Heterologe Expression und Aufreinigung von SEPALLATA3 aus Escherichia coli

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1 1 Heterologe Expression und Aufreinigung von SEPALLATA3 aus Escherichia coli Organisatorisches: Termine: ; , Beginn: 8.15 Uhr im Seminarraum 124, Philosophenweg 12 Am Beginn jedes Praktikumtages des 1. Teils wird es ein kleines Antestat geben, in welchem Sie 50 % der Punkte zum Bestehen benötigen. Das Bestehen der Antestate, ein ordentliches und vollständig geführtes Laborbuch sowie die aktive Teilnahme am Praktikum ist Voraussetzung für das erfolgreiche Abschließen des 1. Praktikumteils. Um sich auf den Praktikumstag vorzubereiten, lesen Sie bitte das Script durch und berechnen Sie alle Lösungen oder Zugaben von Komponenten, welche sie für den Praktikumstag benötigen (siehe Script u.a. Seite 15/16) Inhalt des Praktikums: SEPALLATA3 (SEP3) gehört zur SEP Unterfamilie der MADS-Box Proteine, deren Mitglieder redundante Funktionen in der Spezifikation der Blütenmeristemidentität haben und an der Blütenorganentwicklung beteiligt sind. SEP3 ist ein Transkriptionsfaktor, der an spezifische DNA- Elemente (CArG-Boxen) bindet. Es wurde die DNA-Bindedomäne des Protein SEP3 aus Arabidopsis thaliana in E. coli heterolog überexprimiert. Im Praktikum soll die heterolog exprimierte DNA-Bindedomäne von SEP3 affinitätschromatographisch aufgereinigt werden. Anschließend wird das DNA-Bindeverhalten der aufgereinigten Proteine mittels EMSA untersucht. Neben dem Wildtyp-SEP3 Protein werden auch Proteinmutanten untersucht, die verschiedene Aminosäuresubstitutionen in der DNA-bindenden Domäne aufweisen. Jede Gruppe bearbeitet das Wildtyp- und zusätzlich ein mutantes Protein. Ablaufplan: 1. Tag: Aufreinigung der überexprimierten Proteine; Sonden-Annealing 2. Tag: SDS-Gel zum Überprüfen des Aufreinigungsverlaufs, Überprüfen des Sondenannealings 3. Tag: Untersuchung der DNA-Bindung mittels EMSA 1

2 2 Heterologe Expression von Proteinen in E. coli Um Proteine in größeren Mengen herzustellen und aufzureinigen, wird oft auf die heterologe Expression in E. coli zurückgegriffen. Dafür wird die für das Protein kodierende cdna in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und dieser dann in speziell für die Proteinexpression geeignete E. coli-stämme transformiert. Die Expression heterologer Proteine in E. coli ist durch Wahl des Expressionsstammes und vektors meist induzierbar, das heißt erst nach einem geeigneten externen Stimulus wird die Expression gestartet. In unserem Fall wird als E. coli-stamm Tuner DE3 verwendet, der zur Korrektur des codon usage bias das Plasmid pril trägt. Als Expressionplasmid kommt pet15b zum Einsatz (Vektorkarte und Vektorinformation siehe Anhang). Die Proteine werden bei Verwendung dieses Plasmids als Fusion mit einem His 6-tag exprimiert, der der affinitätschromatographischen Aufreinigung dient. Die Proteinexpression wird in der exponentiellen Wachstumsphase bei einer OD 600 = 0,8 in E. coli durch Zugabe von IPTG induziert. Nach 3 Stunden wird die gesamte E. coli-kultur geerntet. Das E. coli Pellet wird ihnen zur Aufreinigung der heterolog exprimierten Proteine zur Verfügung gestellt. Neben dem Wildtyp-SEP3 Protein werden auch Proteinmutanten exprimiert, die verschiedene Aminosäuresubstitutionen in der DNA-bindenden Domäne aufweisen. Fragen welche Sie in Vorbereitung des 1. Praktikumstages beantworten können sollten: 1. Welcher Vektor wird im Praktikum zur heterologen Expression von SEP3 benutzt. Welche Eigenschaften hat dieser Vektor und wozu dienen diese? 2. Was ist das SEP3-Protein? 3. Nennen Sie die möglichen Gefahren einer 1 M Imidazol-Lösung. Was muss man beim Umgang mit dieser Chemikalie beachten? 4. Erläutern Sie das Prinzip der affinitätschromatographischen Aufreinigung von Proteinen. 5. Was bewirkt die Zugabe von Lysozym zum resuspendierten Bakterienpellet? 6. Berechnen Sie alle Lösungen/Puffer, welche Sie am 1. Praktikumstag benutzen werden (siehe Skript Seite 15/16) 7. Was ist bei Lagerung von Proteinen bei -20 C zu beachten? 8. Sie haben zwei einzelsträngige zueinander komplementäre Oligonukleotide. Wie können Sie daraus einen Doppelstrang machen? 2

3 3 Praktische Durchführung: Tag 1: Proteinaufreinigung aus E. coli; Sonden-Annealing Die in E. coli überexprimierten Proteine sind mit einem His 6-tag versehen. Das heißt, sie tragen N- terminal sechs aufeinanderfolgende Histidinreste. Die Fähigkeit von Histidinresten, an Nickelionen zu binden, wird zur affinitätschromatographischen Aufreinigung genutzt. Dabei wird der E. coli- Rohextrakt, welcher die getaggten Proteine enthält, zu einer Matrix gegeben, an der Nickelionen immobilisiert sind. Die getaggten Proteine binden an die immobilisierten Nickelionen und können so relativ leicht von den in Lösung verbleibenden restlichen Proteinen getrennt werden. Das Entfernen unspezifisch gebundener Proteine und die Elution der aufgereinigten Proteine von der Matrix erfolgt mit steigenden Konzentrationen an Imidazol. Imidazol bindet ähnlich wie Histidin an Nickelionen, es verdrängt daher in mittleren Konzentrationen schwach an die Matrix bindende Proteine (z.b. E. colieigene Proteine, die relativ viele Histidine nacheinander tragen). In hohen Konzentrationen verdrängt Imidazol auch die getaggten, mit relativ hoher Affinität gebundenen Proteine. Für die Bindestudien wird eine doppelsträngige CArG-Box-Sonde benötigt. Ihnen werden einzelsträngige Oligos zur Verfügung gestellt, welche verschiedene CArG-Box-Bindemotive enthalten. In der Annealing-Reaktion wird aus zwei komplementären einzelsträngigen Oligos eine doppelsträngige DNA-Sonde hergestellt. Die doppelsträngige DNA-Sonde ist fluoreszenzmarkiert, da der fwd-oligo mit einen Fluorezenzfarbstoff markiert ist. Praktische Durchführung: 1. Reinigung der His-getaggten Proteine 1.1. Lösen Sie das E. coli-pellet in 500 µl Lysis-Puffer durch vortexen und auf- und abpipettieren Überführen Sie die resuspendierte E. coli Kultur in ein 2 ml Eppi Geben Sie Lysozym (stock: 20 mg/ml) bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml zu und mischen sie den Ansatz Inkubieren Sie den Ansatz mindestens 30 min auf Eis 1.5. Vortexen Sie das Gemisch vorsichtig, vermeiden Sie dabei Schaumbildung. 3

4 Zentrifugieren Sie die Lösung für 15 min bei 4 C und rpm, um die unlöslichen von den löslichen Proteinbestandteilen zu trennen Nehmen Sie den Überstand (= löslicher Proteinrohextrakt) ab und überführen Sie diesen in ein neues 2 ml Eppi; verwerfen Sie das Pellet Nehmen Sie von der Fraktion löslicher Proteine 10 µl ab und lagern Sie dies bei -20 C in einem gut beschrifteten 1,5 ml Eppi. (gut beschriftet bedeutet: Datum, Probennamen, Reinigungsschritt, Gruppennummer) 1.9. Geben Sie zum restlichen Überstand (aus Schritt 1.7) 50 µl Ni-NTA-Agarose. Achtung: vor dem Pipettieren Ni-NTA-Agarose gut schütteln! Inkubieren Sie das Gemisch für 1 Stunde unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Während dieser Zeit binden die getaggten Proteine an die Nickelionen der Ni-NTA-Agarose Zentrifugieren Sie für 15 s bei 1000 g, um die Agarosematrix zu pelletieren. Nach der Zentrifugation sollte ein milchigweißer Niederschlag zu sehen sein Nehmen Sie 10 µl des Überstands ab und lagern Sie diesen bei -20 C in einem gut beschrifteten 1,5 ml Eppi. Vorsicht: Keine Agarosematrix mit transferieren. Der Überstand enthält alle Proteine, die nicht an die Nickelionen gebunden haben Geben Sie 1 ml Waschpuffer zu der Agarosematrix Resuspendieren Sie die Agarosematrix durch invertieren des Eppis, inkubieren Sie die Lösung 5 Minuten Zentrifugieren Sie für 15 s bei 1000 g, nehmen Sie den Überstand ab und lagern Sie 10 µl desselben bei -20 C in einem gut beschrifteten 1,5 ml Eppi, verwerfen Sie den Rest Geben Sie 100 µl Elutionspuffer zu der Agarosematrix Resuspendieren Sie die Agarosematrix durch invertieren des Eppis, inkubieren Sie die Lösung 5 Minuten Zentrifugieren Sie für 15 s bei 1000 g, nehmen Sie den Überstand ab: Diese Fraktion sollte das aufgereinigte Protein enthalten; Lagern Sie 10 µl davon bei -20 C in einem gut 4

5 5 beschrifteten 1,5 ml Eppi, die restlichen 95 µl versetzen sie mit 86 % Glycerol, sodass die Proteine in einer 50 % Glycerollösung vorliegen und eine Lagerung bei -20 C möglich ist. 2. Probe-Annealing (Herstellung der DNA-Sonde) 2.1. Pipettieren Sie folgende Reaktion auf Eis: Komponenten 1x STE-Puffer 10 µl 50 µm Oligo_fwd 5 µl 50 µm Oligo_rev 5 µl Endvolumen 15 µl 2.2. Starten Sie die Annealing Reaktion im Thermocycler: 95 C, 10 min, alle 3,5 min wird Temperatur um 2,5 C gesenkt bis 15 C erreicht sind. 5

6 6 Tag 2: Analyse des Verlaufs der Proteinaufreinigung mittels SDS-PAGE, Überprüfen der Sonden- Annealing-Reaktion Fragen welche Sie in Vorbereitung des 2. Praktikumstages beantworten können sollten: 1. Nennen Sie 3 potenzielle Gefahren von Acrylamid-Bisacrylamidlösungen. 2. Was muss man beachten, wenn man mit Acrylamid-Bisacrylamidlösungen arbeitet? 3. Was bewirken APS und TEMED, wenn man es zur Acrylamid-Bisacrylamidlösungen dazugibt? 4. Wie viel Acrylamid-Bisacrylamidlösung braucht man für ein 18 % bzw. 15 % Trenngel (Endvolumen: 12,5 ml, siehe Gelzusammensetzung Seite 6/7 im Skript) 5. Erläutern Sie das Verfahren der diskontinuierlichen SDS-PAGE. 6. Welche Komponenten enthält der SDS-Probenladepuffer? Welche Funktion haben diese einzelnen Komponenten? 7. Welche Proben werden Sie auf das Gel auftragen? Erläutern Sie, welches Ergebnis Sie für jede einzelne Proben nach dem Gellauf erwarten. 8. Nennen Sie eine Möglichkeit die Proteine im Gel sichtbar zu machen. 9. Sie wollen folgende Lösungen und Puffer herstellen: 10x SDS-PAGE Laufpuffer (1l), 5x SDS- Probenpuffer (50 ml), Coomassiefärbelösung (1 l). Bitte benutzen Sie die Angaben von Seite Seite 15/16 aus dem Skript. 10. Welche Größe hat das Protein, was ich aufreinigen möchte? 11. Wie kann ich das erfolgreiche Annealen von zwei Oligos überprüfen. Welche Kontrollen brauche ich zur Überprüfung? Was sind meine Erwartungen? Praktische Durchführung: 3. SDS-Gele gießen Beim Herstellen des Acrylamidgels und beim Umgang mit dem Acrylamidgels Handschuhe tragen! Gelzusammensetzung: Trenngel (2 Gele) 18 % 15 % ddh2o ml ml 1,5 M Tris-HCl (ph 8,8) 3,15 ml 3,15 ml 30 % Acrylamid/bis (37,5:1) ml ml 10 % (w/v) SDS 0,125 ml 0,125 ml 10 % (w/v) APS 0,125 ml 0,125 ml TEMED 0,01 ml 0,01 ml Endvolumen 12,5 ml 12,5 ml 6

7 7 Sammelgel (2 Gele) 5 % ddh2o ml 0,5 M Tris-HCl (ph 6,8) 1,25 ml 30 % Acrylamid/bis (37,5:1) ml 10 % (w/v) SDS 0,05 ml 10 % (w/v) APS 0,05 ml TEMED 0,01 ml Endvolumen 5,61 ml 3.1. Glasscheiben ordentlich mit 70 % Ethanol putzen Gießsystem zusammenbauen und mit Wasser testen ob die Kammer dicht ist Gewünschte Höhe des Trenngels (bis ca. 1 cm unter Kamm) mit Edding markieren In dieser Reihenfolge das Trenngel in einem 50 ml Falcon zusammenpipettieren: ddh 2O, Tris-HCL, Acrylamid, SDS, APS. Durch vorsichtiges Schwenken des geschlossenen Falcons mischen TEMED hinzufügen, durch vorsichtiges Schwenken des geschlossenen Falcons mischen. Achtung: durch die Zugabe von TEMED wird die Polymerisation gestartet Mit einer Pipette Trenngellösung bis zur Edding-Markierung in die Gelkammern einfüllen Mit 1 ml 70 % Ethanol vorsichtig überschichten ca. 15 bis 30 Minuten auspolymerisieren lassen Nach dem Auspolymerisieren Ethanol entfernen und die Geloberkante 2 x mit Bidest spülen. Geloberkante mit einem Edding markieren In dieser Reihenfolge das Sammelgel in einem 50 ml Falcon zusammenpipettieren: ddh 2O, Tris-HCL, Acrylamid, SDS, APS. Durch vorsichtiges Schwenken des geschlossenen Falcons mischen TEMED hinzufügen, durch vorsichtiges Schwenken des geschlossenen Falcons mischen. 7

8 Mit einer Pipette Sammelgellösung in die Gelkammern einfüllen Kamm einsetzen und weitere 15 min polymerisieren lassen. 4. SDS-PAGE und Coomasie-Färbung Auf das SDS-Gel sollen die Proben lösliches Proteinrohextrakt (Schritt 1.7), nicht gebundene Proteine (Schritt 1.12), Waschfraktion (Schritt: 1.15) und Eluat (Schritt 1.18), welche Sie am 1. Praktikumstag während der Proteinaufreinigung als 10 µl Aliquots eingefroren haben, aufgetragen werden Geben Sie 0,1 M DTT (Stammlösung: 1 M DTT) zum 5x SDS-PAGE Probenpuffer dazu. Setzen Sie nicht mehr Ladepuffer als benötigt an. Bauen Sie die Gelapparatur zusammen und füllen diese mit 1x SDS-Laufpuffer Versetzen Sie die während der Aufreinigung abgenommenen und eingefrorenen 10 µl Aliquots von der Proteinaufreinigung mit 5x SDS-PAGE Probenpuffer mit DTT Inkubieren Sie die Ansätze 5 min bei 95 C. Stellen Sie anschließend die Proben sofort auf Eis Tragen Sie den kompletten Ansatz auf das Gel auf. Beladen Sie ein Slot mit 10 µl PageRuler Unstained Protein Ladder (Thermo Scientific) 4.5. Lassen Sie das Gel bei 30 V in 1x SDS-Laufpuffer laufen bis die Bromophenolblau-Bande den Anfang des Trenngeles erreicht hat. Der Gellauf für das Trenngel erfolgt bei 120 V bis die Bromophenolblau-Bande das Ende des Gels erreicht hat Bauen Sie die Gelapparatur vorsichtig auseinander Färben Sie das Gel, in dem Sie das Gel mit Coomassie-Färbelösung bedecken, 1 min in der Mikrowelle aufkochen und 20 min schütteln Wiederholen Sie Schritt 4.7 mit frischer Coomassie-Färbelösung Entfärben Sie das Gel in ddh 2O 8

9 9 Hinweise zur Auswertung: Wurde das Protein mit der erwarteten Größe aufgereinigt? Wenn nein, was ist die mögliche Ursache? Sind noch weitere Banden im Gel sichtbar außer die Bande für die erwartete Proteingröße? Wenn ja, was ist die mögliche Ursache Wie sehen die einzelnen Reinigungschritte aus? Findet man eventuell hier eine Erklärung für unerwartete Ergebnisse? Welche Ursachen in der Durchführung könnten das unerwartete Ergebnis erklären? Sonstige Beobachtungen + mögliche Erklärungen für diese. Schlussfolgerung 5. Überprüfen der Sonden-Annealing-Reaktion Beim Herstellen des Acrylamidgels und beim Umgang mit dem Acrylamidgels Handschuhe tragen! 5.1. Natives 8 % Acrylamidgel gießen Gelzusammensetzung: 1 natives Acrylamidgel 8 % ddh2o 13,78 ml 10 x NF-TBE 2 ml 40 % NF-Acrylamid/bis (19:1) 4 ml 10 % (w/v) APS 0,2 ml TEMED 0,008 ml Endvolumen 19,99 ml Säubern Sie alle Teile der Gelapparatur mit Wasser um SDS-Reste zu entfernen. Reinigen Sie anschließend die Glasplatten mit 70 % EtOH Gießsystem zusammenbauen und mit Wasser testen ob die Kammer dicht ist In dieser Reihenfolge das native Acrylamidgel in einem 50 ml Falcon zusammenpipettieren: ddh 2O, NF-TBE, NF- Acrylamid, APS. Durch vorsichtiges Schwenken des geschlossenen Falcons mischen TEMED hinzufügen, durch vorsichtiges Schwenken des geschlossenen Falcons mischen. Achtung: durch die Zugabe von TEMED wird die Polymerisation gestartet. 9

10 Mit einer Pipette Acrylamidgellösung bis zum Rand in die Gelkammern einfüllen Kamm einsetzen und weitere 45 min polymerisieren lassen Gelelektrophorese der annealten DNA-Sonde Bauen Sie die Gelapparatur zusammen und füllen diese mit 1x NF-TBE-Laufpuffer Stellen Sie den Ladepuffer für die annealten Sonden her Fertigen Sie eine 1:10 Verdünnung von Ihrer annealten Sonde mit 0,5x STE-Puffer an Pipettieren Sie zu 2 µl annealter, verdünnter Sonde 11,8 µl des Ladepuffers Als Kontrolle versetzen Sie 2 µl des fluoreszenzmarkierten Oligos (1:10 verdünnt mit 0,5x STE-Puffer) mit 11,8 µl Ladepuffer Laden Sie ihre Proben auf das Gel, zusätzlich beladen Sie ein Slot mit 10 µl Bromophenolblau um den Gellauf zu kontrollieren Der Gellauf erfolgt bei 120 V bis die Bromophenolblau-Bande das letzte Drittel des Gels erreicht hat Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgt mittels Phosphoimager. Hinweise zur Auswertung: Wie sieht das Bandenmuster für die annealte Sonde und für die Oligos aus? Stimmt es mit meinen Erwartungen überein? Wenn nein, welche Ursachen könnte es geben? Sonstige Beobachtungen + mögliche Erklärungen für diese Schlussfolgerung 10

11 11 Tag 3: Untersuchung der DNA-Bindeaktivität der überexprimierten Proteine SEP3 ist ein Transkriptionsfaktor, der an spezifische DNA-Elemente, sogenannte CArG-Boxen (CArG steht für CC ATreich GG), bindet. Die Konsensussequenz für die Bindung ist CC(A/T) 6GG. Es soll mittels electrophoretic mobility shift assays (EMSA) untersucht werden, ob die überexprimierten Proteine diese DNA-Bindeaktivität aufweisen. Bei diesen Analysen wird das zu untersuchende Protein zusammen mit einer DNA-Sonde, auf der eine CArG-Box kodiert ist, inkubiert. Zum Vergleich werden die Proteine auch mit einer DNA-Sonde inkubiert, die einen mismatch zum CArG-Box-Konsensus aufweist. Nach der Inkubation wird das Gemisch dann auf einem nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt und die DNA detektiert. Freie, nicht proteingebundene DNA wird relativ schnell durch das Gel migrieren und deshalb in der Regel als Bande in der unteren Gelhälfte zu detektieren sein. Bindet das Protein an die DNA-Sonde, so verzögert sich aufgrund der größeren Masse des Protein-DNA-Komplexes die Migrationsgeschwindigkeit im Vergleich zur freien DNA, es kommt also zu einem mobility shift der DNA. Der Protein-DNA-Komplex ist daher in der Regel als zusätzliche Bande, die langsamer durch das Gel migriert als die freie DNA, detektierbar. Um auch geringe Menge an Protein-DNA-Komplex detektieren zu können, sind die im Praktikum eingesetzten Sonden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Um die Spezifität der DNA-Protein Bindung zu untersuchen, werden wir eine Reaktion mit competitor DNA-Sonde ansetzten, d.h. diese Sonde ist nicht markiert und wird in einer höheren Konzentration in der DNA-Bindereaktion eingesetzt. Fragen welche Sie in Vorbereitung des 2. Praktikumstages beantworten können sollten: 1. Nennen und erläutern Sie die im Praktikum verwendete Methode zur Untersuchung von DNA-Protein-Interaktionen. 2. An welche DNA-Motive bindet SEP3? 3. Wie weist man mit der Methode aus Frage 1 nach, dass SEP 3 spezifisch an die DNA gebunden hat? 4. Von welchen Faktoren ist die Detektion von Protein-DNA Komplexen abhängig? 5. Berechnen Sie die einzusetzenden Volumina der Komponenten für die Bindereaktion (siehe Tabelle Seite 15/16 im Skript) Beachten Sie, dass das Protein und die Sonde sich bereits in Lösung befinden und berücksichtigen Sie die entsprechenden Salz- und Ionenkonzentration. 6. Worin unterscheiden sich native Acrylamid-Gelsysteme vom diskontinuierlichen SDS-PAGE Gelsystem? 11

12 12 Praktische Durchführung: Es wird die DNA-Bindung der am 1. Praktikumstag aufgereinigten Proteine untersucht. Es werden jeweils 0,5 µl und 0,8 µl des Wildtyp-SEP3 und des mutierten SEP3 Proteins mit zwei verschiedenen CarG-Boxen getestet. Zusätzlich setzten Sie für jedes Protein eine Reaktion mit 0,8 µl Protein und der competitor-dna an. Als Positiv-Kontrolle wird Ihnen ein aufgreinigtes Wildtyp-SEP3 Protein zur Verfügung gestellt, für welches Sie ebenfalls die Bindereaktion mit den 2 CArG-Boxen ansetzen. 6. Natives Acrylamidgel gießen und Elektrophorese 6.2. Säubern Sie alle Teile der Gelapparatur mit Wasser um SDS-Reste zu entfernen. Reinigen Sie auch die Glasplatten mit 70 % EtOH Pipettieren Sie folgende Komponenten zusammen. Achtung! TEMED erst wieder am Ende zugeben, damit die Polymerisierungsreaktion gestartet wird. 1 natives Acrylamidgel 5 % ddh2o xx ml 10 x NF-TBE 0,5 ml 40 % NF-Acrylamid/bis (19:1) xx ml 10 % (w/v) APS 0,1 ml TEMED 0,01 ml Endvolumen 9,61 ml 6.4. Das Gel sollte vor dem Lauf mindestens 45 min polymersieren. 7. Ansetzen der Bindereaktion 7.1. Pipettieren Sie folgende Komponenten auf Eis zusammen: Achtung: Berücksichtigen Sie, dass das bei -20 C gelagerte Protein im Elutionspuffer bereits NaCl, Tris-HCl ph8, DTT, Glycerol, Imidazol enthält. Auch die CarG-Boxen enthalten bereits NaCl, Tris-HCl ph8, EDTA ph8. Dies müssen Sie in der Berechnung zur einzusetztenden Menge der jeweiligen Komponenten berücksichtigen! Um das Ansetzten der Bindereaktion zu erleichtern, können Sie einen Master-Mix ansetzten, der alle Komponenten bis auf die DNA und das Protein enthält. 12

13 13 Komponente Stock 0,5 µl Protein ddh2o 150 mm NaCL 5 M 25 mm Tris-HCl ph8 1 M 2,5 mm DTT 0,1 M 1,5 mm EDTA ph8 166 mm Imidazol 0,05 M 1 M 0,3 mg/ml BSA 10 mg/ml 5% Glycerol 86 % competitor DNA CArG-Box1 competitor DNA CArG-Box1 CArG-Box1* CArG-Box2* 0,03% Orange G 1 % 0,8 µl Protein Kompetitions assay Negative Kontrolle Positiv- Kontrolle WT-SEP protein 0,5 µl 0,8 µl 0,8 µl Endvolumen 15 µl 15 µl 15 µl 15 µl 15 µl *CArG-Box: 1:10 verdünnt mit 0,5x STE-Puffer (siehe 5.2.3) 7.2. Inkubieren Sie die Bindereaktion min auf Eis 8. Natives Acrylamidgel mit Bindereaktion beladen und Elektrophorese 8.1. Bauen Sie die Gelapparatur zusammen und befüllen Sie die Kammer mit 1x NF-TB 8.2. Lassen Sie das leere Gel für 30 min bei 50 V vorlaufen Laden Sie ihre Proben der Bindereaktion auf das Gel, zusätzlich beladen Sie ein Slot mit 20 µl Bromophenolblau um den Gellauf zu kontrollieren Der Gellauf erfolgt bei 120 V bis die Bromophenolblau-Bande das Ende des Gels erreicht hat Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgt mittels Phosphoimager. 13

14 14 Hinweise zur Auswertung (Bitte die EMSA-Ergebnisse erst für seine Proben und dann für alle Proben des Praktikums betrachten): Was für Banden sind auf dem Gel zu sehen? Wenn eine DNA-Protein Interaktion sichtbar ist, ist diese auch spezifisch? Gibt es Unterschiede im Bindeverhalten zwischen den einzelnen Sonden? Gibt es Unterschiede im Bindeverhalten zwischen den verschiedenen Proteinmutanten? Sonstige Beobachtungen und mögliche Erklärungen für diese. Schlussfolgerung 14

15 15 9. Puffer und Lösungen Folgende Stammlösungen stehen Ihnen zu Verfügung: 1 M Tris HCl ph8, 5 M NaCl, 1 M Imidazol, 1 M DTT, 20 mg/ml Lysozym, 86 % Glycerol, 10 % SDS benötigte Lösungen 10x SDS-PAGE Laufpuffer 5x SDS-PAGE Probenpuffer Coomassie-Färbelösung Lysis-Puffer Waschpuffer Aqua bidest. 250 mm Tris (M: 121,14 g/mol) 2 M Glycine (M: 75 g/mol) 1 % SDS (Stock: 10% SDS) Aqua bidest. 250 mm Tris 10 % SDS 0,5 % Bromophenolblau 50 % Glycerol bei 50 C lösen Aqua bidest. G250 Brilliant Blue 37 % HCl Aqua bidest. 50 mm Tris-HCl ph8 300 mm NaCl 20 mm Imidazol 5 mm DTT (frisch dazugeben) Aqua bidest. 50 mm Tris-HCl ph8 300 mm NaCl 100 mm Imidazol 5 mm DTT (frisch dazugeben) für 1 l: für 50 ml: für 1 l: 70 mg 3 ml für 1,5 ml für 3 ml 15

16 16 Elutionspuffer 1x STE-Puffer Ladepuffer für annealte Sonde Aqua bidest. 50 mm Tris-HCl ph8 300 mm NaCl 500 mm Imidazol 5 mm DTT (frisch dazugeben) Aqua bidest. 10 mm Tris-HCl ph8 150 mm NaCl 1 mm EDTA ph8 Aqua bidest. 0,03 % Orange G 5 % Glycerol 0,5x STE-Puffer für 1 ml für 1 ml für 1 ml 10. Marker, Vektor PageRuler Unstained Protein Ladder (Thermo Scientific) Images represent 8-16 % Tris-glycine gels (SDS-PAGE). Gel was stained with coomassie blue dye 16

17 17 17

18 Gefahrstoffe 30 % Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (37,5 : 1) bzw. 40 % NF-Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (19 : 1) (KMR-Stoff!) Gefahrenhinweise H301 Giftig bei Verschlucken. H312+H332 Gesundheitsschädlich bei Hautkontakt oder Einatmen. H315 Verursacht Hautreizungen. H319 Verursacht schwere Augenreizung. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. H340 Kann genetische Defekte verursachen. H350 Kann Krebs erzeugen. H361f Kann vermutlich die Fruchtbarkeit beeinträchtigen. H372 Schädigt die Organe bei längerer oder wiederholter Exposition. Sicherheitshinweise P280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P302+P352 BEI KONTAKT MIT DER HAUT: Mit viel Wasser und Seife waschen. P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. P308+P313 BEI Exposition oder falls betroffen: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. Sonstige Hinweise Nur im Raum 307 bzw. unter dem Abzug Acrylamidgele gießen Reste in den Acrylamid-Abfall Umgang mit Acrylamid ist für Schwangere verboten TEMED Gefahrenhinweise H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken. H332 Gesundheitsschädlich bei Einatmen. H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Sicherheitshinweise P210 Von Hitze/Funken/offener Flamme/heißen Oberflächen fernhalten. Nicht rauchen. P280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. P303+P361+P353 BEI KONTAKT MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle beschmutzten, getränkten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. P301+P330+P331 BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. P310 Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Sonstige Gefahren Von Chemikalien gehen grundsätzlich besondere Gefahren aus. Sie sind daher nur von entsprechend geschultem Personal mit der nötigen Sorgfalt zu handhaben. 10 % APS-Lösung Gefahrenhinweise H272 Kann Brand verstärken; Oxidationsmittel. H334 Kann bei Einatmen Allergie, asthmaartige Symptome oder Atembeschwerden verursachen. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. Sicherheitshinweise P260 Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. P280 Schutzhandschuhe tragen. P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. Sonstige Gefahren Von Chemikalien gehen grundsätzlich besondere Gefahren aus. Sie sind daher nur von entsprechend geschultem Personal mit der nötigen Sorgfalt zu handhaben. 18

19 19 10% SDS-Lösung Gefahrenhinweise H315 - Verursacht Hautreizungen H319 - Verursacht schwere Augenreizung H335 - Kann die Atemwege reizen Sicherheitshinweise P304 + P340 - BEI EINATMEN: An die frische Luft bringen und in einer Position ruhigstellen, die das Atmen erleichtert P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasserspülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglickeit entfernen. Weiterspülen P312 - Bei Unwohlsein GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen P332 + P313 Bei Hautreizung: Ärztlichen Rat einholen/ärztlichehilfehinzuziehen P337+P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztlichen Rat einholen / ärztliche Hilfe hinzuziehen P362 - Kontaminierte Kleidung ausziehen und vor erneutem Tragen waschen Sonstige Gefahren Von Chemikalien gehen grundsätzlich besondere Gefahren aus. Sie sind daher nur von entsprechend geschultem Personal mit der nötigen Sorgfalt zu handhaben. HCl Salzsäure 37% reinst Gefahrenhinweise H290 Kann gegenüber Metallen korrosiv sein. H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H335 Kann die Atemwege reizen. Sicherheitshinweise P280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. P261 Einatmen von Rauch vermeiden. P304+P340 BEI EINATMEN: An die frische Luft bringen und in einer Position ruhigstellen, die das Atmen erleichtert. P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. P310 Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. P403+P233 Behälter dicht verschlossen an einem gut belüfteten Ort aufbewahren. Sonstige Hinweise Unterm Abzug arbeiten. 1 M Imidazol Lösung (KMR-Stoff!) Gefahrenhinweise H302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken. H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H361d Kann vermutlich das Kind im Mutterleib schädigen. Sicherheitshinweise P260 Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. P281 Vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung verwenden. P303+P361+P353 BEI KONTAKT MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle beschmutzten, getränkten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. P301+P330+P331 BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. P308+P313 BEI Exposition oder falls betroffen: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. Sonstige Hinweise Unter dem Abzug arbeiten Umgang mit Imidazol ist für Schwangere verboten 19

20 20 10x NF-TBE Gefahrenhinweise H315 Verursacht Hautreizungen. H319 Verursacht schwere Augenreizung. Sicherheitshinweise P280 Schutzhandschuhe und Augenschutz tragen. P302+P352 BEI KONTAKT MIT DER HAUT: Mit viel Wasser und Seife waschen. P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. P308+P313 BEI Exposition oder falls betroffen: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. Sonstige Gefahren Von Chemikalien gehen grundsätzlich besondere Gefahren aus. Sie sind daher nur von entsprechend geschultem Personal mit der nötigen Sorgfalt zu handhaben. 1 M DTT - Lösung Gefahrenhinweise H315 Verursacht Hautreizungen. H319 Verursacht schwere Augenreizung. Sicherheitshinweise P305+P351+P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. Sonstige Gefahren Von Chemikalien gehen grundsätzlich besondere Gefahren aus. Sie sind daher nur von entsprechend geschultem Personal mit der nötigen Sorgfalt zu handhaben. 70 % Ethanol (EtOH) Gefahrenhinweise H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. Sicherheitshinweise P210 Von Hitze/Funken/offener Flamme/heißen Oberflächen fernhalten. Nicht rauchen. P233 Behälter dicht verschlossen halten. Sonstige Gefahren Von Chemikalien gehen grundsätzlich besondere Gefahren aus. Sie sind daher nur von entsprechend geschultem Personal mit der nötigen Sorgfalt zu handhaben. 20

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