Software Kurzanleitung

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1 Software Kurzanleitung Für den Einsatz mit dem IMMUCOR MIA FORA NGS HLA Typing-Kit Nur zur In-vitro-Diagnostik Seite 1 von 18

2 Dieses Handbuch wurde für den Einsatz mit der Software FORA NGS SR erstellt Senden Sie eventuelle Fragen, Kommentare und Bestellungen weiterer Exemplare an die folgende Adresse. Autorisierter Vertreter: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A D Rodermark - Deutschland Telefon: Technischer Service Europa: IMMUCOR ist eine Handelsmarke von Immucor, Inc. MIA FORA ist eine Handelsmarke von Sirona Genomics, Inc. illumina ist eine Handelsmarke von Illumina, Inc. MiSeq ist eine Handelsmarke von Illumina, Inc. Seite 2 von 18

3 Anwendungsbereich Das MIA FORATM NGS HLA Typing-Kit ist für die Amplifikation und Sequenzierung der HLA- Gene HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 und -DPB1 auf der Illumina NGS Sequenzierungsplattform geeignet. Die MIA FORA Software soll als Anleitung zur Bestimmung von HLA-Typen aus den mit dem MIA FORA NGS HLA Bibliotheken-Kit gewonnenen Daten dienen. Der Test soll in Labors, die im Umgang mit DNA zur Amplifikation und Sequenzierung kompetent sind, eingesetzt werden. Über diese Anleitung Diese Anleitung bietet grundlegende Anweisungen für den Einsatz der MIA FORA NGS Software SR mit folgenden Kits: MIA FORA NGS HLA Typing-Kit SR (CE-Kennzeichnung für den IVD-Einsatz nur in der Europäischen Union) Weitere Informationen finden Sie in dem Benutzerhandbuch für die MIA FORA NGS Software. Diese Anleitung ersetzt das Benutzerhandbuch nicht. Zugehörige Dokumentation Die im Folgenden angeführten Dokumente enthalten zusätzliche Informationen in Bezug auf diese Anleitung bzw. Informationen, die in dieser Anleitung als Referenz aufgeführt sind. Benutzerhandbuch MIA FORA NGS Software (LC1619) Produktbeilage MIA FORA NGS HLA Typing-Kit (LC1618CE) Nutzungsbeschränkungen Die Nutzungsbeschränkungen finden Sie in den Referenzdokumenten. Seite 3 von 18

4 Erstellen eines Projekts und Analysieren einer Probe: 1. Erstellen Sie eine Barcode-Datei der Probe (eine kommagetrennte.csv-datei für Windows) mit den Probennamen und Barcode-Zuweisungen. Geben Sie auch den Projektnamen und die Well- Positionen ein. Diese Angaben werden zur Sequenzanalyse genutzt. a. Öffnen Sie die MIA FORA Software, und navigieren Sie zur Registerkarte Projects (Projekte). Klicken Sie auf die Schaltfläche New Project (Neues Projekt) unten rechts auf dem Hauptbildschirm. b. Geben Sie den gewünschten Projektnamen, die Losnummer des MIA FORA NGS Kits, das Empfangsdatum und den Namen der durchführenden Person ein. Klicken Sie zum Laden der Barcode-Datei der Probe (.csv) auf Browse (Durchsuchen). Hinweis: Der Projektname darf nicht länger als 30 Zeichen sein. Bindestriche und Unterstriche sind zulässig. Sonderzeichen dürfen dagegen nicht verwendet werden und werden entfernt. Seite 4 von 18

5 c. Klicken Sie zum Navigieren zum Barcode-Blatt der Probe auf Next (Weiter), und klicken Sie zum Bestätigen des korrekt eingegebenen Probennamens auf Yes (Ja). d. Klicken Sie zum Erstellen eines neuen Projekts auf Finish (Beenden). 2. Weitere Informationen zur Einstellung von MiSeq Run und zur Benennung von FASTQ-Dateien mit Experiment Manager von Illumina finden Sie in Anhang A. 3. Wenn der erste Pfeil orange ist, ist das neue Projekt bereit für das Hochladen von FASTQ- Dateien. a. Klicken Sie zum Starten des FASTQ-Dateiassistenten unter Next Step (Nächster Schritt) auf die grüne Play-Schaltfläche. Seite 5 von 18

6 b. Browsen Sie zum Laden der FASTQ-Dateien. Halten Sie vor dem Auswählen beider Dateien die Taste CTRL (Strg) gedrückt. ANMERKUNG: Damit die Software die Dateien erkennen kann, müssen FASTQ- Dateinamen mit dem Projektnamen beginnen. c. Klicken Sie zum Starten des Ladevorgangs der FASTQ-Dateien auf Finish (Beenden). 4. Klicken Sie zum Auswählen eines Projekts zur Analyse und zum Überprüfen von Dateien auf Project Name (Projektname). Hinweis: In der Projektliste sind die neuesten Projekte oben angeordnet. Seite 6 von 18

7 5. Klicken Sie zum Prüfen der Qualität des Durchlaufs auf die Registerkarte Statistics (Statistiken). a. Überprüfen Sie das Tortendiagramm unter Piechart. i. Es müssen > 85 % gültige Reads vorhanden sein. Es dürfen nicht mehr als < 10 % ungültige Reads vorhanden sein. b. Wählen Sie Insert Distribution (Verteilung einfügen). i. Der Wert unter Insert Size (Abschnittsgröße) muss in einem Bereich von 150 bis 400 liegen. c. Überprüfen Sie das Diagramm Read Distribution Among Samples/Barcode (Read- Verteilung innerhalb der Proben/Barcodes). d. Überprüfen Sie die Kurve Nucleotide Distribution Along Each Position (Nukleotidverteilung nach Positionen). i. Die Kurve muss für jede Basis ab Position 20 einen ähnlichen Prozentsatz anzeigen. e. Überprüfen Sie das Diagramm Quality Score Distribution Along Each Position (Verteilung der Qualitätsbewertung nach Positionen). 6. Klicken Sie zum Prüfen von Daten auf die Registerkarte Review (Überprüfen). Seite 7 von 18

8 Abb. 1 Fenster Review (Überprüfung) (A) Dropdown-Menü Sample (Probe) und Locus (Lokus) (B) Für die Probe gewählte Genotypen (C) SNP (single nucleotide polymorphism, Einzelnukleotid-Polymorphismen) und LD-Vorschlagtabellen (D) Tabelle der berechneten Allelkandidaten (E) Deckungsplots und Ausrichtungs-Browser (F) Ausrichtungs-Browser für de Novo Contigs Seite 8 von 18

9 a. Überprüfen aller Daten mithilfe des intelligenten Kennzeichnungssystems zur Suche nach Abweichungen, unzureichenden Daten und Fragezeichen. b. Navigieren Sie zum Prüfen von Daten über die Dropdown-Menüs Sample (Probe) und Locus (Lokus) (Abb. 1 (A)) c. Überprüfen Sie Allele in der Tabelle Candidate (Kandidat) (Abb. 1 (D)), i. Beachten Sie die Spalte Minimum Coverage (Mindestdeckung) unter cdna Browser (fünfte Spalte) und die Spalte Minimum Central Read (minimale zentrale Read-Deckung) unter cdna Browser (sechste Spalte). d. Prüfen Sie bei eventuellen homozygoten Calls (nur ein Allel pro Lokus aufgelistet) die Informationen unter LD Suggestion (LD-Vorschlag), die graue Schattierung im Deckungsplot und die Registerkarte Candidate Pairs (Kandidatenpaare) auf Hinweise nach fehlenden Alellen (Abb. 1 (C)). e. Markieren Sie zum Anzeigen von Coverage Plots (Deckungsplot) Allelkandidaten in der Tabelle Candidate (Kandidat) und wählen Sie Coverage (Deckung) (Abb. 1 (E)). Seite 9 von 18

10 f. Im linken Fensterbereich werden Referenzsequenzen Coverage along the cdna (Deckung über cdna) angezeigt. Der rechte Fensterbereich zeigt die Referenzsequenzen Coverage along the Genomic (Deckung über Genom). Rote Striche über den Deckungskurven zeigen Positionen an, die von den gewählten Referenzallelen abweichen. Der grau schattierte Bereich kennzeichnet den Unterschied zwischen der Gesamtdeckung für das untersuchte Gen und der Summendeckung der gewählten Allele. g. Wählen Sie zum Bestätigen bzw. Prüfen eines automatisch zugewiesenen Calls das abgerufene Allel und ein Allel Ihrer Wahl. Klicken Sie auf die Schaltfläche Consensus Alignment (Konsensausrichtung), und vergleichen Sie mit dem am besten passenden Contig. h. Navigieren Sie zum Vergleich der Allele durch die verschiedenen Ausrichtungsmerkmale, und bestätigen oder ändern Sie den automatischen Zuweisungs-Call. Seite 10 von 18

11 i. Lassen Sie sich von den Tools SNP und LD Suggestion helfen, die besten Calls zu machen. i. Die Tabelle SNP listet polymorphe Stellen von durch de Novo-Sequenzierung assemblierte Contigs und gephasten Blocks sowie die Frequenz von Nukleotiden an jeder polymorphen Stelle auf. Wenn das Verhältnis von Nukleotidfrequenzen in Contig1 versus Contig2 vom durchschnittlichen Verhältnis abweicht, werden die entsprechenden Zellen orangefarben hervorgehoben. Seite 11 von 18

12 ii. Der Fensterbereich LD Suggestion listet Einträge aus der Datenbank für Kopplungsungleichgewichte auf, die die in der Tabelle Probengenotyp enthaltenen Allelen enthält. Jede Reihe stellt Allele dar, deren Assoziation zueinander beobachtet wurde. Der Fensterbereich LD Suggestion dient lediglich Informationszwecken. LD wird nicht zur Berechnung ermittelter Probengenotypen verwendet. j. Wenn Änderungen des Calls vorgenommen wurden, drücken Sie die Schaltfläche Refresh (Aktualisieren) über der Genotypentabelle. Wenn alle Calls korrekt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Approve (Bestätigen), und gehen Sie zur nächsten Probe. Nur Prüfer mit dem Status Techniker oder Laborleiter können einen bereits ermittelten Call überschreiben. k. Nach Genehmigung der Probe kann nur ein Benutzer mit der Rolle Leiter das Ergebnis durch Klicken auf ReAnalysis (Erneut analysieren) ändern. Seite 12 von 18

13 7. Klicken Sie zum Überprüfen des Genotyps aller Proben vor der Berichterstellung auf Summary (Zusammenfassung). Seite 13 von 18

14 8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Report (Bericht), und wählen Sie das gewünschte Ausgabeformat (PDF, PDF ohne Kommentar, XML) Seite 14 von 18

15 ANHANG A Hinweis: Zum Starten von MiSeq ist die Erstellung eines Probenblatts erforderlich 1. Laden Sie Illumina Experiment Manager über folgenden Link herunter. ds.html 2. Öffnen Sie die Software, und klicken Sie auf Create Sample Sheet (Probenblatt erstellen) Seite 15 von 18

16 3. Wählen Sie MiSeq Instrument, und klicken Sie auf Next (Weiter). 4. Wählen Sie unter Select Category (Kategorie wählen) Other (Sonstige) und unter Select Application (Anwendung auswählen) FASTQ only (nur FASTQ). Klicken Sie anschließend auf Next (Weiter). Seite 16 von 18

17 5. Füllen Sie die Parameter unter Workflow aus, und klicken Sie dann auf Next (Weiter). a. Reagent Cartridge barcode (Barcode für die Reagenzkartusche): Geben Sie die Barcode- Nummer der MiSeq Reagenzkartusche ein. Die Barcode-Nummer ist auf dem Etikett der Kartusche zu finden. b. Sample Prep Kit (Probenvorbereitungs-Kit): Wählen Sie TruSeq HT. c. Index-Reads: Wählen Sie 0. d. Experiment name (Name des Experiments): Muss mit dem Projektnamen beginnen, der zuvor in der MIA FORA Software erstellt wurde (z. B.: Training_06Jan16_QUAIL). Hinweis: Kopieren Sie den Experimentnamen, und fügen Sie ihn in Schritt 6 in das Feld Sample ID ein. e. Investigator Name (Name der untersuchenden Person): Name der Person, die das Experiment durchführt f. Description (Beschreibung): Für eventuelle weitere Informationen g. Date (Datum): Datum des Durchlaufs h. Read Type (Read-Typ): Wählen Sie Paired End (Paired End). i. Zyklus-Read 1/2: Beide sollten 151 sein. j. Workflow Einstellungen für FASTQ Only (nur FASTQ): Deaktivieren Sie alle Kontrollkästchen. Seite 17 von 18

18 6. Auf dem Bildschirm Sample Sheet (Probenblatt) ist nur 1 Reihe erforderlich. Fügen Sie den in Schritt 5 verwendeten Experimentnamen in das Feld Sample ID (Proben-ID) ein. Wählen Sie Finish (Beenden). Die FASTQ-Datei erhält den Namen, der in das Feld Sample ID (Proben-ID) eingegeben wurde (z. B. Training_06Jan16_QUAIL). 7. Speichern Sie die.csv-datei an einem für den Einsatz mit MiSeq geeigneten Speicherort unter dem Projektnamen. Seite 18 von 18