6. Übung. a) Meiose. b) Reverse TranskripEon. 1) λ- Phage f. c) Prokaryont. d) KonjugaEon. e) Mitochondrien. 4) A. thaliana a, e, g.

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1 6. Übung 1) Ordnen Sie die unten gelisteten Modellsysteme den Begriffen zu. Anmerkung: Mehrfachzuordnungen sind möglich und einer der Begriffe passt zu keinem der genannten Modellsysteme a) Meiose 1) λ- Phage f 2) E. coli c, d 3) S. cerevisiae a, e, g 4) A. thaliana a, e, g b passt gar nicht b) Reverse TranskripEon c) Prokaryont d) KonjugaEon e) Mitochondrien f) Temperenz g) Intron

2 2) Definieren Sie die folgenden Begriffe: Auxotrophie = WuchsstoYedür[igkeit horizontaler Gentransfer = Übertragung von DNA über Artgrenzen hinweg tra- Gene = transfer- Gene, die Bakterien befähigen, als Donor bei der KonjugaEon zu fungieren (Bsp.: Fähigkeit zur Ausbildung eines Sex- Pilus) Hfr = Durch IntegraEon eines F- Plasmids ins bakterielle Genom, kommt es bei der KonjugaEon zur Übertragung chromosomaler Abschni`e und im Rezipienten- Bakterium somit häufig zu RekombinaEon durch doppeltes crossover ( high frequency of recombinaeon ) F'- Plasmid = ein F- Plasmid, das durch ungenaues Heraus- Rekombinieren (Excision) aus dem Nukleoid eines Hfr Bakteriums einen Abschni` genomischer DNA erhalten hat merozygot = teilweise diploid Exogenot = genomische DNA vom Donor, die bei KonjugaEon vom Rezipient aufgenommen wurde

3 3) Nennen Sie Unterschiede und Gemeinsamkeit von: KonjugaEon TransdukEon TransformaEon KonjugaEon = Paarung von Bakterien und Übertragung von ErbinformaEon über eine Zytoplasmabrücke von einer Spender- in eine Empfängerzelle; TransdukEon = Gentransfer in Bakterien mi`els Viren/Phagen; TransformaEon = Übertragung von nakter DNA in Bakterien ohne Hilfe von Spenderbakterien oder Phagen (2. Bedeutung: Entartung von höheren eukaryoneschen Zellen hin zu ungehemmtem Teilungsverhalten» Krebs); Gemeinsamkeit: Gentransfer in Bakterien 4) Welche klassischen Möglichkeiten der GenkarEerung bei Bakterien kennen Sie? BesEmmung der Frequenz, mit der Gene/Allele zusammen übertragen werden bei: - KonjugaEon (die nach unterschiedlichen Zeiten abgebrochen wird) - TransdukEon

4 5) Thema: Klonieren a) Welche Eigenscha[en sollte ein Plasmid (= Vektor) stets haben, damit sich bequem DNA- Fragmente einfügen lassen, und damit es sich nach Einschleusen in E. coli nicht verloren geht sondern mit den Zellen vervielfälegt wird? mul=ple cloning site (MCS) = polylinker bakteriellen ReplikaEonsursprung = origin of replica=on ini=a=on (ori) SelekEonsmarker, typischerweise AnEbioEkaresistenz wie z.b. Gen für β- Lactamase, die Resistenz gegen Penicillin (und deren Derivaten wie Ampicillin) vermi`elt

5 b) Aus der Vorlesung wissen Sie, wie Sie dsdna sequenzspezifisch schneiden können. Aber welches Enzym kann geschni`ene dsdna- Fragmente wieder kovalent miteinander verbinden? - Recherchieren Sie! 3 OH 5 Pi DNA- Ligase 5 Pi ATP 3 OH (Pi = Phosphat) h`p://www.addgene.org Katalysemechanismus: AMP AdenylaEon (AMPylaEon)

6 Katalysemechanismus - Fortsetzung: DNA- AMP- Intermediat

7 c) Sie wollen sich eine Bibliothek von genomischer Hefe- DNA konstruieren. (Anmerkung: Dies ist eine KollekEon von Plasmiden, in die jeweils ein Stück Hefe- DNA eingefügt wurde, und die in ihrer Gesamtheit das ganze Hefe- Genom abdeckt/repräseneert.) Beschreiben Sie die hierzu notwendigen Arbeitsschri`e! Plasmid aus entsprechender E. coli- Kultur isolieren genomische DNA aus S. cerevisiae- Kultur isolieren Insert Mischung aller Insert- tragender Plasmide = Hefe- DNA- Bibliothek

8 6) Thema: GeneEsche InterakEon a) Eine temperatursensieve Mutante ist eine, die sich bei normaler Temperatur noch wildtypisch verhält, bei erhöhter (oder erniedrigter) Temperatur aber einen FunkEonsverlust aufweist. Mutagenese einer Hefekultur Modellvorstellung: Ausplaxeren & bei 23 C inkubieren Wildtyp ts- Mutante bei permissiver T * ts- Mutante bei restrikever T Sie haben eine temperatursensieve Hefemutante mit einem interessanten Phänotyp isoliert. Wie finden Sie heraus, ob es sich auch wirklich um eine EinzelmutaEon handelt? Annahme: Haploider Stamm» Kreuzung mit Wildtyp (maeng => SporulaEon)» 50% der haploiden Nachkommen zeigen wieder den gleichen Phänotyp, wenn nur ein Gen betroffen ist

9 b) Schlagen Sie einen geneeschen Screen vor, mit dem Sie herausfinden können, welches der Gene in Ihrer interessanten ts- Mutante verändert ist. (Tipp: Sie benöegen dazu die oben erstellte Hefe- DNA- Bibliothek.) IsolaEon des jeweiligen Plasmids aus Klonen, die jetzt wieder bei 36 C wachsen und Sequenzierung des hierin jeweils enthaltenen wildtypischen Gens; zur Kontrolle: Sequenzierung des entsprechenden chromosomalen Gens in der ts- Mutante und Sequenzvergleich, um MutaEon zu finden

10 Shu0le Plasmide Plasmid, das in E. coli und einer weiteren Spezies repliziert und selekeoniert werden kann. Vorteil: Klonierung (u.a. ManipulaEonen des Plasmids) können in E. coli vorgenommen werden. Ein E. coli S. cerevisiae- Shu`le Plasmid: Hefe- ReplikaEonsursprung E.coli- Resistenzmarker Hefe- Auxotrophiemarker E.coli- ReplikaEonsursprung MCS (muleple cloning site)

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