The Prefoldin-like URI Complex a Cancer Chaperone Involved in Colorectal Carcinoma Development

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1 Diss. ETH No The Prefoldin-like URI Complex a Cancer Chaperone Involved in Colorectal Carcinoma Development A dissertation submitted to ETH Zurich for the degree of Doctor of Sciences presented by KAMIL ANDRZEJ LIPI!SKI Magister in Biotechnology, Uniwersytet Warszawski born 4 th February, 1986 citizen of Poland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Wilhelm Krek Prof. Dr. Matthias Peter Prof. Dr. Gerhard Christofori 2013

2 A BSTRACT Molecular chaperones play a central role in maintaining protein homeostasis by assisting protein folding, assembly of macromolecular complexes and signal transduction. Their role in the pathology of human neurodegenerative diseases has been well established and more recently, chaperones have emerged as important players in cancer progression. Their tumor-sustaining potential is mostly attributed to alleviating adverse effects associated with oncogenesis on a cellular level, though how they participate in this process remains to be elucidated. Previous work from our laboratory on a poorly understood eukaryotic chaperone system termed the Prefoldin-like/URI complex demonstrates that the unconventional prefoldin URI is amplified in a subset of ovarian carcinomas. URI overexpression promotes malignant growth by removing a negative feedback constraining S6 kinase 1 (S6k1) activity downstream of the insulin-like growth factor (IGF) signaling pathway. In this study we evince a new role for URI in the progression of colorectal carcinoma (CRC). While in the vast majority of tumors from CRC patients URI is overexpressed on the protein level. colorectal cancer cells show no sign of altered S6k1 signaling following URI depletion. Instead, we demonstrate that in this particular cancer type the critical function provided by URI relates to its role in the Prefoldin-like/URI chaperone complex and its control of the p53 tumor suppressor. We show that disrupting the functional integrity of this chaperone complex stabilizes the p53 protein and activates its downstream apoptotic signaling, eliciting a robust mitochondria-mediated cell death in a subset of colorectal cancer cells. Importantly, induction of p53 signaling by disrupting the Prefoldinlike/URI complex is immediate and independent of DNA damage, suggesting a novel regulatory mechanisms for p53 activation. Chaperones that take part in cancer progression are considered to provide selective advantage in a specific cellular context. Indeed, we show that while some CRC cell lines are critically dependent on this chaperone for their survival, it is virtually dispensable for others. Our data suggests that this differential susceptibility depends, at last in part, on the functionality of the p53 tumor suppressor and the relative expression level of the URI protein in these cells. All colon cancer cell lines that suffer from loss of the Prefoldin-like/URI complex express it at low level and either have wild-type p53 or the mutant protein retains some ability to convey apoptotic cues. We demonstrate that targeting URI in this CRC subtype leads to tumor regression in vivo. On the other hand, CRC cells expressing high levels of this chaperone are protected from URI depletion, regardless of their TP53 mutational status and show increased chemotherapy resistance. Thus, unlike in ovarian cancers, URI is not an addictive oncogene in CRC, but rather a cancer chaperone required to maintain the transformed state of the cell and its tumorigenic potential. Furthermore, we show that the tumor promoting capabilities of the Prefoldin-like/URI complex may be linked to its yet uncharacterized chaperoning activity. Interfering with the functional - 8 -

3 integrity of this chaperone in URI-dependent cells causes proteasomal degradation of central components of several large multi-protein complexes, such as ATM, ATR and RNA Polymerase II. The recurrently increased expression of the Prefoldin-like/URI complex leads to an enhanced biogenesis of these potential client molecules and can promote tumor cell proliferation. Moreover, we present evidence that the impaired maturation of RNA Polymerases may provide the link between the loss of the Prefoldin-like/URI chaperone complex and the subsequent activation of the p53 pathway. Finally, we demonstrate that URI is a target of the oncogenic ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling in Braf-mutated colorectal cancers. We show that hyperactive ERK1/2 phosphorylates URI at threonine 386, which is located within the binding domain for the serine/threonine protein phosphatase 1 gamma (PP1!). The Braf V600E -driven URI phosphorylation releases the phosphatases from the complex, enabling it to act on the upstream MAPK kinase MEK1/2. Together, the data collected suggest that URI-PP1! form a possible negative feedback that restricts the oncogenic Braf signaling in colorectal carcinomas. In conclusion, this study proves the existence of profound mechanistic discrepancies underlying chaperone function in different malignancies and provides a rationale for targeting the Prefoldin-like/URI complex in the treatment of a subset of CRCs. Furthering our understanding of the complexity of cancer, this phenomenon may have a major impact on the choice of effective anticancer therapies in the future

4 Z USAMMENFASSUNG Molekulare Chaperone spielen eine zentrale Rolle in der Erhaltung der Proteinhomöostase durch Unterstützung der Faltung von Proteinen, Zusammensetzung von makromolekularen Komplexen und der Signaltransduktion. Ihre Funktion in der Entstehung von neurodegenerativen Krankheiten im Menschen ist seit langem etabliert. Zunehmend werden Chaperone auch als wichtige Komponenten in der Krebsentwicklung beschrieben, und ihr onkogenes Potential ist vor allem auf ihre stressabbauende Wirkung zurückzuführen. Wie Chaperone dies auf molekularer Ebene bewältigen, konnte jedoch bisher noch nicht geklärt werden. Vorrausgehende Studien die in unserem Labor durchgeführt worden sind und sich mit einem relativ unbekannten, eukaryotischem Chaperon System, dem Prefoldin-like/URI Komplex, befasst haben, haben gezeigt, dass das unkonventionelle Prefoldin URI in einem Subset von Ovarkarzinome amplifiziert ist. Überexpression von URI begünstigen maligne Wucherungen indem es eine negative Regulierungsschleife entfernt, welche die Aktivität der S6 Kinase 1(S6K1) in der Insulin-like growth factor (IGF) Signalkaskade einschränkt. In der hier präsentierten Studie beschreiben wir eine neue Rolle für URI in der Entwicklung des kolorektalen Karzinom (CRC). Während in den meisten Tumoren von CRC Patienten URI auf Proteinebene überexprimiert ist, zeigen Darmkrebszellen keine Änderung im S6K1 Signalweg, wenn URI runterreguliert wird. Stattdessen zeigen wir, dass sich in dieser speziellen Krebsart die entscheidende Funktion von URI auf seine Rolle im Prefoldin-like/URI Chaperon Komplex und dessen Kontrolle des p53 Tumorsupressors bezieht. Wir zeigen, dass Störung der Funktionsfähigkeit dieses Chaperon Komplexes das p53 Protein stabilisiert, was zu einer Aktivierung p53-regulierter Apoptose Kaskaden führt und einen robusten, Mitochondrien-vermittelten Zelltod in einem Subset der kolorektalen Krebszelllinien auslöst. Wesentlich ist, dass die Induktion der p53 Signalwege, ausgelöst durch die Zerfall des Prefoldin-like/URI Komplexes, direkt und unabhängig von DNA-Schädigung ist, was auf einen neuen regulatorischen Mechanismus zur Aktivierung von p53 deutet. Man vermutet, dass Chaperone die an der Tumorprogression beteiligt sind, einen selektiven Vorteil in einem bestimmten zellulären Kontext bewirken. In der Tat zeigen wir, dass dieses Chaperon für das Überleben einiger CRC Zelllinien unentbehrlich ist, hingegen ist es unwichtig für andere CRC Zelllinien. Unsere Daten deuten darauf hin, dass diese Suzeptibilität, zumindest teilweise, auf die Funktionalität des p53 Tumorsuppressors und auf das relative Expressionsniveaus des URI Proteins in diesen Zellen zurückzuführen ist. Alle Darmkrebs Zelllinien, die unter dem Verlust des Prefoldinlike/URI Komplexes leiden, exprimieren diesen nur auf einem sehr niedrigen Level und haben entweder Wildtyp p53 oder das mutierte Protein hat eine Teil seiner Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, beibehalten. Wir können zeigen, dass wenn URI in diesem Subtyp entfernt wird, dies zu einer Rückbildung von Tumoren in vivo führt. Auf der anderen Seite sind CRC Zellen, die große Mengen dieses Chaperons exprimieren, gegen einen Verlust des URI Proteins geschützt, und dies ist unabhängig vom p53 Status. Zudem weisen diese Zelllinien eine höhere Chemotherapie Resistenz auf

5 Somit ist URI in CRC, im Gegensatz zu Eierstockkrebs, kein addiktives Onkogen, sondern vielmehr ein Krebs Chaperon, welches für die Erhaltung des transformierten Zustandes und des tumorigenen Potentials benötig wird. Darüber hinaus zeigen wir, dass die tumorfördernde Fähigkeiten des Prefoldin-like/URI Komplexes mit dessen noch nicht charakterisierten Chaperon Aktivität zusammenhängen könnte. Wenn man die Funktion dieses Chaperon in URI-abhängigen Zellen beeinflusst, hat dies proteasomalen Abbau von zentralen Komponenten mehrere Multi-Protein-Komplexe, wie ATM, ATR und RNA Polymerase II, zur Folge. Erhöhte Expression des Prefoldin-like/URI Komplex führt zu vermehrter Biosynthese dieser potenziellen client Moleküle und kann die Tumorzellproliferation fördern. Zudem zeigen wir Evidenz dafür, dass die Beeinträchtigung der Maturation von RNA Polymerasen die Verbindung zwischen dem Verlust des Prefoldin-like/URI Chaperon Komplex und der anschließenden Aktivierung der p53 Signalwege sein könnte. Letztlich zeigen wir, dass URI ein Substrat der ERK Kinase ist. Diese ist Teil der onkogen aktivierten Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Signalkaskade in Braf-mutiertem Darmkrebs. Wir zeigen, dass durch Braf V600E hyperaktiviertes ERK1/2 URI an Threonin 386 phosphoryliert, welches sich in der Bindedomäne der Serin/Threonin Protein Phosphatase 1 gamma (PP1!) befindet. Diese Braf V600E gesteuerte Phosphorylierung von URI, entlässt die Phosphatase aus dem Komplex, welche nun auf die oberhalb in der Signalkaskade angesiedelte MAPK Kinase MEK1/2 wirken kann. Zusammengenommen deuten die präsentierten Daten darauf hin, dass URI-PP1! eine mögliche negative Rückkoppelung bildet, welche onkogene Braf Signale im kolorektalen Karzinom einschränkt. Zusammenfassend demonstriert die vorliegende Arbeit das Bestehen von tiefgreifenden mechanistischen Unterschieden, die der Chaperon Funktion in verschiedenen malignen Erkrankungen zugrunde liegen und liefert ein Argument für das gezielte Angreifen des Prefoldin-like/URI Komplexes in der Behandlung einer bestimmten Gruppe von CRCs. Das hier beschriebene Phänomen trägt zu unserm Verständnis der Komplexität von Krebserkrankungen bei und ermöglicht es, wichtige Schlussfolgerungen für die Suche nach effektiveren und gezielteren Krebs-Therapien zu ziehen