Real-Time PCR von Processed Animal Proteins (PAP) in Futtermittel

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Manuela Stieber
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1 RealTime PCR von Processed Animal Proteins (PAP) in Futtermittel Dr. Sonja Haider ZAM/MIMO ALVA Futtermitteltagung Linz, Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH

2 Agenda Warum / Rechtliche Grundlagen Methodenübersicht Methode: Mikrodissektion Methode: RealTime PCR (Hauptaugenmerk) 2

3 Processed Animal Proteins (PAP) Ziel: PAPs aus Futtermitteln mittels RealTime PCR einer bestimmten Tierart (Nutztiere) zuordnen processed animal protein" bedeutet meat and bone meal (MBM), meat meal, bone meal, blood meal, dried plasma and other blood products, hydrolysed protein, hoof meal,... Warum? PAPs an Nutztiere verfüttern ist verboten BSE (Bovine spongiform encephalopathy) oder allg. als Rinderwahn bekannt wird durch Prionen (atypische Eiweißkörper) verursacht welche über Futtermittel übertragen werden, die mit infizierten Tier und Knochenmehlen kontaminiert sind 3

meal,... Warum? PAPs an Nutztiere verfüttern ist verboten BSE (Bovine spongiform encephalopathy) oder allg.

4 Rechtliche Grundlagen Warum PAPs einer Tierart zuordnen? EG Verordnung 999/2001: Verfütterungsverbot von PAPs an alle Nutztiere Ausnahmen: Fischmehl an NICHTWIEDERKÄUER erlaubt! EG Nr. 956/2008: Änderung von Anhang IV der Verordnung EG 999/2001 z.b. Fischmehl zur Fütterung an junge Nutzwiederkäuer wird zur Herstellung von Milchaustauschfuttermitteln zugelassen erlaubt! Kälber, Schweine, Hühner, futter NICHT erlaubt! 4

5 Methodenübersicht Klassische Mikroskopie: IDENTIFIZIEREN Knochenfragmente: Unterscheidung Fisch, Geflügel und Landtiere möglich Mikrodissektion: RealTime PCR: IDENTIFIZIEREN Muskelfragmente: Unterscheidung von Fisch, Geflügel und Landtieren NICHT möglich SEPARIEREN Muskelfragmente: Muskelfasern werden einzeln aus dem Präparat separiert DIFFERENZIEREN Muskelfragmente: Einzelne Muskelfasern können einer bestimmten Tierart zugeordnet werden 5

Geflügel und Landtieren NICHT möglich SEPARIEREN Muskelfragmente: Muskelfasern werden einzeln aus dem Präparat

6 Mikrodissektion Mit spezieller Lasermikroskopie & Pressure Catapulting (LMPC, Mikrodissektion) werden Muskelfasern oder Knochenfragmente identifiziert und separiert Abteilung Düngemittelüberwachung und Mikroskopie (DMMI) Muskelfaser 6

oder Knochenfragmente identifiziert und separiert

7 Mikrodissektion: Laser Pressure Catapulting: Muskelfaser wird direkt ins Eppi geschossen! Berührungslose Probengewinnung: keine Kontamination hochreine Probe Warum Mikrodissektion und nicht gleich RealTime? Mit RealTime kann man die Tierart auf DNA Ebene bestimmen, man weiß aber nicht ob die DNA aus Eiweißoder Fettprodukten stammt (ausgeschmolzene Fette und Fischöl dürfen verfüttert werden) Muskelfasern isolieren! 7

8 Methodik: DNAPräparation Eppi direkt für die DNA Präparation verwendet QIAamp DNA Micro Kit (speziell für mikrodissektierte Gewebe) Muskelfaser mit Puffer auf den Kopf gestellt inkubieren und anschließend abzentrifugieren Micro Kit DNA PCR 8

mikrodissektierte Gewebe) Muskelfaser mit Puffer auf den

9 RealTime PCR PCR: Polymerase Chain Reaction Molekularbiologische Methode, mit der man einen bestimmen und spezifischen DNA Abschnitt vom jeweiligen Tier sichtbar machen kann RealTime: funktioniert mit fluoreszenzmarkierten Sonden, die ebenfalls tierspezifisch sind Sonden werden aufgebraucht bis zu einem sichtbarem und messbarem Level 9

machen kann RealTime: funktioniert mit fluoreszenzmarkierten Sonden, die ebenfalls

10 RealTime PCR Reaktion Ct = 14,55 Ct = 18,18 Ct = 21,77 ctwert: beschreibt den Teil der Kurve an dem das Fluoreszenzsignal über das Hintergrundsignal ansteigt! 10

11 Endogene Kontrolle Proben werden nicht nur auf alle 7 Tierarten gescreent, sondern auch mit einem endogenen KontrollAssay: Wozu? hat die DNA Präparation überhaupt funktioniert? Wenn ja, wie viel DNA ist in meiner Probe (ungefähre Abschätzung) in welchem Verhältnis steht KontrollAssay mit dem TierAssay Um aufgetretene Signale richtig deuten zu können (positives oder negatives Ergebnis?) 18SAssay: 18S rrna Gen ist in den NORs (Nukleoli organising region) von bestimmten Chromosomen lokalisiert 18S rrna ist ein Bestandteil der Ribosomen und wird in jeder Zelle exprimiert großer Vorteil: diese Region ist bei Eukaryoten sehr konserviert! 11

Wenn ja, wie viel DNA ist in meiner Probe (ungefähre Abschätzung) in welchem Verhältnis steht KontrollAssay mit dem TierAssay Um aufgetretene Signale richtig

12 Abgleich der TierAssays mit 18SAssay, reine Fleischproben Rind Schwein Lamm Huhn Pute NTC Rind Schwein Lamm Huhn Pute ctwerte Rind Schwein Lamm Huhn Pute 18S ,81 37,5 26, , , , ,24 24, , ,49 26, ctwerte ctwerte = ctwerte Rind Schwein Lamm Huhn Pute ,43 17,08 15,12 Rind Schwein Lamm Huhn Pute Rind 1,81 10,38 ctwerte (Tier18S) Schwein 15,19 1,05 16,24 Lamm 0,84 12,2 CtWerte = Hintergrund: Huhn 2,92 z.b: RinderAssay gibt nach ~ 11,43 Zyklen einen Hintergrund auf reine Schwein DNA (Artefakt)! Pute 14,19 Unter der Annahme, dass alle Assays mit der annähernd gleichen Effizienz laufen! 1,55 12

11,43 17,08 15,12 Rind Schwein Lamm Huhn Pute Rind 1,81 10,38 ctwerte (Tier18S) Schwein 15,19 1,05 16,24 Lamm 0,84 12,2 CtWerte = Hintergrund: Huhn 2,92 z.

13 BeispielErgebnisse Rind Schwein Huhn 18S ct Rind ct Schwein ct Huhn 1 5 Mf Rind 25,07 36, ,93 11, Kn Geflügel ,65 32,5 1, Mf Schwein 0 27, ,5 0, Mf?? 34,84 34, ,5 13,34 13,08 Probe 1: Differenz Rind / Schwein ~ 12 Zyklen, muss ein Artefakt sein, weil 12 Zyklen entsprechen 3 LogStufen weniger (maximal 1/1000stel der Faser) Signal in einem so späten Zyklus (> 39) ist grundsätzlich fragwürdig Probe 4: ca. 4 LogStufen weniger drin kein Schwein, Rind oder Huhn 13

? 34,84 34,58 0 21,5 13,34 13,08 Probe 1: Differenz Rind / Schwein ~ 12 Zyklen, muss ein Artefakt sein, weil 12 Zyklen

14 Zusammenfassung: Fischmehl an NICHTWIEDERKÄUER erlaubt: 1) Mikrodissektierte Muskelfasern oder Knochenfragmente 2) RealTime PCR Es gibt zu viele Fischarten, das eine Identifizierung auf Fisch beinahe unmöglich macht Einfacher: wichtigste Nutztiere ausschließen! 14

PCR Es gibt zu viele Fischarten, das eine Identifizierung auf

15 Zukunftsaspekte Laborvergleich mit dem CRLAP: DMMI bekommt Futtermittel zur Mikrodissektion Mikrodissektierte Proben gehen ans CRLAP und an MIMO Teilnahme am 5. CRLAP Workshop in Wien: Präsentation der Methode und des Laborvergleiches 15

gehen ans CRLAP und an MIMO Teilnahme am 5.

16 Danksagung Abteilung Düngemittelüberwachung und Mikroskopie (DMMI) Labor von Dr. Franz Wernitznig Roland Weiss & Dr. Gabriele Spadinger für das zur Verfügung gestellte Probenmaterial 16

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