Virologie - Einführung

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1 Virologie - Einführung U.G. Liebert Institut für Virologie

2 Definition Viren keine echten Lebewesen replikationsfähige Nukleoproteinkomplexe angewiesen auf eine Wirtszelle kein eigener Stoffwechsel Virus-Gift

3 Prinzipieller Virusaufbau

4 Ordnungsprinzipien Familie (-viridae) Subfamilie (-virinae) Herpesviridae Alphaherpesvirinae Genus (-virus) Simplexvirus Spezies- HSV Typ 1 Stamm- HSV Typ 1 Kos, Angelotti etc.

5 Kriterien der Taxonomie Genomstruktur Replikation Proteine Physikalische Eigenschaften Biologische Eigenschaften

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8 Kleine Viren geringes Molekulargewicht geringe Kodierungskapazität angewiesen auf zelluläre Enzyme für die Replikation

9 Große Viren hochmolekulare Nukleinsäure kodieren für viele Proteine kodieren für Proteine, die an der Replikation beteiligt sind

10 Infektiosität Im Falle der meisten Viren ist gereinigte Nukleinsäure infektiös, wenn sie direkt in die Zelle verabreicht wird und kann einen kompletten Infektionszyklus initiieren Virusgenome, die eine Transkriptase enthalten, sind nichtinfektiös, da keine mrna gebildet wird

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16 Genompolarität von RNA Viren

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18 Beispiele Polioviren Parainfluenzaviren Influenzaviren Reoviren Retroviren Herpesviren HBV.

19 Einstrang+RNA-Viren Polioviren es gibt kein Transkriptionsstadium, die genomische RNA selbst ist mrna Translation in ein langes Polyprotein, das in 4 kleinere Proteine gespalten wird Kapsidprotein, RNA-abhängige RNS- Polymerase, Protease und ein Regulationsprotein

20 Einstrang-RNA-Viren Beispiel Parainfluenzaviren die Virus mrna wird vom elterlichen (Negativ-Strang) RNA-Genom unter Verwendung von RNA-abhängiger RNA Polymerase transkribiert es werden für jedes unterschiedliche Virusprotein verschiedene Virusproteine hergestellt

21 Influenzaviren Sie besitzen ein segmentiertes Genom und jedes dieser kodiert für verschiedene Virusproteine die neue virale RNA wird im Zellkern synthetisiert die viralen Proteine werden im Zytoplasma synthetisiert und wandern zur Plasmamembran und erhalten dort die Hülle

22 Doppelstrang-RNS-Viren Reoviren alle doppelsträngigen RNA-Viren besitzen ein segmentiertes Genom, jedes dieser Segmente kodiert für verschiedene Proteine und jedes ist mit einem Transkriptasemolekül assoziiert (RNA abhängige RNA Polymerase)

23 RETROVIREN z.b: HIV viele Retroviren, jedoch nicht alle, sind Tumorviren und können sich in der Zelle vermehren, ohne sie zu zerstören. Sie können demzufolge normale Zellen in Tumorzellen umwandeln der Vermehrungszyklus beinhaltet die Integration in das Zellgenom

24 Retroviren Das Retrovirusgenom ist ein einzelsträngige dimere RNA mit 3 wesentlichen Genen und einer langen terminal repeat Region (LTR), die den Einbau proviraler DNA in das Wirtszellgenom ermöglicht. 3 Gene: Gag für die Hüllproteine, Pol für die Polymerase (reverse Transkriptase), Env für die Hüllproteine mehrere (akzessorische) Gene für regulatorische Proteine

25 Retroviren 1. Schritt: Transkription durch die im Virion enthaltene reverse Transkriptase um die DNA/RNA Genomheteroduplexe zu erzeugen Umwandlung der DNA/RNA Heteroduplexe in Doppelstrang DNA Integration der Doppelstrang Virus DNA in das zelluläre Chromosom (Provirus)

26 Retroviren 2. Schritt: die provirale (integrierte) DNA wird durch Zellenzyme transkribiert die RNA-Transkripte haben zwei Funktionen: mrna für die Translation in Virusproteine neue Proteine

27 Retroviren Virusproteinsynthese: die Virusproteine werden an Zellribosomen synthetisiert durch Translation der mrna der Zusammenbau erfolgt aus RNA und Proteinen an der Zelloberfläche Prozessierung von viralen Proteinen durch virale Protease der Virusaustritt erfolgt durch Budding an der Zellplasmamembran

28 Doppelstrang-DNS-Viren Beispiele dafür sind Herpesviren, Adenoviren, Papillomviren zwei Typen von mrna werden produziert: frühe mrna, bevor die DNA-Synthese beginnt: hauptsächlich Enzyme für die DNA-Synthese späte mrna, nach der DNS-Synthese: hauptsächlich für die Strukturproteine

29 Virus-DNS-Synthese Es sind mehrere Enzyme einbezogen: das Haupt-DNA-Replikationsenzym ist die DNA-abhängige DNA-Polymerase große Viren (z. B. Herpesviren) kodieren ihre eigenen Enzyme kleine Viren (z. B. Adeno- und Papillomviren) nutzen die DNA-Polymerase der Wirtszelle

30 Replikationsstrategien von DNA-Viren integriert in genomische DNA (Polyomaviren) nutzt zelluläre Transkription (HSV) bringen eigene Transkriptions-und Translationsfaktoren mit (Pockenvirus) Transkription des DNA-Genoms in prägenomische mrna als Matrize für die Synthese neuer DNA-Stränge (Hepatitis B)

31 Hepatitis-B-Viren ungewöhnlicher, komplexer Vermehrungszyklus die infektiösen Partikel besitzen ein inkomplettes doppelsträngiges DNA-Molekül und eine DNA- Polymerase, die das inkomplette durch Produktion eines kompletten Doppelstranges komplettieren kann

32 Hepatitis-B-Viren Die Polymerase weist außerdem Reverse Transkriptase-Aktivität auf es werden RNA/DNA-Intermediäre Strukturen geschaffen, die in doppelsträngige DNA umgewandelt werden können. Die Gene für die Oberflächen und Core-Proteine sind mit den Genen der DNA-Polymerase überlappend

33 Parvoviren Haben ein Einstrang DNA-Genom und einige sind autonom in der Replikation andere sind defekt und benötigen ein Helfervirus für die Replikation bei Parvovirus B19 werden zu fast gleichen Teilen Positiv- und Negativ-Strang DNS in die Viren verpackt, dies ist in verschiedenen Partikeln unterschiedlich

34 Replikation des viralen Genoms von DNA-Viren DNS-Viren: im Zellkern (außer Pockenviren) Polymerase kann zellulär oder viral kodiert sein Adenoviren HBV

35 Virusproteinsynthese bei DNS-Viren Ist ein zweistufiger Prozess 1. Produktion von frühen Proteinen (z.b. DNSabhängige DNS-Polymerase und Thymidinkinase) 2. Produktion von späten Proteinen werden nach der DNS-Synthese produziert sind meist die Kapsidproteine für die neuen Partikel

36 Replikation des viralen Genoms von RNA-Viren RNA-Viren: im Zytoplasma und ausschließlich mit viraler Replikase Rotaviren HIV

37 Replikation nackter und umhüllter Viren 1. Attachment 2. Penetration 3. Uncoating 4. Replication 5. Transkription 6. Translation 7. Assembly 8. Release 9. Maturation

38 Viruseffekt auf Zellen Zelltod: die Infektion ist letal, der zythopathische Effekt führt zum Zelltod Transformation: die Zellen werden nicht getötet, ändern jedoch ihre Eigenschaften in Richtung Tumorzelle Latente Infektion: das Virus liegt in der Zelle in einem potentiell aktiven Zustand vor, es werden keine sichtbaren Effekte auf die Wirtszelle deutlich Hämadsorption: einige Viren besitzen Hüllproteine, die an Erythrozyten adhärieren Transformation: Immortalisierung, Tumorentstehung

39 Wirkung von physikalischen und chemischen Noxen Hitzeinaktivierung: 56 / 30 min oder einige Sekunden bei 100 C werden die Mehrzahl der Viren. Kälte- und Hitze wirken sich nachteilig auf Viren aus UV-Strahlen Lösungmittel, Alkohol, Seife

40 Rezeptoren Viren binden an verschiedene Typen von Rezeptormolekülen niedrig-affine Primärrezeptoren Co- oder Sekundärrezeptoren existieren als Mittler zwischen Zelle (negativ geladen) und Virus

41 HIV: Rezeptorvermitteltes Attachment

42 Eintritt des Virus in die Targetzelle Die Plasmamembran, die eine Zelle umgibt, ist eine (sehr) mobile und aktive Struktur Zellen nehmen ständig Material aus der umgebenden Schicht auf (Endozytose) die Membran stülpt sich aus

43 Uncoating Die Interaktion mit dem Rezeptor bereitet die Viren für das Uncoating und den Eintritt des viralen Genoms in das Zytoplasma vor HIV und andere behüllte Viren vollziehen den Prozess durch Fusion mit dem Lipidlayer der Plasmamembran andere Viren durch rezeptorbedingte Endozytose

44 Uncoating Eintritt des Virusgenoms in die Zelle durch Fusion von viraler und Wirtszellmembran bei neutralem ph-wert

45 Sekundäres Uncoating nackte Nukleinsäure oder komplexes Nukleoprotein dringt in die Zelle ein in Assoziation mit zellulären Strukturen wie Polymerasen oder Ribosomen als Vorbereitung auf die nächste Phase der Virusvermehrung- sekundäres Uncoating

46 Ineffektivität des Infektionsprozesses Bei Poliovirusinfektionen ist die Mehrzahl der RNA des infizierenden Virus degradiert als Resultat der Interaktion mit den Zellen zwischen den infizierenden und infizierenden Partikeln gibt es Unterschiede, die sich elektronenmikroskopisch nicht erfassen lassen.

47 Verhinderung von frühen Schritten der Infektion Immunisierung mit neutralisierenden Antikörpern beim Auftreten von klinischen Symptomen ist die Infektion schon in vollem Gange

48 Assembly cap NSP - ORF SP- AAAAAAA ORF Precursor-Proteine NS1 NS2 C E2 E1 Intrazelluläre Formierung von (Poly-) Proteinen, post- oder kotranslationelle Prozessierung in ER und Golgi Einbau der Proteine in innere und äußere Membran

49 Budding Ausschleusung reifer Viren (häufig = Zelltod)

50 Virologische Diagnostik

51 Virologische Diagnostik dient der Beantwortung ganz verschiedener Fragen: Besteht Immunität? Liegt eine aktive Infektion vor? Besteht Infektiosität? Besteht eine Therapieindikation? Zeigt sich virologisch ein Therapieerfolg? Liegt eine Resistenzmutation gegenüber antiviralen Substanzen vor?

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55 Wichtig ist, die optimalen diagnostischen Methoden einzusetzen. In manchen Fällen muss versucht werden den Infektionszeitraum einzugrenzen (z.b. Röteln und CMV in der Schwangerschaft)

56 Untersuchungsmaterial Formen- Blut Serum Plasma EDTA enthält keine Gerinnungsfaktoren beinhaltet zelluläre Bestandteile und metabolitische Produkte fast zellfreien Überstand nach Zentrifugation des Vollbluts durch Zugabe von Heparin nach Blutentnahme wird die Gerinnung verhindert Salz der Ethylendiamintetraessigsäure bindet Kalziumionen und unterbricht Gerinnungskaskade Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten sind bis zu 24 h stabil

57 Untersuchungsmaterial Abstriche Gewebe (Biopsie): Haut/ Schleimhaut Herzmuskel, Magen/Darm- Wand, etc.

58 Manifestationen Hals, Nase, Ohren Manifestationsort Viren Erkrankungen Oropharyngeale Karzinome (Tonsillen) HPV- Typen 7, 11, 16, 33 Pharyngitis Adeno-, Parainfluenza, Rhino-, Entero-, Influenza-, Hanta-, Masern-, Röteln-, Marburg-, Ebola-, Lassavirus

59 Pharyngitis

60 Manifestationen Parotitis (Speicheldrüse) Manifestationsort Viren Erkrankungen Parotitis Mumpsvirus, CMV, Enteroviren

61 Weitere Manifestationen Gastraintestinaltrakt Geschlechtsorgane Haut- und Schleimhaut Herz und Gefäße Nervensystem Niere, Harnwege, Nebenniere Respirationstrakt

62 Diagnostische Verfahren - Übersicht - Virusnachweis oder Antikörpernachweis HPV, EM Antigentest

63 Diagnostische Verfahren Elektronenmikroskopie Nachweis von Einschlusskörpern Virusisolierung/ Viruscharakterisierung Phänotypische Resistenzbestimmung Virusantigennachweis in Zellkultur Virusantigennachweis im Patientenmaterial Gewebe/ Zellen Sekrete/ Exkrete Nachweis viraler m-rna

64 Diagnostische Verfahren Neutralisationstest (Cytomegalievirus) Komplimentbindungsreaktion (Influenza A/B) Hämagglutinations-Hemmtest (Röteln) Antikörperbindungstest Immunfluoreszenztest (Influenza) Radioimmunoassay ELISA

65 Virusnachweis mittels CPE Humane Lungenfibroblasten Affen-Nierenzellen CMV (AD 169) mock infiziert Rötelnvirus mock infiziert

66 Diagnostische Verfahren Virusgenomnachweis/ Genomanalyse In situ nach Extraktion durch PCR Resistenzbestimmung

67 Diagnostische Verfahren Westernblot (HIV 1 & 2) Nachweis spezifischer Antikörper der verschiedenen Ig- Klassen Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Antigene eines Virus Nachweis spezifischer Antikörper unterschiedlicher Advidität Nachweis virusspezifischer T- Zellen

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