Mir-221 predicts prostate cancer specific survival in high-risk prostate cancer patients and regulates proliferation, apoptosis and invasive activity

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1 Mir-221 predicts prostate cancer specific survival in high-risk prostate cancer patients and regulates proliferation, apoptosis and invasive activity by inhibition of IRF2 and SOCS3

2 Einleitung: Funktion der micrornas micrornas inhibieren posttranskriptionell die Expression ihrer Zielgene die Erkennung der Ziel-RNA erfolgt aufgrund von Bindung der mirna an eine komplementäre mrna Sequenz. jede mirna kann die Expression mehrerer Zielgene regulieren eine mirna kann sowohl Onkogenen als auch von Tumorsuppressor Genen inhibieren. mir-221 ist initial als Onkogen in verschiedenen Tumoren beschrieben worden, da mir-221 als Ziel- Gene Tumorsuppressoren (p27, Pten, TIMP3 u.a.) inhibiert. mir-221 ist in bis zu 90% aller PCa signifikant herabreguliert

3 Zellbiologische Effekte einer mir-221 Überexpression in PCa Zellen MTS absorbance 490 nm PC-3 ctrl pre mir-221 * * days post transfection x fold increase in caspase 3 /7 activity 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ctrl pre mir mir-221 Überexpression führt in PCa Zellen zu - Wachstumsinhibierung - Induktion von Apoptose - verringerter Migration

4 Globale Genexpression in mir-221 überexprimierenden PCa Zellen OAS1 OAS1 IFI44 IFI44L DDX60 PARP14 PARP10 STAT1 PARP9 OAS3 CMPK2 SAMD9 IFI27 DTX3L PLSCR1 NA SP100 IRF9 RHOT1 IFIT1 IFIT3 IFI6 MX1 STAT1 PLSCR1 IFITM2 STAT1 ISG15 IFITM1 IFIH1 HERC6 OAS2 DDX58 DDX58 MX2 STAT1 PARP9 SAMHD1 SAMD9 STAT1 SP110 IFI16 OAS2 NA SAMHD1 IFI44 NA NA NA STK32B mir-221 reguliert Gene des JAK/STAT Signalwegs

5 Modell der mir-221 vermittelten Regulation des INFγ- Signalwegs Interferon SOCS3 mir-221 Signalübertragung und Aktivierung Interferon-induzierbarer Gene... Stat1 / p-stat 1 IRF2 IRF-9, IFI-16 IRF-1 Tumor-suppressive Effekte

6 SOCS3 und IRF2 als Zielgene der mir-221 relative luciferase activity 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 relative luciferase activity 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 SOCS3 IRF2 pstat1 pstat1 ERK ERK mir-221 bindet an die 3 UTR von SOCS3 bzw IRF2 und inhibiert ihre Expression

7 Expression von mir-221, SOCS3 und IRF2 im Prostatakarzinom mir cor= mir cor= SOCS-3 IRF-2 mir-221 Expression korreliert invers zur Expression von SOCS3 und IRF2.

8 Modell der mir-221 vermittelten Regulation des INFy Signalwegs im PCa Interferon mir-221 SOCS3 IRF 2 Signalübertragung und Aktivierung Interferon-induzierbare Gene... Stat1 / p-stat 1 IRF-9, IFI-16 IRF-1 Tumor Suppression PCa mit verringerter mir-221 Expression unterdrückt das INFγ Signal aufgrund fehlender Inhibierung von SOCS3 und IRF2

9 MiR-221 als prognostischer Biomarker im High Risk PCa n=134 n=89 mir-221 down: 92% mir-221 down: 89% mir-221 Expression in zwei unabhängigen High Risk PCa Kohorten: PSA >20 ng/ml ODER T3/4 ODER Gleason score 8-10

10 MiR-221 als prognostischer Biomarker im High Risk PCa Group I Group II Cancer specific survival (%) log rank test: p< mir-221>-0.32 n= 87; alive:87 death:0 mir-221<-0.32 n= 47; alive:36 death:11 Cancer specific survival (%) log rank test: p< mir-221>-0.32 n= 69; alive:68 death:1 mir-221<-0.32 n= 20; alive:10 death: Time since radical prostatectomy (months) Time since radical prostatectomy (months) variable mir-221 (dichotomized) univariate multivariate AIC HR 95% CI p value HR 95% CI p value * * p< * * p<0.001 Gleason p= , ,12 PSA p=0.32 lymph node invasion p= , ,049 Age p=0.88 pt p=0.97 mir-221 Expression korreliert mit Tumor-spezifischem Überleben und besitzt Potential als prognostischer Marker in zwei unabhängigen High Risk Kollektiven.

11 Perspektive Identifikation weiterer mir-221 spezifischer Zielgene (PMEAP1, PIK3R1) und mir-221 regulierter Signalwege (TGFβ, TRAIL); Etablierung von Tissue Micro Arrays der High Risk PCa Proben zur Bestimmung der Expression weiterer mir-221 Zielgene; Aufbau einer mirna Expressionsdatenbank unter Verwendung der High Risk Kollektive (Analyse weiterer PCa spezifischer mirs, z.b. mir-203, mir-200, mir-9 u.a.); Etablierung von stabil transfizierten, mir-221-induzierbaren Zelllinien für die Verwendung von Xenograft-Experimenten im Mausmodell / Analyse therapeutischer Gaben von INFγ (TGFβ, Trail) in vivo;

12 Acknowledgement Department of Urology and Paediatric Urology, University Hospital Würzburg M. Krebs C. Kalogirou V. Schwartz B. Dexler K. Borschert B. Kneitz H. Riedmiller Department of Urology, University Hospital Bern, Inselspital, Bern A. Wetterwald M. Spahn Physiological Chemistry I, Biocenter, University of Würzburg S. Kneitz Department of Urology, University Hospital Leuven, S Joniau H. van Poppel, Department of Pathology, University Hospital Leuven, E. Lerut Department of Pathology, University Hospital Göttingen P. Ströbel

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15 Vorarbeiten: mir-221 Expression im PCa 2.0 mir-221 Log Intensity 8.8 mir-13255* mir-513 mir-10769* mir-7912* mir-301 mir-526b mir-9565* mir-520g mir-343 mir-373 mir-197 mir-148b mir-13232* relative mir-221 expression ( Ct) * mir-221 met-2 met-3 met-1 met-4 PCa-4 PCa-2 PCa-3 PCa-1 BPH BPH BPH BPH BPH PCa met mir-221 ist in bis zu 90% aller PCa signifikant herabreguliert mir-221 ist in Lymphknoten-Metastasen signifikant herabreguliert

16 Die kollaborative SPECTApros Plattform Molekulare und Imaging Screening Plattform Academia Investment Standard treatment (no open trial) 1 st line trial Standard treatment First line 2 nd line trial Third line Industrie Kooperation First line Second line 3 rd line trial Standard treatment (no open trial)

17 Microarray results Gene logfc p-value Gene logfc p-value pre-mir-221 vs. anti-mir-221 pathway Induction of interferon signalling RSAD2 5,642 0, RSAD2 5,641 0, BST2 5,354 0, SLC14A1-2,186 0, XAF1 5,225 0, EVI2A -2,132 0, Gene OASL 5,024 0, ZFPM2-2,068 0, OASL 4,951 0, TRIM22 4,593 0, ZNF652-2,052 0, Gene MX2 4,561 0, KDR -2,016 0, OAS2 4,513 0, TNFSF10 4,247 0, IFI27 4,145 0, MX1 4,118 0, RTP4 4,086 0,00616 OAS1 4,026 0, CMPK2 3,998 0, EPSTI1 3,947 0, OAS1 3,942 0, IFI44 3,880 0, OAS3 3,845 0,00022 HERC6 3,793 0, GBP1 3,781 0, IFITM1 3,753 8,99E-05 IFIH1 3,726 0, IFIT1 3,690 0, EPSTI1 3,635 0, SLC14A1-2,482 0, _at -2,358 0, FN1-1,956 0, SPAG11B -1,930 0, SIL1-1,870 0, LGALS3-1,855 0, PPP1R16B -1,850 0, CDH12-1,811 0, HNMT -1,799 0, SPARC -1,796 0, SSR3-1,784 0, _at -1,783 0, CDH6-1,769 0, SSR3-1,711 0, _at -1,705 0, (30) IFI44 3,528 0, (31) GBP1 3,511 0, (33) IFI16 3,484 0, (35) STAT1 3,449 0, (37) IFI16 3,407 0, (39) IFI35 3,372 0, (40) IFIT2 3,359 0, (42) IFIT2 3,306 0, (44) IFIT3 3,194 0, (45) IFI16 3,185 0, (167) IRF9 1,810 0, (242) IRF1 1,551 0,052278

18 Confirming microarray results Stat1 IRF1 IRF9 1 RT-PCR PC-3 cells, day 2 p.t. Relative Expression * p = 0,012 * p = 0,037 * p = 0,038 mir221 Control Western Blot PC-3 cells, day 2 p.t. Phospho-Stat premir IFN ɣ Stat 1 ERK 2

19 Expression von mir-221, SOCS3 und IRF2 im Prostatakarzinom mir-221 mir-221 relative expression SOCS3 or IRF2 mir-221 mir-221 SOCS-3 IRF-2 mir-221 Expression korreliert invers zur Expression von SOCS3 und IRF2.

20 Globale Genexpression in mir-221 überexprimierenden PCa Zellen down up mir-221 reguliert Gene des JAK/STAT Signalwegs

21 mir-221 reguliert das IFN γ Signal 1000 ctrl pre mir pre-mir221 IFNγ STAT gifn + ctrl gifn + pre mir pstat1 400 ERK days post transfection mir-221 induziert Gene des JAK/STAT Signalwegs und sensitiviert PCa Zellen gegenüber INFγ

22 MiR-221 als prognostischer Biomarker im High Risk PCa Cohort 1 Cohort 2 Number of patients mir-221 Expression in zwei unabhängigen High Risk PCa Median follow-up, 76 (1-154, 37.8) 108 (1-200, 44.2) Median PSA 33.1 (20-160) 17.1 (1.1-95, 18.7) Kohorten (PSA >20 ng/ml und/oder pgs (1.45) 26 (29.2) T3/4 und/oder Gleason score 8-10) pgs 7 pgs (35.1) 85 (63.4) 43 (48.3) 20 (22.5) mir-221 down 92% 89% Relapse events: Biochemical Clinical recurrence Cancer related death 39 (39.0) 16 (11.9) 11 (8.2) 43 (48.3) 15 (16.9) 12 (13.5)