Klassifizierung: noch nicht abgeschlossen, Verwandtschaftsverhältnis zur Familie: Desulvovibrionaceae - Vertreter Desulvovibrio desulfuricans

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1 AVID X / 1998 Lawsonia intracellularis Seite -1- Klassifizierung: noch nicht abgeschlossen, Verwandtschaftsverhältnis zur Familie: Desulvovibrionaceae - Vertreter Desulvovibrio desulfuricans 1. ALLGEMEINES Lawsonia intracellularis gilt als Verursacher der Proliferativen Enteropathien (Adenomatose - Komplex) des Schweines. Es handelt sich um ein obligat intracelluläres, 1,25-1,75 µm x 0,25-0,43 µm großes Bakterium, das in erster Linie apikal im Zytoplasma der Enterozyten des Ileums, distalen Jejunums sowie im Caecum und proximalen Colon nachweisbar ist. Da der Erreger auf künstlichen Nährböden nicht isolierbar ist, sind zur Isolierung Gewebekulturen notwendig. Eine Verdachtsdiagnose kann aufgrund der charakteristischen pathologischen Veränderungen geäußert werden, zur sicheren Diagnostik ist jedoch der Erregernachweis notwendig. 2. UNTERSUCHUNGSMATERIAL Zum bakterioskopischen Erregernachweis mittels modifizierter Ziehl - Neelsen Färbung sind verdächtige Darmteile einzusenden. Der Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels PCR ist sowohl in Darmteilen als auch in Kotproben möglich und erfordert keine besonderen Transportbedingungen. Die Nachweisrate aus Darmmaterialien beträgt etwa 10 1 Erreger/g Untersuchungsmaterial, aus Kotproben etwa 10 3 Erreger/g Kot. 3. UNTERSUCHUNGSGANG 3.1. Bakterioskopie Zum Erregernachweis in Darmschnitten wird eine modifizierte Ziehl - Neelsen - Färbung verwendet. Das native Darmstück wird bei -20 C 3 min tiefgefroren und am Kryostaten 5 µm dick geschnitten. Anschließend erfolgt eine min lange Färbung mit Karbolfuchsin (Ziehl - Neelsen, 1:5 verdünnt mit Aqua dest.). Danach wird 30 s mit 0,5 %igem Eisessig entfärbt und 30 s mit Löffler s Methylenblau gegengefärbt. Die Lawsonien stellen sich in der modifizierten Ziehl - Neelsen-Färbung als rote, gebogene Stäbchen dar.

2 AVID X / 1998 Lawsonia intracellularis Seite PCR Durchführung der PCR DNA - Extraktion (Reagenzien siehe Anhang 1) 0,2 g Faeces bzw. Darmabstrich mit 1 ml Lysis - Puffer mischen, 30 s schütteln, anschließend 1 h bei Raumtemperatur inkubieren bei g 1 min zentrifugieren Überstand in ein Eppendorftube mit 50 µl DE - Suspension pipettieren, 10 min bei Raumtemperatur inkubieren Probe 30 s schütteln, anschließend bei g 1 min zentrifugieren Lysis - Puffer abpipettieren und das DE - Pellet insgesamt 5 mal waschen 2 mal mit 200 µl Wasch - Puffer 2 mal mit 200 µl eiskaltem Ethanol 1 mal mit 200 µl eiskaltem Aceton Bei jedem Waschschritt wird das Pellet nach Zugabe von 200 µl Flüssigkeit (Wasch - Puffer, Ethanol, Aceton) bis zur Auflösung am Vortex 30 s lang geschüttelt und anschließend bei g 1min zentrifugiert. Der Überstand wird schließlich verworfen. Trocknung des Aceton - Pellets bei 56 C 15 min Zugabe von 75 µl Lagerungs - Puffer, am Vortex 30 s schütteln, bei g 1min zentrifugieren Überstand (enthält das extrahierte DNA - Template) abpipettieren und in sterilem Eppendorftube bis zum PCR - Ansatz bei 4 C lagern PCR - Mastermix (Reagenzien siehe Anhang 2) 1.) 10,9 µl Aqua dest. 2.) 2,5 µl 10 X PCR Puffer II (500 mm KCl; 100 mm TrisHCl, ph 8,3) 3.) 2,5 µl MgCl 2 (entspricht 2,5 mm MgCl 2 ) 4.) 4,0 µl dntp Solution (200 µm/dntp) 5.) 0,8 µl Primer (A oder C) (entspricht 0,16 µm Primer) 6.) 0,8 µl Primer (B oder D) (entspricht 0,16 µm Primer) 7.) 2,5 µl extrahiertes DNA - Template 8.) 1,0 µl AmpliTaq (0,5 U) Gesamtvolumen: 25 µl DNA - Amplifikation - Thermocyclerprogramm Perkin Elmer GeneAmp 2400 Thermocycler 94 / 3 min (initiale Denaturierung)

3 AVID X / 1998 Lawsonia intracellularis Seite / 40 s (Denaturierung), 55 / 40 s (Primer - Annealing), 72 / 40 s (DNA - Synthese), 35 X; 72 / 7 min (DNA - Synthese) Elektrophorese 2 %iges Agarose Gel und Ethidiumbromid - Färbung: 120 V/60 min DNA - Detektion Mittels UV - Transilluminator positiv: DNA - Bande bei 329 bp (Primer A/B) positiv: DNA - Bande bei 270 bp (Primer C/D) Validierung der PCR Da die in situ - Darstellung des Erregers mittels modifzierter Ziehl - Neelsen Färbung im Falle klar definierter pathologischer Krankheitsbilder zu einer eindeutigen Diagnose führt, wurde diese Methode zur Überprüfung der Spezifität bei Etablierung der PCR - Methode verwendet. 28 pathoanatomisch bzw. pathohisto-logisch (H.E.- Färbung) ansprechbare Verlaufsformen des Adenomatose - Komplexes wurden mittels modifzierter Ziehl - Neelsen Färbung und PCR - Methode untersucht. Dabei konnten sowohl mit der Erregerdarstellung als auch mit der PCR - Methode alle pathoanatomisch positiven Proben (n = 28) in beiden Verfahren als Lawsonia - positiv bestätigt werden. 10 pathologisch unauffällige Ilea von Fleischfressern sowie 15 Ilea von Saugferkeln ohne Hinweise auf Adenoma-oseerkrankung wurden als Negativkontrollen mitgeführt und blieben sowohl färberisch als auch in der PCR negativ. 4. LITERATUR DÜNSER, M., SCHWEIGHARDT, H., KRASSNIG, G. (1997): Nachweis von Lawsonia intracellularis, des Erregers der Proliferativen Enteropathien des Schweines (Adenomatose - Komplex) mittels Polymerase - Kettenreaktion in Oberösterreich. Wien. Tierärztl. Mschr. 84, JONES, G. F., WARD, G. E., MURTAUGH, M. P., LIN, G., GEBHART, C. J. (1993): Enhanced Detection of Intracellular Organism of Swine Proliferative Enteritis, Ileal Symbiont Intracellularis, in Feces by Polymerase Chain Reaction. J. Clin. Microbiol., 31, LAWSON, G.H.K., McORIST, S., JASNI, S., MACKIE, R.A. (1993): Intracellular Bacteria of Porcine Proliferative Enteropathy: Cultivation and Maintenance In Vitro. J. Clin. Microb. 31, SACHBEARBEITER

4 AVID X / 1998 Lawsonia intracellularis Seite -4- Dr. Michael Dünser HR Dr. Hans Schweighardt Bundesanstalt für veterinärmedizinische Untersuchungen Linz, Hans Kudlichstr. 27, A-4021 Linz, Tel. 0043/732/ , Fax 0043/732/ ANHANG 1: Reagenzien zur DNA - Extraktion 283 g GuSCN (Fa. Sigma, Best. Nr. G ) 4,84 g TrisHCl (Fa. Boehringer - Ingelheim, Best. Nr ) 100 ml Aqua dest. unter Wärme bis zum vollständigen Auflösen rühren Aqua dest. ad 400 ml 200 ml auf ph 6,4 einstellen Wasch - Puffer (6 M GuSCN; 0,1 M TrisHCl) zu den restlichen 200 ml: 1,63 g EDTA (Fa. Boehringer - Ingelheim, Best. Nr ) 1,3 ml Triton X (Fa. Sigma, Best. Nr. T ) einstellen auf ph 6,4 Lysis - Puffer (6 M GuSCN, 0,1 M TrisHCl, 22 mm EDTA, 0,65 % Triton - X) Lagerungs - Puffer 10 mm TrisHCl (ph 8,4) 1 mm EDTA 1:1 mischen Lagerungs - Puffer DE - Suspension 20 % (wt/vol) 10 g Diatomaceous Earth (Fa. Sigma, Best. Nr. D ) 50 ml Aqua dest. 0,75 ml HCl 37 % (Fa. Merck, Best. Nr ) Ethanol 70 % Aceton

5 AVID X / 1998 Lawsonia intracellularis Seite -5- ANHANG 2 dntp Stock - Solution (Fa. Perkin Elmer, Best. Nr. N ) 50,0 µl Aqua dest. 12,5 µl datp 12,5 µl dgtp 12,5 µl dttp 12,5 µl dctp Total 100 µl 4 µl/25 µl Mastermix - Reaktionsvolumen ergeben 200 µm/dntp im Mastermix AmpliTaqverdünnung 1:10 1 µl AmpliTaq (Fa. Perkin Elmer, Best. Nr. N ) und 9 µl Puffer II (ohne MgCl 2 ) (Fa. Perkin Elmer, Best. Nr. N ) ( 5 U/10 µl) Primerverdünnung: 0,2 µm/primer A, B, C, D A: 5 - TAT GGC TGT CAA ACA CTC CG - 3 B: 5 - TGA AGG TAT TGG TAT TCT CC - 3 C: 5 - TTA CAG GTG AAG TTA TTG GG - 3 D: 5 - CTT TCT CAT GTC CCA TAA GC - 3 (JONES et al., 1993)

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