Qualitätskontrolle von Lebensmitteln: Was esse ich wirklich?

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1 Qualitätskontrolle von Lebensmitteln: Was esse ich wirklich? Im Unterricht habt ihr bereits einige Methoden und Vorgehensweisen der Molekularbiologie kennengelernt. Aber wo finden diese Methoden im täglichen Leben Anwendung? Ein Beispiel hierfür ist die Lebensmittelkontrolle, denn ihr als Verbraucher stellt euch vielleicht die Frage, was genau ist eigentlich in meiner Salami und ist meine Putenwurst wirklich nur Pute? In manchen Religionen ist z.b. der Verzehr von Schweinefleisch nicht erlaubt aber ist in der Geflügelwurst wirklich nur Geflügel? Zum Nachweis einzelner Fleischsorten verwendet man DNA-basierte Verfahren. Beispielsweise werden durch PCR artspezifische Gene nachgewiesen werden. So können die religiösen, gesundheitlichen und ethischen Ansprüche der Verbraucher, also auch von euch, gewährleistet werden. Aber wie funktioniert das genau? Alle pflanzlichen und tierischen Organismen besitzen Mitochondrien, die Kraftwerke der Zellen. Diese sind durch Endosymbiose entstanden und besitzen daher genau wie Prokaryoten ein eigenes, ringförmiges Genom. Besonders interessant wird das Mitochondriengenom für uns durch folgende Eigenschaften: Da jede Zelle viele Mitochondrien enthält ist die Kopienzahl des Mitochondriengenoms sehr hoch. Da alle Mitochondrien einer Zelle dasselbe Genom enthalten, gibt es nur homozygote Merkmale. Das Mitochondriengenom umfasst bei Säugern nur ca bp und die DNA- Abschnitte sind hochkonserviert. Das bedeutet, dass sie sich bei unterschiedlichen Individuen einer Art kaum unterscheiden. Sie können daher genutzt werden, um eine Fleischprobe einer Art zuzuordnen; also zu entscheiden, ob das Fleisch von einem Schwein, Rind oder einer Pute stammt. Es ist hingegen mit DNA-Abschnitten aus dem Mitochondriengenom nicht möglich, herauszufinden, ob das Fleisch von einem bestimmten Schwein stammt. Um jetzt also nachzuweisen, ob eine Fleischprobe bspw. Schweinefleisch enthält, verwendet man in der PCR Schweine-spezifische Primer für mitochondriale (mt) DNA. Diese Primer können nur binden, wenn in der Fleischprobe Schweinefleisch, und damit auch schweinespezifische Mitochondrien DNA, enthalten ist. Dies ermöglicht eine erfolgreiche Vervielfältigung des gewünschten DNA-Abschnitts. Bevor es losgeht schau dir die Tipps auf Seite 7 an! 1

2 Teil 1: DNA-Isolation aus Fleischproben Bildet Forscherteams aus jeweils drei Personen! Jeder Einzelne von euch erhält eine Fleischprobe. Innerhalb des Teams sind die Fleischproben gleich. Ihr habt als Forscherteam die Aufgabe, den Inhalt der Probe auf Pute, Rind und Schwein zu untersuchen, d.h. in jedem Team werden drei PCR Reaktionen durchgeführt. Einigt euch im Voraus innerhalb des Teams, welcher Forscher die Probe auf welche Spezies testet! Schritt 1: Probe mörsern Zerstampfe (mörsert) kurz die Fleischprobe im Eppi (= Reaktionsgefäß) mit einem Mikropistill. Schritt 2: Verdau mit Proteinase K Inkubiere die gemörserte Fleisch-Probe in 350 µl Lyse-Puffer (= Fleisch-Puffer mit Proteinase K) für mindestens 15 min bei 55 C! Schnippse die Eppis dabei vorsichtig alle 5 min mehrmals an, um den Inhalt zu durchmischen. Der Lysepuffer enthält das Detergenz SDS (Sodium-Dodecyl-Sulfat), das die Zellen aufschließt und zum Teil bereits Proteine entfaltet (denaturiert). Das Enzym Proteinase K verdaut die Proteine aus dem Gewebe und den Zellen. Warum ist das Einhalten der richtigen Temperatur wichtig? Skizziere die Auflösung der Plasmamembran durch SDS! Inkubiere die Probe für 10 min auf Eis. 2

3 Schritt 3: Proteinfällung Füge nun 150 µl gesättigte NaCl-Lösung (Kochsalz-Lösung) hinzu und invertiere (vorsichtig umdrehen) die Eppis. Hier findet ein Aussalzen der Proteine statt. NaCl zerstört die Wasserstoffbrücken- Bindungen innerhalb der Proteine. Die Proteine denaturieren dadurch und fallen aus. Inkubiere die Probe wieder für 5 min auf Eis. Zentrifugiere für 10 min bei xg (stecke die Eppis mit der Lasche nach außen in die dafür vorgesehenen Löcher, dann wißt ihr an welcher Seite das Pellet nach der Zentrifugation sein sollte). Halte ein neues, beschriftetes Eppi bereit! Pellet Überstand Alle unlöslichen Zellbestandteile werden als Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes gesammelt. Alle löslichen Zellbestandteile wie die DNA befinden sich nach dem Zentrifugieren im Überstand. Überführe den Überstand (ca. 500 µl) in dein neues Eppi. Schritt 4: RNA-Verdau Füge 4 µl RNase A hinzu und inkubiere deine Probe für 15 min bei 37 C! Schritt 5: DNA-Fällung RNaseA ist ein Enzym, das die RNA verdaut. Warum ist es wichtig, die RNA vor der PCR zu entfernen? Stelle Vermutungen an. Gib 350 µl Isopropanol zu dem Reaktionsansatz. Wende das Eppi fünfmal! Isopropanol macht die Lösung unpolarer, sodass sich die Mitochondrien- DNA nicht mehr lösen kann und ausfällt. Die Fällung der DNA funktioniert bei niedriger Temperatur (auf Eis) besser. Zentrifugiere bei xg für 20 min! Gieße den Überstand sehr vorsichtig ab, um das Pellet nicht zu verlieren! Tupfe anschließend die letzte Flüssigkeit mit umgedrehtem Eppi auf einem sauberen, saugfähigen Papier ab! 3

4 Schritt 6: Waschen der DNA Wasche dein DNA-Pellet mit 500 µl 70%-igen Ethanol! Zentrifugiere für 5 min bei xg. Durch das 70%-ige Ethanol kann die DNA nicht in Lösung gehen. Die 30% Wasser waschen Salze und andere Substanzen aus dem Pellet. Gieße erneut den Überstand sehr vorsichtig wie oben beschrieben ab. Trockne dein Pellet bei 55 C auf dem Heizblock, bis keine Flüssigkeit mehr im Eppi vorhanden ist! Löse die DNA in 100 µl UV-Wasser! UV-Wasser ist mit UV-Licht (UV = ultraviolett) bestrahltes Wasser. Welchen Effekt erzielt man mit der UV-Bestrahlung von Wasser? Teil 2: Speziesspezifische PCR Bei der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR = polymerase-chain-reaction) wird das von den Primern flankierte DNA-Stück kopiert. Bei richtiger Durchführung und je nach Zusammensetzung der Fleischprobe wird jeder einzelne aus einem Forscherteam entweder kein oder ein DNA-Stück vervielfältigen. 4

5 Schritt 7: Ansetzen des PCR-Reaktionsgemisches Ihr erhaltet den Mastermix in speziellen Reaktionsgefäßen ( PCR-tubes ). Pipettiere anschließend 2 µl deiner isolierten DNA dazu. Da wir mit sehr kleinen Mengen arbeiten, bitte sehr sorgfältig pipettieren. UV-Wasser 35 µl Master-Mix PCR-Puffer mit MgCl 2 5 µl Der Inkubationspuffer schafft eine angenehme Umgebung für die Taq-Polymerase. dntp-mix 5 µl Der dntp-mix enthält alle Einzelbausteine, also die vier Nukleosidtriphosphate, die für die DNA- Synthese notwendig sind. Primer-Mix* (Pute, Rind oder Schwein) 2 µl Der Primer-Mix enthält zwei Primer (kurze einzelsträngige DNA-Stücke), die der Taq- Polymerase beim Kopieren des gewünschten DNA- Abschnitts als Startpunkt dienen. Taq-Polymerase 1 µl Die hitzestabile Taq-Polymerase ist das Enzym, das am Primer ansetzt und entsprechend der Vorlage einen neuen DNA-Strang synthetisiert. DNA in Lösung 2 µl Gesamtvolumen 50 µl *Herkunft der Primer: KOTOWICZ et al. 2007, RODRIGUEZ et al. 2003, LÓPEZ-ANDREO et al Stellt eure PCR-tubes nun in die PCR-Maschine. Wie lange könnt ihr jetzt Pause machen? PCR Programm: Schritt Temperatur Zeit Bemerkung 35 Zyklen Denaturierung 95 C Denaturierung 10 min 95 C 30 sec Durch die lange Zeit der Denaturierung soll sichergestellt werden, dass die Ziel-DNA einzelsträngig ist. Die doppelsträngige DNA wird einzelsträngig, weil die Wasserstoffbrückenbindungen gespalten werden. Annealing 62 C 30 sec Bei dieser Temperatur lagern sich die Primer an. Elongation 72 C 45 sec Die Taq-Polymerase wird aktiv und synthetisiert einen neuen DNA-Strang anhand des vorliegenden Einzel-strangs. Das 3 OH-Ende eines Primers dient als Start. Elongation 72 C 5 min Die endgültige Elongation der PCR-Produkte soll durch diesen Schritt sichergestellt werden. 5

6 Teil 3: Agarosegelelektrophorese Durch die Agarosegelelektrophorese kann man DNA-Fragmente der Größe nach auftrennen. Schritt 8: Vorbereitung des 2%-igen Agarosegel Für ein Gel werden 2 g Agarose in ein Gefäß gegeben und mit 1x TBE-Puffer auf 100 ml aufgefüllt und gekocht. Damit nichts anbrennt, wird die Lösung mit einem Rührfisch gerührt. Wenn ein Mikrowellenofen vorhanden ist, kann die Agarose auch darin aufgekocht werden. Dann keinen Rührfisch verwenden! Agarose kocht leicht über während des Kochens unbedingt beobachten! Die Lösung leicht abkühlen lassen, ins Gelbett füllen, danach den Kamm einstecken. Vorsicht! Das Gefäß und die Agarose sind sehr heiß! Schutzhandschuh tragen! Nach dem Erstarren (ca. 30 min später) den Kamm herauslösen und das Gel mit 1x TBE- Puffer übergießen, bis es vollkommen bedeckt ist. Schritt 9: Beladen des Gel Mit Hilfe eines Kammes werden Taschen im Gel hinterlassen, in die ihr später eure DNA einfüllen könnt. Mischt 20 µl des PCR-Produkts in einem neuen Eppi mit 5 µl Auftragspuffer. Der Auftragspuffer enthält: - Glycerin zum Beschweren der Lösung, die sich dann leichter in die Geltaschen pipettieren lässt. - Einen blauen Farbstoff (Bromphenolblau), der das Platzieren der Probe in die Geltasche erleichtert. WICHTIG: Dieser Farbstoff färbt nicht die DNA! Nun pipettiert jeder von euch seine 25 µl Probe in eine der Geltaschen. In die erste Tasche wird ein Marker (Größenstandard) pipettiert, der uns nachher dabei hilft unseren Fragmenten eine Größe zuzuordnen! WICHTIG: Die Reihenfolge des Probenauftrags notieren! Schritt 10: Starten der Gelelektrophorese Zum Starten der Gelelektrophorese wird eine Spannung von 100 Volt angelegt. Nach min nehmen wir das Gel aus dem Puffer und legen es auf den Dark- Reader/UV-Tisch. So können wir die DNA-Banden sichtbar machen. SYBR-Gold oder Ethidiumbromid sind bei Tageslicht unsichtbare Farbstoffe, die sich an die DNA setzten (sie anfärben) und bei Schwarzlicht/UV-Licht fluoreszieren. 6

7 Ergebnisse: Beschreibt in einem Satz, was ihr aus euren Ergebnissen folgern könnt. Vergleicht eure Ergebnisse mit denen der anderen Teams. Was könnt ihr folgern, wenn in einer Fleischprobe Banden mit verschiedenen Primerpaaren auftreten? Wenn in keiner eurer PCRs eine Bande auftritt, woran könnte das liegen? Wie würdet ihr eine Fehlersuche machen? Ein paar Tipps: Wichtig: Beschriftet eure Eppis (Reaktionsgefäße) immer gut, sonst findet ihr eure Probe nicht mehr! Zu den Pipetten: 1000er Pipette (blau): blaue Spitzen benutzen und nur µl pipettieren 200er Pipette (gelb): gelbe Pipettenspitze und nur µl pipettieren 20er Pipette (gelb): gelbe Pipettenspitze und nur 2-20 µl pipettieren Legende zum Skript: Arbeitsanweisung Zusatzinformation Zusatzfragen Primer: KOTOWICZ, M., ADAMCZYK, E., BANIA, J. (2007): Application of a duplex-pcr for detection of cows' milk in goats' milk. Ann Agric Environ Med 14 (2): LÓPEZ-ANDREO, M., LUGO, L., GARRIDO-PERTIERRA, A., PRIETO, M.I., PUYET, A. (2005): Identification and quantitation of species in complex DNA mixtures by real-time polymerase chain reaction. Anal Biochem 339 (1): RODRIGUEZ, M.A., GARCIA, T., GONZALEZ, I., ASENSIO, L., MAYORAL, B., LOPEZ-CALLEJA, I., HERNANDEZ, P.E., MARTIN, R. (2003): Identification of goose, mule duck, chicken, turkey, and swine in foie gras by species-specific polymerase chain reaction. J Agric Food Chem 51 (6):

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