The human neutralizing antibody response against A/H1N1/Ca/2009 Influenza virus

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1 DISS.-NO. ETH The human neutralizing antibody response against A/H1N1/Ca/2009 Influenza virus A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by Alexander Frühwirth MMag. rer. nat. University of Vienna, Austria born on Vienna, Austria accepted on the recommendation of Prof. Dr. Antonio Lanzavecchia (examiner) Dr. Federica Sallusto (co-examiner) Prof. Dr. Manfred Kopf (co-examiner) 2016

2 3. Abstract 3. Abstract The Influenza A virus is classified based on 11 neuraminidase (NA) and 18 hemagglutinin (HA) glycoproteins that are subclassified into two major groups called group 1, which includes H1, H2, and H5, and group 2, which includes H3 and H7. Current seasonal Influenza A infections are caused by two specific strains, H1N1 (derived from the 1918 and 2009 pandemics) and H3N2 (derived from the 1968 pandemic), and are the focus of current vaccination strategies due to their prevalence in the human population. The continuous drift of H3N2 has forced its vaccine formulations to be changed constantly, whereas the recent pandemic H1N1 virus (A/California/7/2009) has remained relatively stable since 2010 and has not been changed in the annual vaccines since then. The HA molecule is the primary target of the neutralizing antibody response. The HA head is the most variable region and comprises five antigenic sites which have been mapped originally on PR8 using viral escape mutants (Sa, Sb, Ca1, Ca2 and Cb). Anti-HA head monoclonal antibodies are strain-specific and are known to be highly neutralizing by steric hindrance while anti-ha stem antibodies are heterosubtypic and weakly neutralizing, but showed protecting activity in-vivo in a Fc-depending manner, underlining the importance of additional effector mechanisms to be considered in the assessment of immune responses. Human monoclonal antibodies (mab) against the stem have been extensively characterized and shown to have a convergent (public) gene usage of VH1-69, to mature to full efficiency with only a few mutations and target conserved epitopes of HA, allowing them to bind to Influenza group 1 and 2 viruses. In contrast it is yet unclear how anti-head antibodies mature and which V-gene families are publicly or non-convergently (privately) used against the different antigenic regions. The few indepth human studies that have been done suggest multiple possible public VH gene usages, such as VH4-59 for antibodies against the receptor binding site or VH3-7 and VH3-15 in a focused antibody response against the border of the Sa and Ca1 region (K166, using H3 numbering). Overall, this underlines the need for further studies in humans to understand the development of the Influenza antibody response across the whole HA molecule in terms of public or private V-gene usage, maturation pathways and effector functions. 7

3 3. Abstract In this study, we analyzed the anti-ha head response of two vaccinated individuals, one of whom has been previously characterized in depth in terms of the anti-ha stem response. We isolated and characterized a panel of 95 monoclonal antibodies specific to H1N1/California/07/2009 (Ca09) in terms of their epitopes, V- gene usage, developmental processes and effector functions across the whole HA molecule. We established, with the help of a panel of antibodies mapped via viral escape mutants, a blocking-of-binding (BoB) assay to deconstruct, quantitatively, the sera antibody response according to the targeted antigenic sites on the HA over multiple years as well as in multiple donors. We report a potential public VH2-70 lineage of anti-ha head antibodies in two anti-sa/sb-dominated responses and describe their development by genealogy tree reconstructions in perspective of other anti HA-head antibodies. In addition, we identified a new antigenic site of the HA stem named the membrane-proximal external region (MPER) and a novel, functionally distinct, class of antibodies associated with it which can be found in multiple donors. Thus, the results of this study provide novel insights into the development of anti-ha head antibodies and contribute valuable information for the construction of a universally effective anti-ha immune response in the future by adding a new and distinct class of anti-ha stem antibodies to the picture. 8

4 4. Zusammenfassung 4. Zusammenfassung Die Klassifizierung des Influenza A Virus basiert auf dessen 11 Neuraminidase (NA) und 18 Hemagglutinin (HA) Glycoprotein Varianten die in Gruppe 1, welche unter anderem H1, H2, und H5 enthält, und Gruppe 2, welche unter anderem H3 und H7 enthält, aufgeteilt werden. Die gegenwärtigen saisonalen Influenza A Infektionen werden hauptsächlich von zwei bestimmten Virenstämmen, H1N1 (von den 1918 und 2009 Pandemien stammend) sowie H3N2 (von der 1968 Pandemie stammend), verursacht die durch ihre Häufigkeit in der Weltbevölkerung auch der Fokus von derzeitigen Impfstrategien sind. Während die kontinuierliche Veränderung des H3N2 Virus eine konstante Anpassung der jährlichen Impfstoffe verlangt, verblieb der pandemische H1N1 Virus (A/California/7/2009) seit der Einführung in die Impfstoffformulierung relativ stabil und wurde seit 2010 nicht mehr verändert. Das HA Molekül ist das Hauptziel von neutralisierenden Antikörpern. Der HA Kopf ist die variabelste Region von HA und wird, durch vorhergehende Studien mit durch Antikörper-induzierten viralen Mutationen, in fünf Bereiche unterteilt (Sa, Sb, Ca1, Ca2 und Cb). Anti-HA Kopf Antikörper sind üblicherweise spezifisch für einzelne Viren und neutralisieren diese sehr effektiv durch sterische Hinderung, während anti-ha Stamm Antikörper heterosubtypisch, schwach neutralisierend sind, jedoch in-vivo Fc Teil-abhängig schützen können. Dies unterstreicht die Notwendigkeit des guten Verständnisses von verschieden Schutzmechanismen von Antikörpern in der Immunantwort und deren qualitativer Beurteilung. Humane monoklonale Antikörper (mabs) gegen den Stamm wurden bereits ausgiebig charakterisiert und es wurde gezeigt dass diese konvergent (öffentlich) das VH1-69 Gen verwenden, bereits durch wenige Mutationen zu voller Effektivität heranreifen und gegen ein konserviertes Epitop des HA Stamms gerichtet sind welches ihnen erlaubt Viren der Gruppe 1 sowie der Gruppe 2 zu binden. Im Kontrast dazu ist es jedoch bis jetzt unklar welche konvergenten oder nicht-konvergenten (privaten) V- Gene von anti-kopf Antikörpern gegen die verschiedenen Bereiche von HA verwendet werden. Einige wenige Studien in diesem Bereich schlagen multiple VH Gene für diese Verwendung vor, wie zum Beispiel VH4-59 für Antikörper gegen die Rezeptorbindungstelle, oder VH3-7 bzw. VH3-15 im Fall einer fokussierten Immunantwort gegen die Grenze zwischen den Sa und Ca1 Regionen (Position K166, 9

5 4. Zusammenfassung H3 Nummerierung). Zusammenfassend unterstreicht dies die Notwendigkeit für weitere Studien im Bereich der anti-influenza Antikörperantwort, deren Entwicklung, konvergenten Verwendung von V-Genen und assoziierten Schutzmechanismen. In dieser Studie analysierten wir daher die anti-ha Kopf Immunantwort von zwei zuvor geimpften Donoren, wobei bei einem davon die anti-ha Stamm Antwort bereits ausgiebig untersucht wurde. Wir isolierten und charakterisierten insgesamt 95 monoklonale Antikörper spezifisch gegen H1N1/California/07/2009 (Ca09) im Bezug auf deren Epitope, V-Gen Verwendung, Entwicklung und assoziierten Effektorfunktionen. Für diesen Zweck haben wir, mit Hilfe einer Selektion von Antikörper deren HA-Bindung via Induzierung von viralen Mutationen kartographiert wurde, eine blocking-of-binding (BoB) Methode etabliert. Diese konnte quantitative Aussagen über die Epitopverteilung von Antikörpern der gerichteten Immunantwort im humanen Serum, von mehreren Donoren, über mehrere Jahre, gegen HA liefern. Zudem konnten wir zeigen, dass in zwei Sa/Sb-dominierten Immunantworten ein großer Teil der anti- HA Kopf Antikörper konvergent das VH2-70 Gen verwendet und deren Entwicklung in Perspektive zu anderen anti-ha Kopf Antikörpern durch Stammbaumanalysen rekonstruieren. Zusätzlich gelang es uns einen neuen Bereich des HA Stammes, den Membran-proximalen externen Bereich (MPER) zu beschreiben, sowie die funktional von anderen anti-stamm Antikörpern abweichende assoziierte Antikörperklasse in mehreren weiteren Donoren nachzuweisen. Zusammenfassend bietet diese Studie neue Erkenntnisse im Bereich der anti- HA Kopf Antikörperimmunantwort und potentiell wertvolle Beiträge zur zukünftigen Konstruktion einer effektiven universellen anti-ha Immunantwort durch die Identifizierung einer neuen funktional-divergenten Klasse von anti-ha Stamm Antikörpern. 10