anatomie der Huftiere am Institut für Veterinär-Anatomie Lehrauftrag für die Präparierübungen I, Anatomie des Hundes am Institut für Veterinär-Anatomie : NaFöG-Stipendiantin Die vorliegende Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium nach dem Gesetz zur Förderung des künstlerischen und wissenschaftlichen Nachwuchses (NaFöG) des Landes Berlin gefördert.

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17 207 SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegenden Arbeiten, Untersuchungen und die Erstellung der Dissertationsschrift unter Zuhilfenahme der angegebenen Literaturstellen und Hilfsmittel selbständig durchgeführt habe.