INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS. Seite INHALTSVERZEICHNIS... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...VI I. EINLEITUNG...1 II. MATERIAL UND METHODEN...

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1 INHALTSVERZEICHNIS Seite INHALTSVERZEICHNIS... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...VI I. EINLEITUNG...1 II. MATERIAL UND METHODEN Bakterienstämme und Plasmide Kultivierungsbedingungen Nährmedien und Zusätze für Bakterien Nährmedien und Zusätze für Hefen (Stratagene GmbH, Heidelberg) Anzucht und Zellernte Stammhaltung Reinheitskontrolle Molekulargenetische Arbeiten Isolierung von DNA Mikroplasmidpräparation (nach Akada, 1994) Minipräparation von Plasmid-DNA (verändert nach Sambrook et al., 1989) Präparative Plasmidisolation Plasmidisolation mittels QIAprep Spin Säulen (QIAGEN GmbH, Hilden) Plasmidpräparation mittels Anionen-Austauscher-Säulen (QIAGEN GmbH, Hilden) Standard-DNA-Techniken Agarose-Gelelektrophorese DNA-Größenstandards DNA-Konzentrationsbestimmung Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen Reinigung und Konzentrierung von DNA durch Phenol-Extraktion und Fällung Reinigung von DNA durch Mikrodialyse Reinigung und Konzentrierung von DNA mittels QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, Hilden) Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen mittels QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden) Dephosphorylierung von Vektor-DNA Ligation von DNA-Fragmenten Ligation von DNA mit dem Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) Transformation nach der CaCl 2 -Methode Selektion rekombinanter E. coli-klone Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Auswahl der Primer Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...27 I

2 Reinigung von PCR-Produkten DNA-Sequenzierung Sequenzierung mit dem SequiTherm EXCEL II Long-Read DNA Sequencing Kit-ALF [Epicentre Technologies, Madison (USA)] Sequenzierung unter Verwendung des drhodamine Termination Cycle Sequencing-Kits (Perkin- Elmer, Weiterstadt) am ABI377 Vers Sequenzierung von Plasmid-DNA unter Verwendung des AutoRead Sequencing Kits (Pharmacia & Upjohn Diagnostica GmbH & Co. KG, Freiburg) Das Sequenziergel Auswertung von Sequenzdaten Versuche zum Zellwachstums Wachstumsversuche in Flüssigmedien Das Klett-Summerson-Colorimeter [Klett MFG Co., New York (USA)] Zellanzucht von R. metallidurans-stämmen bei Wachstumsversuchen Ermittlung der Minimalen Inhibitor Konzentration (MIC) von Schwermetallsalzen Enzymologische Methoden Untersuchungen zur Topologie und zur Lokalisation der Komponenten des Czc-Efflux-Komplexes mittels Translationsfusionen mit Reporterproteinen unter Kontrolle des T7-Promotors (nach Rensing et al., 1997a) Zellanzucht von E. coli-stämmen für Enzymtests Bestimmung der β-galaktosidase-aktivität von Fusionsproteinen permeabilisierter Zellen (verändert nach Miller, 1972; Ullmann, 1984) Bestimmung der Alkalischen-Phosphatase-Aktivität von Fusionsproteinen permeabilisierter Zellen (verändert nach Manoil, 1991) Proteinchemische Methoden Analytische T7-Expression und radioaktive Markierung von Proteinen mit [ 35 S]-Methionin (Tabor & Richardson, 1985; Tabor, 1990) Fraktionierung ganzer Zellen in ihre Kompartimente zur Untersuchung der Lokalisation der radioaktiv markierten Komponenten des Czc-Efflux-Komplexes T7-Expression und radioaktive Markierung der Proteine im präparativen Maßstab (Tabor & Richardson, 1985; Tabor, 1990) Präparation der Periplasma-Fraktion (in Anlehnung an The QIAexpressionist; QIAGEN GmbH, Hilden) Ultraschallaufschluß und Präparation der Cytoplasma-Fraktion und der unlöslichen Protein- Fraktion (in Anlehnung an The QIAexpressionist; QIAGEN GmbH, Hilden) Präparation der Membranen und isopyknische Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation zur Trennung von Cytoplasmamembran und Äußerer Membran (verändert nach de Maagd & Lugtenberg, 1986; Osborn et al., 1972; Ishidate et al., 1986) Präparation von nativen Membranprotein-Komplexen für die Blue Native Gradienten-PAGE (verändert nach Schägger & von Jagow, 1991) Zellernte, Zellaufschluß und Präparation der Membran-Fraktion Solubilisierung der Proteine der Membran-Fraktion Analytisches In vivo-crosslinking von radioaktiv markierten bzw. nichtmarkierten Komponenten des Czc-Efflux-Komplexes mit Formaldehyd (verändert nach Prossnitz et al., 1988 ; Skare et al., 1993) Zellanzucht von E. coli und R. metallidurans für In vivo-crosslinking Crosslinking in intakten Zellen...41 II

3 6.5. Reinigung von CzcB-Strep-tag II -haltigen Proteinkomplexen über ein kombiniertes T7-Expressionsund Strep-tag II -Reinigungssystem Anzucht und Ernte der E. coli-zellen In vivo-crosslinking und Solubilisierung der Proteine aus präparierten Membranen Affinitätschromatographie an StrepTactin -Sepharose (Institut für Bioanalytik GmbH, Göttingen) Proteinbestimmung von Membranproteinen (verändert nach Lowry et al., 1951) Chloroform-Methanol-Fällung (Wessel & Flügge, 1984) TCA-Fällung von Proteinen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Denaturierende PAGE Native PAGE Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf eine Membran (Westernblot) Proteintransfer mit dem Semi-dry-Blot (verändert nach Kyhse-Andersen, 1984) Transfer von Proteinen mit dem Tank-Blot Strep-tag II Detektionssystem (Institut für Bioanalytik GmbH, Göttingen) Proteinnachweis durch Immunopräzipitation auf PVDF-Membranen (Blake et al., 1984) Färbung und Trocknung von PAA-Gelen Coomassie-Färbung von Proteinen (verändert nach Weber & Osborn, 1969) Silberfärbung (Rabilloud et al., 1988; Nesterenko et al., 1994) Spezifischer Nachweis von Proteinen mittels Aktivitäts-Färbung in Nativen PAA-Gelen Trocknung von PAA-Gelen Autoradiographie mit PAA-Gelen Direkte Autoradiographie Fluorographie (Szintillationsautographie) mit PPO (Bonner & Laskey, 1974) Das Sos Recruitment-System, ein alternatives Yeast Two-Hybrid-System (CytoTrap TM ; Stratagene GmbH, Heidelberg) Herstellung kompetenter S. cerevisiae cdc25h-zellen Transformation von S. cerevisiae cdc25h und Testung der Protein-Interaktion...54 III. ERGEBNISSE Untersuchungen zu Membran-Topologie und subzellulärer Lokalisation der Komponenten des Czc-Efflux- Komplexes mittels Translationsfusionen mit Reporterproteinen Entwicklung verschiedener Reporterplasmid-Sets für den Einsatz in Topologie-Untersuchungen Das Reporterplasmid-Set 1 korrespondierende blam-, lacz- und phoa-fusionsvektoren auf Basis von pbr Korrespondierende blam- und phoa-reporterplasmide des Sets 2 als Resultat der Weiterentwicklung von Set Set 3 - korrespondierende lacz- und phoa-reporterplasmide auf Basis von pgem -T Easy [Promega, Madison (USA)] Große Bereiche von CzcC liegen im Periplasma Vorhersagen zur Topologie von CzcC und Auswahl der Fusionspositionen Subzelluläre Sensoren mit komplementären Eigenschaften? CzcC-Hybridproteine gleicher Position haben ähnlich hohe Aktivitäten Das Expressionsniveau der CzcC-Fusionen ist recht unterschiedlich...64 III

4 Die CzcC - PhoA-Fusionsproteine sind im Nativen Gel enzymatisch aktiv CzcB erstreckt sich über den periplasmatischen Raum Vorhersagen zur Struktur von CzcB und Auswahl der Fusionspositionen Lassen die Aktivitäten der CzcB-Hybridproteine auf periplasmatische Lokalisation schließen? Die CzcB-Hybridproteine werden nicht gleichmäßig exprimiert bzw. sind unterschiedlich stabil Die beiden großen hydrophilen Domänen der zentralen Pumpe CzcA liegen auf der periplasmatischen Seite der Membran Ein Dutzend TMS? Vorhersagen zur Struktur von CzcA und Auswahl der Fusionspositionen Die Termini von CzcA liegen im Cytoplasma, die großen hydrophilen Domänen im Periplasma Fast alle CzcA - PhoA-Fusionsproteine sind im Westernblot nachweisbar, wobei kürzere meist besser exprimiert werden und stabiler sind als längere Die T7-RNA-Polymerase bewirkt eine deutliche Steigerung der Enzymaktivität, der T7-Promotor von pecd623 ist also intakt Haben durch PCR generierte, zufällige Mutationen entscheidenden Einfluß auf Enzymaktivität und Expression der Fusionen? Aussagen zur Anfälligkeit der Topologie-Untersuchungen gegenüber Punktmutationen im charakterisierten Protein Die Sequenz von czca weicht von der unter EMBL X98451 veröffentlichten ab Untersuchungen zur Lokalisation der Komponenten des Czc-Efflux-Komplexes nach Fraktionierung von Zellen in die Kompartimente CzcC und CzcB sind zumindest an Membranen assoziiert - Fraktionierung von E. coli-zellen mit den Komponenten CzcC bzw. CzcB Trennung der Membranen von E. coli-zellen mit den Proteinen CzcC bzw. CzcB mittels isopyknischer Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation CzcC reichert sich in Membran-Fraktionen ungewöhnlich hoher Dichte an Auch CzcB ist in Membran-Fraktionen ungewöhnlich hoher Dichte angereichert Wie interagieren die Komponenten des Czc-Efflux-Komplexes? Das CytoTrap TM Yeast Two-Hybrid-System (Stratagene GmbH, Heidelberg) Im Yeast Two-Hybrid-Assay in der Hefemutante S. cerevisiae cdc25h sind keine Interaktionen der Efflux-Komponenten nachweisbar Die hsos-fusionen werden in S. cerevisiae cdc25h nicht exprimiert Blue Native PAGE Versuch der nativen Isolierung des kompletten Czc-Efflux-Komplexes Die Komponenten CzcB und CzcA sind im Solubilisat Nur die Einzelkomponenten CzcB und CzcA sind nach Blue Native PAGE mit Antikörpern detektierbar Ein für CzcB spezifischer Proteinkomplex ist nach In vivo-crosslinking mit Formaldehyd nachweisbar Bei In vivo-crosslinking mit 0.1 % (v/v) Formaldehyd ist ein ca. 220 kda großer CzcB-Strep-tag II - Komplex nachweisbar Die Crosslinking-Verknüpfung kann durch Erhitzen aufgelöst werden Der gereinigte CzcB-Strep-tag II -Komplex entspricht wahrscheinlich einem Homooligomer...88 IV. DISKUSSION Targeting und Translokation von Proteinen in Bakterien Reportergen-Fusionen zur Aufklärung der Membran-Topologie und subzellulären Lokalisation von Proteinen Merkmale der Reporterplasmid-Sets und Nachweis der Funktion...97 IV

5 4. CzcC, die OMF-Komponente des CzcCBA-Efflux-Komplexes Das MFP CzcB als Untereinheit im CzcCBA-Efflux-Komplex Der RND-Transporter CzcA - zentrale Komponente im CzcCBA-Efflux-System Der CzcCBA-Membranprotein-Komplex - ein Drei-Komponenten-Efflux-System V. ZUSAMMENFASSUNG VI. LITERATUR V

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A Adenin Abb. Abbildung ABC-Transporter ATP-Binding Cassette Transporter AK Antikörper Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat ATPase Adenosintriphosphatase bp Basenpaare BPB Bromphenolblau BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Cytosin C-Terminus Carboxyterminus, carboxylendständiger AS-Rest ca. circa Cam Chloramphenicol CDF Cation Diffusion Facilitator (Familie von Transportproteinen) CP Cytoplasma CPM Cytoplasmamembran CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid CY5 Fluoresceinmarkierung d. h. das heißt DMSO Dimethylsulfoxid DMF Dimethylformamid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease ddntp didesoxy-nukleosidtriphosphat dntp desoxy-nukleosidtriphosphat DRR Downstream Regulatory Region (Regulatorgen-Region, stromabwärts) DSG Disuccinimidylglutarat DSP Dithiobis-(succinimidylpropionat) (auch Lomant s Reagenz genannt) ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat F Fluoresceinmarkierung G Guanin VI

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS GSP GTP h H 2 O bidest. I max IPTG Kan kb kda KE LB LiOAc MCS MFP MIC min mrna Mtt N-Terminus NA NB Nr. OD OEP OM OMF ONPG PAA PAGE PCR PEG PEP PMF PMSF PNPP PP PPO PVDF General Secretory Pathway (genereller Sekretionsweg für Proteine) Guanosintriphosphat Stunde doppelt destilliert (Reinstwasser) maximale Stromstärke Isopropyl--D-thiogalactopyranosid Kanamycin Kilobasenpaare Kilodalton Klett-Einheiten Luria-Bertani Medium Lithiumacetat Multi Cloning Site Membran Fusion Protein (Proteinfamilie) Minimale Inhibitor Konzentration Minute messengerrna (Boten-Ribonukleinsäure) Membrane Targeting and Translocation-System Aminoterminus, aminoendständiger AS-Rest Nähragar Nährbouillon Nummer Optische Dichte Outer Membrane Efflux Proteins (Proteinfamilie) Outer Membrane (äußere Membran) Outer Membrane Factor (Proteinfamilie) ortho-nitrophenyl--d-galactopyranosid Polyacrylamid Polyacrylamid-Gelelektrophorese Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) Polyethylenglykol Periplasmic Efflux Proteins (Proteinfamilie) Protonen Motive Force (protonenmotorische Kraft) Phenylmethylsulfonylfluorid (Protease-Inhibitor) para-nitrophenylphosphat Periplasma 2,5-Diphenyloxazol (Szintillator) Polyvinylidendifluorid (Membran) VII

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS RBS RGR RNA RNase RND rpm rpr RT s SA SDS SGR spez. SRP SRS ST T Tab. TAE TAT TBE TC-System TCA TE TEMED Tet TEV TG TMS Tris U U max -UL upr URR UV Vers. VIS Ribosomenbindestelle Regulatorgen-Region Ribonukleinsäure Ribonuklease Resistance, Nodulation, Cell Division (Proteinfamilie) Rotations Per Minute (Umdrehungen pro Minute) M 13 Reverse Primer Raumtemperatur Sekunde Signal Anchor (topogenes Signal) Natriumdodecylsulfat Strukturgen-Region spezifisch Signal Recognition Particle (Signalerkennungspartikel) Sos Recruitment-System (alternatives Yeast Two-Hybrid-System) Stop Transfer (topogenes Signal) Thymin Tabelle Tris-Acetat/EDTA Twin-Arginine Translocation-System (Weg des Proteinexports) Tris-Borat/EDTA Transporter Classification-System (Klassifizierung von Transportern) Trichloressigsäure Tris-HCl/EDTA N, N, N, N -Tetramethylethylendiamin Tetracyclin Tobacco Etch Virus Trockengewicht transmembranes Segment Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan Unit (Einheit der Enzymaktivität) maximale Spannung ohne Uracil und Leucin M 13 Universal Primer Upstream Regulatory Region (Regulatorgen-Region, stromaufwärts) ultraviolett Version (des Computerprogramms) Visible (sichtbares Licht) VIII

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Vol. Volumen v/v Volumen pro Volumen Wt Wildtyp X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranosid X-P 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (auch BCIP genannt) z. B. zum Beispiel Ein- und Drei-Buchstaben-Code der Aminosäuren A Ala Alanin M Met Methionin C Cys Cystein N Asn Asparagin D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin E Glu Glutaminsäure Q Gln Glutamin F Phe Phenylalanin R Arg Arginin G Gly Glycin S Ser Serin H His Histidin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin IX