Biosensoren zur Qualitätssicherung in der Lebensmittelproduktion

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1 Biosensoren zur Qualitätssicherung in der Lebensmittelproduktion Erwin Märtlbauer Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch Tierärztliche Fakultät

2 Qualität und Sicherheit von Lebensmitteln Inhaltsstoffe Allergene Zusatzstoffe Rückstände Starterkulturen Kontaminanten Reifungskulturen Path. Mikroorg. Verderbserreger Hygieneparameter

3 Beispiel: Mikrobiologische Qualitäts- und Sicherheitsparameter Erzeugnis Rohmilch (Erzeugerbetrieb) Keimzahl E. coli Enterobact. Staph. Koag.pos. Staph. Toxine Hämolysier. Strepto. L. mono. Salmonellen E. sakazakii Krankheitserreger, Toxine Vorzugsmilch Pasteurisierte Milch Käse aus wärmebehandelter Milch Käse aus Rohmilch () 1 Käse aus Milch, wärmebehandelt unter Past. Temperatur () 1 Käse, gereift, aus wärmebehandelter Milch () 1 Frischkäse aus wärmebehandelter Milch () 1 Butter / Sahne aus Rohmilch oder wärmebehandelter Milch, unter Past. Temperatur Milch- Molkenpulver () 1 Speiseeis Getrocknete Säuglingsnahrung und Nahrung für best. medizin. Zwecke () 2 () 2

4 Analytische Möglichkeiten Immunchemische Methoden ELISA Schnellmethoden Konventionelle Methoden Kontrollmaßnahmen Qualität Sicherheit Real time PCR PCR Sonden/Arrays Molekularbiologische Methoden

5 Biosensor (IUPAC Definition) Biologischer Rezeptor direkt verbunden mit Physischem Transducer Reversibles Signal Ein-aus Reaktion Wiederholte Messung Kompakt, integriert, klein Probe Biol. Rezeptor Transducer Signalverarbeitung Ergebnis

6 Biosensor: Biologische Rezeptoren Katalytisch Enzyme Mikroorganismen Zellen Affinitäts-basierend Antikörper Aptamer Phagenprotein Lektin Proteinrezeptor Hybridisierung DNA RNA

7 Größenvergleich: Antikörper - Aptamer Protein Da Hapten 300 Da Patel & Suri, 2000

8 Rezeptormoleküle Affinität Parameter Anwendungseinschränkungen Monoklonale Ak Rekombinante Ak Hoch sehr hoch z.b nicht-immunogene oder für den Zellstoffwechsel essentielle Substanzen Aptamere (DNA) z.b. Nukleasen Engineering/ Modifikation Chemisch nach Herstellung Molekularbiologisch während Klonierung Während der Synthese Entwicklungskosten Sehr hoch Hoch Sehr hoch Herstellung Tier/Zellkultur Mikrobiell Chem. Synthese Molekulargewicht 150 kda kda kda ph-stabilität Gut Begrenzt Sehr gut Produktionskosten Hoch Niedrig Sehr Niedrig Regenerationsfähigkeit Gut Begrenzt Sehr gut Temperatur-Stabilität Begrenzt Begrenzt sehr hoch

9 Analyte für Affinitätssensoren Kategorie Beispiel Mikroorganismen Bakterielle Toxine Mykotoxins Anabolika Antibiotika Pesticide Kontaminanten Vitamine Enzyme Proteine etc.... Listeria S. aureus Toxine Aflatoxin M1 Nortestosteron Chloramphenicol DDT, Aldrin PCB's B12, D Plasmin, Papain Casein etc. Antikörper Aptamere Phagenbindeproteine DNA/RNA-Hybrid.

10 Biosensor: Physikalische Transducer Elektrochemisch Potentiometrisch Amperometrisch etc. Optisch Absorption Fluoreszenz Lumineszenz Total internal reflection SPR etc. Piezoelektrisch Akustisch

11 Signaltransduktion: Elektrochemischer Biosensor Reference Electrode Measurement Electrode [mv] e- e -e- e- e- e e- e- - e e- - e- - - e - e- ee e- e- - e- e- - e- e- e - e - HRP HRP HRP HRP [mv] [s] HRP e - - e - e- e- e - e- e- e- e- e- e - e - HRP [s] [mv] [s]

12 Elektrochemischer Biosensor: Sensitivität 1, , Relative intensity 0,6 0,4 Extinktion (%) mv-response 0,2 20 Cloxa opt. Biosensor Cloxa ELISA Cloxa potent. Biosensor 80 0, ,001 0,01 0, Cloxacillin ng/ml

13 Elektrochemischer Biosensor: Biochips auf 16S ribosomaler RNA-Basis: AiF 230 ZN Esterase Esterase zu analysierende 16S RNA Fänger DNA PAP Chipoberfläche Bindung der gesuchten 16S RNA Markierung mit Enzymkonjugat Elektrochemische Detektion - Entwicklung eines elektrisch auslesbaren Chips für den Schnellnachweis der 16S RNA von E. coli - Lebensmitteldiagnostik sowie hygienische Prozess- und Eigenkontrolle von kmu - Kostengünstig, praktikabel und schnell Universität Bayreuth, Prof. Sprinzl Max Rubner Institut Kulmbach, Prof. Gareis

14 Optische Biosensoren: Literaturauswertung Publikationen (Verwendung kommerzieller Geräte) Ca. 90 % SPR (Biacore u.a.) Themenschwerpunkte: Biochemische Charakterisierung von Proteinen u. Antikörpern Rezeptoren Peptiden Oligonukleotiden Zuckern etc. 14 Arbeiten (1,1 %) food, agricultural, veterinary, environmental sciences (5 von 370 Publikationen über elektrochemische Sensoren) (Rich & Myszka, J. Mol. Rec., 2007)

15 Toxins Surface plasmon resonance: Prinzip u. Anwendung Antibiotics Vet. Drugs Microorg.

16 Optischer Sensor MCR-3: AiF/FEI 197 ZN DNT SMA SDA Streptomycin Cloxacillin Ampicillin Penicillin G Cefapirin Neomycin B Gentamicin Erythromycin A Tylosin Norfloxacin Tetracyclin DNT

17 Optischer Sensor: AiF/FEI 32 ZN u. 197 ZN Miniaturisierung: (Test auf Objektträger) Automatisierung: (Proben- u. Reagenzien) Parallelisierung: 13 Tests gleichzeitig Regenerierbar: 50 Messungen/Chip Testdauer: ca. 5 min Keine Probenvorbereitung TU München, Prof. Nießner LMU München, Prof. Märtlbauer

18 Optischer Sensor Enzyme Enzym 25 min Antigen Antibody Detection limit somatic antigen C. burnetii mak 2F8 ca. 2,5*10 6 KbE/ml Shigatoxin 1 mak 2H3, 13C4 5 ng/ml Shigatoxin 2 E. coli mak 1E1, 1B5 2.5 ng/ml Enterotoxin B S. aureus polykl. SchafAk 0.75 ng/ml TU München,Prof. Nießner LMU München, Prof. Märtlbauer

19 Biosensor: Probenvorbereitung Probenvorbereitung Selektiv Automatisiert Integriert

20 Probenvorbereitung: Immunoaffinity Chromatography (IAC) Immunomagnetic Separation (IMS) Extraction Loading Binding Washing Eluting Detection Pre-enrichment Binding Magnetic separation Washing/Con-centration Detection

21 Probenvorbereitung: Bio-Nano-Interfaces Herstellung von superparamagnetischen Fe-Au-Nanopartikeln Au Au Biologische Aktivierung der Nanopartikel (Immobilisierung von Antikörpern, Enzymen und Aptameren) Au Fe Au Prof. Ulber (TU KL, BioVT)

22 Bioseparation mit Antikörper-Nanopartikel-Konjugaten Sensor Bypass Biosensor Injektion Magnetfeld Puffer 1. Injektion von Antikörper-Nanopartikel-Konjugaten in das Medium 2. Anreicherung des Antigens in einem Bypass unter magnetischer Rückhaltung 3. Entfernung des Mediums durch Puffer Prof. Schünemann, (TU KL, BioVT)

23 Biosensor: Optimierung und Auswertung Anpassung des Sensors an das Lebensmittel Optimierung der Sensorausgestaltung Auswertung der Sensorrohdaten Detektoren Sensorgeometrie Rauschen Matrixeffekte Querempfindlichkeiten Rezeptoren Simulationen zur Strömungsmechanik Datenprozessierung Bereinigung Dimensionsreduktion Integration von Vorwissen Festlegung Festlegung von von Sensorcharakteristikcharakteristika Sensor- Sensoroptimierung Sensoroptimierung bereinigter M e s s w e r r tt Prof. Delgado, Dr. Benning

24 Biosensor: Optimierung

25 Biosensor: Ziel Biologischer Rezeptor direkt verbunden mit Physischem Transducer Reversibles Signal Ein-aus Reaktion Wiederholte Messung Kompakt, integriert, klein Probe +/- Vorbereitung Biol. Rezeptor Interface Transducer Signalverarbeitung Ergebnis

26 Literaturauswertung: Web of Science März 2008 Biosensor: & food: 555 & Germany: 46 (davon 3 Arbeiten nicht katalytische Sensoren) Biosensor & food USA Italien Deutschl. Japan Spanien England

27 Biosensoren in der Lebensmittelproduktion: Zukunft Microorganisms Bacterial toxins Mycotoxins Anabolics Antibiotics Pesticides Contaminants Vitamins Enzymes Proteins etc.... Poly- u. monoklonale Antikörper Arrays, Single Sensors Rekombinante AK, Aptamere, Phagenbindeproteine Probenaufbereitung (selektiv, automatisiert, integriert) Signalverarbeitung Lab on a Chip Nanostrukturen(oberflächen) Nanowires Nanolaser Fiction

28 Biosensoren in der Lebensmittelproduktion: Potential Breites Analytenspektrum Einfache und schnelle Detektion Berücksichtigung produktspezifischer Besonderheiten und Prozessabläufe Prozessintegration und Prozesskontrolle Minimierung störender Effekte Plausibilitätsüberprüfung Miniaturisierung Minimierung des analytisches Aufwandes Ersatz zeitintensiver und kostenaufwändiger Laboranalysen durch ein einheitliches System

29 Danke für Ihre Aufmerksamkeit und für die Projektförderung durch AiF/FEI und BMVg