Neuer Antibiotika-Nachweis: SCHNELL UND SICHER. Nachweis von Antibiotika-Rückständen in Rohmilch mit dem neuartigen Biosensor MCR3

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1 I I Neuer -Nachweis: I I I I 11QUALITÄTSMANAGEMENT SCHNELL UND SICHER Nachweis von -Rückständen in Rohmilch mit dem neuartigen Biosensor MCR3 Bereichsleiterin..Hemmstoffe und Referenzmaterialien, Unsere Autorin: Christine Habel Milchprüfring Bayern Grundsätzlich sind in der Milchviehhaltung unverzichtbar. Trotzdem wird versucht, den Einsatz von zu minimieren. Wenn eingesetzt werden, so kann es trotz allervorsichtsmaßnahmen zu Rückständen in der Milch kommen. Sie bergen Positivkontrolle Negativkontrolle Ceftiofur Nafcillin Enrofloxacin Tylosin Erythromycin Gentamicin Neomycin B Cephapirin Penicillin G Streptomycin SDA SMA Fotoaufnahme eines -Chips A ein gewisses Allergiepotenzial, es kann zu Resistenzbildungen kommen und es können auch toxische Effekte auftreten. Besonders für Molkereien spielen Produktionsstörungen durch - Rückstände eine große Rolle. Welch wirtschaftlicher Schaden entstehen kann, sei an einem Beispiel gezeigt: Die gesetzliche Rückstandshöchstmenge für (Trockenstellerpräparat) beträgt!agil. Das bedeutet, dass mg L Milch unbrauchbar machen. Ein Euterinjektor entspricht 600 mg. Würden nun alle vier Euterviertel behandelt werden, so hätte man insgesamt 200 mg ins Euter eingebracht. Frisch nach der Behandlung gemolken, könnten so bis zu L Milch verunreinigt werden. Rückstandskontrollen sind grundsätzlich gesetzlich vorgeschrieben, doch sie werden durch jeden Lebensmittelhersteller aus seiner Verantwortung gegenüber dem Verbraucher heraus durchgeführt.als npraktizierter Verbraucherschutz steht dies dem Tierschutz gegenüber. Um sich dieser Problematik konkret anzunehmen und die Verbraucher vor rückständen in Lebensmitteln zu schützen, wurden von Gesetzgeberseite maximale Rückstandswerte festgelegt (MRL - maximum residue limit). Doch hier liegt im Moment eine Diskrepanz zwischen diesem gesetzlichen.son- und dem nist, denn es gibt für die Praxis keine schnelle und vor allem auch bezahlbare Methode zur Überwachung der MRL's vor Ort. Die Voraussetzung für die Überwachung der MRL's ist die Identifikation des Wirkstoffes bzw. des Rückstandes (Qualifizierung) und die Bestimmung dessen Kon-zentration, um mit dem MRL vergleichen zu können (Quantifizierung). Hier hat sich aus didaktischen Gründen die Abkürzung nquaqua eingebürgert, welche diese beiden Elemente nqualifizierung und nquantifizierung einprägsam beschreibt. Rückstandssituation gut. aber verbesserungsfähig Die aktuelle Entwicklung zeigt, dass die hemmstoffpositiven Fälle rückläufig sind. So wurden 2011 in Bayern nnur 0,13 % der Lieferanten positiv getestet. Dies hat mehrere Gründe: I vermehrte Eigenkontrolle (Hoftests, kostenlose Tests durch Molkereien) I vermehrte Aufklärung und Sensibilisierung durch Molkereien, Tierärzte, MPR u.a. I Neue LM-Hygiene-Recht seit 2006 (konkrete Maßnahmen in Bayern seit März 2008). jeder Hemmstofffall wird an die zuständige Behörde gemeldet, was einen Besuch des Amtstierarztes zur Folge hat. nmehrfachtäter (innerhalb von 36 Monaten mehr als ein Hemm '..... o ~g/l 10 ~g/l 1OOO~g/L Ermittlung der Konzentrationen durch Aufnahme einer Kalibrierkurve 2 1/13. FOOO-Lab

2 0> ---,.. 50>,..,0> ~ _- _--_.._----_._ _.-..-._. ---_._- Bsp.: Kalibrierkurve O.1po für 'C\<, TNP: 1~g/ L MRL: ~g/ L WR: ~g/ L '(XI.,,ro;., Qualifizierung und Quantifizierung. Werden alle Wirkstoffgruppen untersucht, so ist sie vom Spektrum mit dem mikrobiologischen Test vergleichbar. Aufgrund ihrer hohen Kosten und der Dauer der Untersuchung ist sie im Routineablauf nicht oder lediglich bedingt einsetzbar. Idealerweise brauchte man also ein System, das eine Mischung aus allen drei Testsystemen ist: breites Nachweisspektrum, Identifizierung des Antibiotikums mit Konzentrationsangabe, kostengünstig und schnell. Hier setzt der BioSensor zum Nachweis von in Milch - MCR 3 (Munich Chip Reader- 3. Generation) an. Detektionsprinzip (indirekt kompetitiver ELISA]: stofffall) werden zusätzlich durch einen MPR-Mitarbeiter besucht Betriebsbegehungen Betriebsbegehungen I tägliche Probenahme. jede Milchablieferung wird beprobt. So ist immer eine Rückstellprobe vorhanden. Die Verursacher für hemmstoffpositive Tanksamrnelzüge können ermittelt und zum Schadenersatz heran gezogen werden. Vergleich derzeit verfügbarer Nach\Neissysteme: Die derzeit verfügbaren Nachweissysteme kann man in 3 Gruppen unterteilen: I die mikrobiologischen Tests I die Rezeptor-Schnelltests I die physikalisch-chemische Referenzmethode Bei dem mikrobiologischen Hemmstoff test handelt es sich in Deutschland laut Gesetzesvorgabe um den Brillantschwarz Reduktionstest (BRT): I es ist ein unspeziftscher Test für alle Hemmstoffe I er besitzt ein breites Nachweisspektrum aller für die Milchviehhaltung relevanter I Untersuchungszeit ca. 2-2,5 h Bei den Wirkmechanismen der Rezeptor-Schnelltests handelt es sich um immunologische Rezeptor-Antigen- Bindungen bzw. um eine enzymatische Reaktion. Schnelltests können in der Regel nur einzelne bestimmte Arzneimittelgruppen nachweisen, nämlich die, die der eingesetzte Rezeptor binden kann. Ob also eine Substanz qua- lifiziert werden kann, ist vom Rezeptor abhängig. Ein negatives Schnelltestergebnis weist also noch keine Hemmstofffreiheit nach. Der Vorteil hier liegt aber auch klar auf der Hand: Die kurze Dauer bis zu einem Ergebnis. Die dritte Gruppe von Methoden stellt die Referenzanalytik dar: Hierbei werden meist mittels Flüssigchromatographie, gekoppelt mit einem Massenspektrometer, die einzelnen Wirkstoffgruppen nachgewiesen. Für die Methode muss eine je nach nachzuweisender Gruppe unterschiedliche, z.t. aufwendige Probenvorbereitung durchgeführt werden. Dadurch und auch durch die teuren Messgeräte entstehen relativ hohe Messkosten. Diese ist die einzige Methode, die den Wirkstoff tatsächlich qualifizieren und quantifizieren kann (- QUA-QUA). Zusammenfassung der einzelnen Nach\Neissysteme: Der gesetzlich vorgeschriebene mikrobiologische Test BRT besitzt zwar ein breites Nachweisspektrum und ist relativ kostengünstig, kann aber nur qualifizieren, also eine ja/nein- Aussage treffen und dauert sehr lange. Die Schnelltests haben hier ihre Stärke: Sie sind kostengünstig und liefern deutlich schnellere Ergebnisse. Der Nachteil besteht darin, dass diese aber nur bestimmte Wirkstoffgruppen nachweisen und auch nicht quantifizieren können. Die Referenzmethode bietet als Einzige die Möglichkeit einer In einer Spritze befindet sich ein Antikörpercocktail aus 1 verschiedenen spezifischen Antikörpern, von den -Derivaten, die derzeit mit dem Biosensor nachgewiesen werden können. Dieser Antikörpercocktail wird bei Start der Messung mit der zu untersuchenden Milchprobe in eine Inkubationsschleife geleitet. Falls in der Milch vor-handen sind, binden diese an die spezifischen Antikörper. Dieses Milch-Antikörper-Gemisch wird nun über einen Messchip geleitet, auf den die nachzuweisenden MCR 3: 560 f,lg/l BRT:) 00 f,lg/l MRL: f,lg/l hemmstoffpositiven Probe im Vergleich zu einer negativen Milchprobe 1/13. FOOO-Lab 3

3 ~...- _...,... ~ ~:: T \~-, T ~ It\ loo I, ~ r+-~~~ '~-' Ul1 S< sn - - ~_~ASI AS2 loo, IE..- los,ot ' USI2'Z Jloo.OO : ,05 z, '0<2' 7_~7 ns 11 '-59 '- K ~ :.:~,,....).0'5.S< t.n.., l '00. ~B 2ti.6S 0, <2.. Goo<~ t11 1.]' 50.2 E~omyonA 1.6S ~-i:oo.oo ase JOS t52 t.e.. ~ ~ :J6 ~ toj ~ '.98 1.Z ,. ass ~.,. 11,53 t , 0.. lt3< 0N'EIlA - '.. '... '... Re'Irom~ F '- Ir-...,. :;....._ '** ::;-~eonc:.n.... l.imdlor~~ ~eppox. lfllincllrlcerm!' ::J Oov... 1iS% )gncn.--- J2 1 IIIZS ,., 11 '51 ~...,..,lo 10..., ~:~~~: - ~. m '''' lz.l, 10 r:'11 ~ n 131 r: FIOI'IC a.~ Be/wId tun.!'iic8obre2lon..j. ~G 1~152, 10 ~ ~'9 P.nuitJlromcelibrllklrlpernbtolc ' OS, S1d...,, Sld.Oov I!lIen,Y f'rgilgtlofed ~B 111 ' I.2J s <1137 < ~ 35\ '00 91 ese El)'fIromytJllA.067 '59 ~, ~~ au.., '56 ues ~., 5<0' ,28 '00. li H ,59 10 E~ Sill 7.1 5,.52 ' ~., S< 8l ~-:.. Ul. a --,. ~:- ~ 11 2$.02 -~.ce. 0., 10,. 0 ' ONPEOA... dm. lz ~(~j2lolo90202_)7_27001d_j.ße/wid.. '-1 FMname(cw:I jm;j.tllnql9jlfij010(1u18ll68s1360b!onk...- I Auswertung am MCR3 fest immobilisiert sind. Die noch freien Antikörper des Antikörpercocktails können sich an die entsprechenden Antigene auf dem Chip binden. Die so auf dem Chip gebundenen Primärantikörper werden dann mittels eines enzymmarkierten Sekundärantikörpers markiert. Zur Markierung des Sekundärantikörpers wird das Enzym Meerrettich-Peroxidase verwendet. Es katalysiert die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Luminol, wobei Licht emittiert wird, welches mit einer sensitiven CCD-Kamera detektiert wird. Die Lichtintensität ist direkt proportional zu der oberflächen konzentration der gekoppelten Analyten. Es gilt also der umgekehrte Nachweis: Je mehr in einer Milchprobe ist, desto weniger freie Antikörper sind vorhanden und binden am Chip. Desto weniger Licht wird erzeugt. Im Anschluss an die Fotoaufnahme werden die entstandenen Antikörperbindungen mit einem sauren Medium abgewaschen, so dass gleich wieder eine neue Messung gestartet werden kann...l::j.1!j ta laktame, Makrolide, Sulfonamide, Aminoglykoside) 5 fach aufgetragen, mit Positiv- und Negativ-Kontrolle. Die absolute Lichtintensität ist charakteristisch für jedes Antibiotikum. Ermittlung der Konzentrationen durch Aufnahme einer Kalibrierkurve: Es werden 7 verschiedene Konzentration, von ~g/l, eines Milchstandards der alle 1 verschiedenen Seit Oktober 2008: 16 Proben 70% enthält gemessen. Bei einer negativen Milch erhält man das maximale Signal für jedes Antibiotikum. Bei einer Konzentration von 10 ~g/l sind die Signale schon deutlich abgeschwächt. Bei einer Konzentration von 1000 ~g/l leuchtet nur noch die Positivkontrolle. Aus den einzelnen Messungen wird eine Kalibrierkurve erstellt. Bsp.: Kalibrierkurve für : Der lineare Bereich, zwischen 10 % und 80 %, legt den Arbeitsbereich fest. Bei anderen ist der Test weit sensitiver als der MRL. Dort können Grenzwertüberschreitungen durch Verdünnung der Probe festgestellt werden. hemmstoffpositiven Probe im Vergleich zu einer negativen Milchprobe: Links ist die Fotoaufnahme einer hemmstofffreien Milchprobe (maximales Signal für alle ) gezeigt. Rechts sieht man die Aufnahme einer hemmstoffpositiven Milch probe. Das Signal von ist deutlich abgeschwächt bzw. verschwindet im Hintergrundrauschen. Der MCR 3 misst eine Konzentration von 560 ~g/l (deutliche Grenzwertüberschreitung mit) ~g/l). Durch Verdünnung der Milch probe Fotoaufnahme eines -Chips: Die CCD-Kameraaufnahme zeigt die Lichtsignale der 1 aus verschiedenen Wirkstoffgruppen (Be- -Verteilung Kein Antibiotikum -Streptomycin - -Neomycin B Sonstige 1/13. FOOO-Lab

4 Detektierte MRL [ljgi L] MCR 3 [ljg/l] BRT [ljgi L] 215 ~ 200, Cloxacill in,, 201 ~ 0, ~ ~ 0 Cephapirin ~ ~ 200, Neomycin B, Streptomycin, Streptomycin, Nafcillin, ,8.650 ~ 800, ,291 ~ 0, *, 200, 2,37,105 Streptomycin Ceftiofur * Bestätigt Auswertung am MCR3: In der Auswertesoftware werden in einer Maske alle Daten dargestellt. Oben sind die Daten und die Kalibrierkurven aller 1 zu finden. Unten links sind die Intensitäten des jeweils ausgewählten Antibiotikums der Kalibrierkurve aufgelistet. Unten rechts findet man die Ergebnisse einer hemmstoffpositiven Milchprobe. In diesem Fall liegt eine zweifache Grenzwertüberschreitung vor: mit 0 f,lg!l und Neomyein B mit 1800 f,lg!l. -Verteilung: Seit Oktober 2008 wurden beim Milchprüfring Bayern e.y. über.000 hemmstoff-positive Proben mit dem MCR 3 nachuntersucht. Über 90 % der Proben enthalten in irgend einer Form das Betalaktam. Besonders auffallend ist aber auch die Häufigkeit der Wirkstoffkombinationen, die von Gesetzgeberseite derzeit nicht berücksichtigt werden. Detektierte beim Milchprüfring Bayern e.v. im Vergleich zum BRT: Es werden nicht nur einzelne aus verschiedenen Wirkstoffgruppen (z.b., Cephapirin, Streptomycin) auf MRL-Niveau nachgewiesen, sondern auch Wirkstoffkombinationen, bis hin zur 3fach-Kombination.. mit Rezeptor-Schnelltest Detektierte beim Milchprüfring Bayern e.v.im Vergleich zum konnte mit dem BRT eine Konzentration von) 00 f,lg!lermittelt werden, was eine gute Vergleichbarkeit darstellt. ~0, *, ~ 120 BRT Die gefundenen Konzentrationen wurden jeweils mit dem BRT verglichen und zeigen eine sehr gute Übereinstimmung. Vergleich mit der Referenzanalytik: Die Referenzanalytik wurde an der muva kempten mittels HPLC-MS durchgeführt. In der Tabelle sind Beispiele aus der Wirkstoffgruppe der Betalaktame aufgelistet. Auch hier ist eine gute Vergleichbarkeit zwischen MCR 3, BRT und HPLC-MS zu verzeichnen., wie das Neomycin B, für die zu der Zeit keine Referenzanalytik möglich war, konnten mit einem ELISA-Test bestätigt werden. Welche Bedeutung haben diese Ergebnisse in der Praxis? Aufgrund verschiedener Testsysteme können Rückschlüsse auf die einge- Detektierte setzten Medikamente gezogen werden. Dies bietet einen sehr großen Vorteil bei der Ursachenfindung und Aufklärung von hemmstoffpositiven Fällen, wie nachfolgendes Fallbeispiel zeigt: Der BRT weist in der Verdünnung ein positives Ergebnis von 1: auf. Dieser Wirkstoff ist mit Penicillinase inaktivierbar, folglich muss es sich um ein Betalaktam handeln. Dies wurde auch durch einen Schnelltest bestätigt. Mit einem weiteren Schnelltest, für Streptomycin wurde auch ein positives Ergebnis festgestellt. Der MCR3 kann nun mit einer Messung beide Wirkstoffe bestätigen und auch die Konzentration feststellen. Was sowohl eine Kosten-, als auch Zeitersparnis bringt. Diese Möglichkeit der Wirkstoffbestimmung stellt eine große Hilfe dar, die mittlerweile nicht nur von den Außendienstmitarbeitern des MPR, sondern auch von Veterinären und Landwirten genutzt wird. Fazit: Der MCR3 bietet eine einmalige Chance für die MilchWirtschaft, schon früh in der produktionskette Rückstände von sicher nachzuweisen. Durch Qualifizierung und Quantifizierung entsteht ein mehr an Sicherheit für alle an der Produktionskette Milch Beteiligte. So kann zum ersten Mal weltweit die für die praktische Anwendung bestehende diagnostische Lücke bei der Untersuchung auf rückstände in der Lebensmittelkette Milch geschlossen. MRL [ljgll) BRT [ljgi L] MCR 3 [ijgi L] HPLC-MS[lJglL)?: 3,8 3,9?: 6,3?:0 22, z ?: 16 15, 56 15, z z 37 3?: ?: z , Neomycin B Vergleich mit der Referenzanalytik Bestätigt 1/13 durch ELiSA FOOO-Lab 5

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