Master-Kolloquium Kombinierte Analyse von DNA-Methylierung und Transkriptions-Profilen in verschiedenen Immunzellen
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- Hannelore Vogt
- vor 8 Jahren
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Transkript
1 Master-Kolloquium Kombinierte Analyse von DNA-Methylierung und Transkriptions-Profilen in verschiedenen Immunzellen Lorette Weidel
2 Agenda Hintergrund Aufgabenstellung Material & Methoden Ergebnisse Diskussion Ausblick Seite 2
3 DNA-Methylierung Chemische Abwandlung der Base Cytosin à innerhalb von Cytosin- Guanosin-Dinukleotiden (CpG) Seite 3
4 Auswirkung der DNA-Methylierung Methyliertes Cytosin blockieren die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren à Hemmen die Expression von Genen Seite 4
5 Aufgabenstellung Genomweite Untersuchung über das Zusammenspiel von DNA-Methylierung und Genexpression in verschiedenen Immunzellen Ziel 1. Wie verlässlich sind Hochdurchsatz-Messungen für Methylierungsunterschiede? 2. Wie oft stimmt das Transkriptionsverhalten mit dem Methylierungszustand überein? Seite 5
6 Aufgabenstellung Vorgehensweise Implementierung eines Software-Tools Einbinden der erhobenen Daten in die Datenbank BioConpages Bereitstellung über eine Weboberfläche auf der Homepage unter Seite 6
7 Verwendete Software Java (JDK 7.0) Entwicklungsumgebung Eclipse (Kepler) R Grafische Benutzeroberfläche RStudio Seite 7
8 Verwendete Chip-Technologie (Transkriptomik) Affymetrix GenChips Technologie: Array-Plattformen HG-U133 Plus 2.0 Seite 8
9 Verwendete Chip-Technologie (Methylierung) Illumina HumanMethylation BeadChips Technologie: Human- Methylation450 BeadChip Seite 9
10 Verwendete Immunzellen Toxische T-Lymphozyten (naive/memory CD8) T-Helfer-Lymphozyten (naive/memory CD4) B-Lymphozyten (naive/memory CD19) Natürliche Killerzellen (CD56) Granoluzyten (CD15) Monozyten (CD14) Quelle [2] Seite 10
11 Methoden 1. Qualitätskontrolle 2. Normalisierung 3. Berechnung statistischer Parameter (Mittelwert, Standardabweichung, minimaler/maximaler Beta- bzw. Signalwert) für die Zellen eines Typs 4. Ermittlung von hoch und niedrig exprimierten Transkripten und unterschiedlich methylierte CpG-Loci 5. Mapping der Trankriptions- und Methylierungsdaten 6. Berechnung des Abstandes für jeden CpG-Locus zum Transkriptionsstart Seite 11
12 Qualitätskontrolle und Normalisierung Alle Datensätze unterliegen einer guten Qualität Normalisierung Transkription MAS5_150 + Quantilnormalisierung Normalisierung Methylierung DASEN + Beta-Mixture-Quantil-dilation Seite 12
13 Unterschiedlich exprimierte Transkripte bzw. methylierte CpG-Loci Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelltypen vorhanden Differenzierung zwischen dem myeloiden und lymphoiden Zellreihen Expressionsänderungen umfangreicher als das Ändern der Methylierungsmuster Seite 13
14 Mapping Transkription und Methylierung Zelltypen: T-Lymphozyten und Monozyten Transkription: Signalwert ( ) Methylierung: Beta-Wert (0 1 bzw %) Werte: Gemittelte Beta- bzw. Signalwerte T-Lymphozyten Monozyten Seite 14
15 Abstand vom CpG-Locus zum TSS Zelltyp: Monozyten Hoch exprimierte Gene: Signalwert > 1000 Niedrig exprimierte Gene: Signalwert < 50 Methylierte CpG-Loci: Beta-Wert > 0,8 Demethylierte CpG-Loci: Beta-Wert < 0,2 CpG-Loci: Maximaler Abstand Bp vom TSS Seite 15
16 Abstand vom CpG-Locus zum TSS Vergleich auf Transkriptionsebene Zelltyp: Monozyten Genexpression: Signalwert < 50 ; Signalwert > 1000 Methylierung: Beta-Wert < 0,2 ; Beta-Wert > 0,8 CpG-Loci: Maximaler Abstand Bp vom TSS Hoch exprimierte Gene Upstream TSS Downstream Seite 16
17 Abstand vom CpG-Locus zum TSS Vergleich auf Transkriptionsebene Zelltyp: Monozyten Genexpression: Signalwert < 50 ; Signalwert > 1000 Methylierung: Beta-Wert < 0,2 ; Beta-Wert > 0,8 CpG-Loci: Maximaler Abstand Bp vom TSS Hoch exprimierte Gene Niedrig exprimierte Gene Upstream TSS Downstream Upstream TSS Downstream Seite 17
18 Abstand vom CpG-Locus zum TSS Vergleich auf Methylierungsebene Zelltyp: Monozyten Genexpression: Signalwert < 50 ; Signalwert > 1000 Methylierung: Beta-Wert < 0,2 ; Beta-Wert > 0,8 CpG-Loci: Maximaler Abstand Bp vom TSS Demethylierte CpG-Loci Upstream TSS Downstream Seite 18
19 Abstand vom CpG-Locus zum TSS Vergleich auf Methylierungsebene Zelltyp: Monozyten Genexpression: Signalwert < 50 ; Signalwert > 1000 Methylierung: Beta-Wert < 0,2 ; Beta-Wert > 0,8 CpG-Loci: Maximaler Abstand Bp vom TSS Demethylierte CpG-Loci Methylierte CpG-Loci Upstream TSS Downstream Upstream TSS Downstream Seite 19
20 Zellspezifische Gene Filterparameter Lymphoide Zellreihen (T-, B-, und NK-Zellen) - Niedrige Expression (Signalwert < 300) - Methylierte CpG-Loci (Beta-Wert > 0,8) Myeloide Zellreihen (Monozyten, Granoluzyten) - Hohe Expression (Signalwert > 1000) - Demethylierte CpG-Loci (Beta-Wert < 0,2) Ergebnis 24 Gene & 33 CpG-Loci Seite 20
21 Zellspezifische Gene Seite 21
22 Diskussion Wie oft stimmt das Transkriptionsverhalten mit dem Methylierungszustand überein? Übereinstimmung < 1 % (myeloiden vs. lymphoiden Zellreihen) Biologische und Technische Varianzen Hybridisierung, Amplifikation, Bisulfitumwandlung Extrahierung einer reinen Zellpopulation aus dem Blut nicht möglich Gewinnung ausreichender DNA/RNA für niedrig exprimierte Gene bzw. kleinen Zellpopulationen Seite 22
23 Diskussion Zustand der Zelle zum Zeitpunkt der Isolation SLR nicht optimal für biologische Daten Niedrige Anzahl an biologischen Replikaten (4) Keine Verlässlichkeit statistischer Testverfahren Seite 23
24 Diskussion Wie verlässlich sind Hochdurchsatz-Messungen für Methylierungsunterschiede? Übereinstimmende und widersprüchliche Methylierungsinformationen Abstand zum TSS Relevanz Abstand zum TSS Keine spezifischen Regeln für eine Abhängigkeit Fazit Methylierungsdaten als alleinige Screening-Methode nicht verlässlich Kombinierte Analyse von Genexpression und Methylierung notwendig Seite 24
25 Ausblick Analyse zwischen den Subpopulationen Beurteilung von Expression und Methylierung von Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen - kranke und gesunde Spender - Proben nach der Behandlung mit Medikamenten - Stimulation der Zellen mit Botenstoffen des Immunsystems Anzahl biologischer Replikate erhöhen Erweiterung des Software-Tools um statistische Auswertungsmethoden Seite 25
26 Quellen [1] ILLUMINA: Illumina iscan Workshop. 0workshop%20hku%202012_11_7.pdf Online: 08. März 2014 [2] KOKATJUHHA J.: Identizierung von Genexpressions-Netzwerken in unterschiedlichen immunologischen Zuständen. Freie Universität Berlin, Bachelorarbeit, 2013 Seite 26
27 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Lorette Weidel
Sascha Johannes. 16. Juli 2014
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