9 Praxis: Proteinbestimmung und proteolytischer Verdau von Bacteriorhodopsin

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1 9 Praxis: Prteinbestimmung und prtelytischer Verdau vn Bacterirhdpsin 9.1 Quantitative Prteinbestimmung Meistens erflgen die Prteinbestimmungen in Küvetten. Generell gilt hierbei, dass die Küvette im Referenzstrahlengang des Spektralphtmeters mit einer Lösung vn möglichst ähnlicher Zusammensetzung wie die zu vermessende Lösung gefüllt sein sllte. Für slche klrimetrischen Verfahren sllte in die Referenz-Küvette reines VE-Wasser gefüllt werden. Gegen diese Referenz werden alle Absrptinswerte der Prben gemessen. Die Bezeichnung Prbe umfasst die eigene Prbe unbekannter Prteinknzentratin ebens wie den Nullwert der Standardgeraden (Blindprbe) und die Standards für die Standardreihe. Anhand der Standardreihe ist die Prteinmenge in der unbekannten Prbe zu bestimmen. Vn allen Prben sllten Mehrfachbestimmungen durchgeführt werden mit jeweils mindestens zwei Ansätzen. Alle Werte der Standardreihe kmmen beim Prtkll in eine Abbildung, um Abweichungen besser erkennen zu können. Für die Experimente (Prteinbestimmung und prtelytischer Verdau) wird eine vm Betreuer ausgegebene Stammlösung vn Bacterirhdpsin in Purpurmembran verwendet. Hierzu wird ein Spektrum im Bereich vn 700 nm bis 300 nm mit PMMA-Küvetten aufgenmmen und über den Retinalpeak bei 568 nm wird die Knzentratin bestimmt (die ermittelte Knzentratin wird unter anderem zur Berechnung der Ansätze für den prtelytischen Verdau benötigt, siehe 9.2). Sllte die Absrptin über 1 liegen, muss die Prbe verdünnt werden. Es empfiehlt sich eine 1:20-Verdünnung in 1 ml Gesamtvlumen zu nehmen (Langsam pipettieren, da die Stammlösung sehr visks ist!!) 1

2 9.1.1 Verfahren A: Bradfrd 1. In den Reaktinsgefäßen 200 µl Prbe (mit 0,2 bis 20 µg Gesamtprteinmasse) vrlegen µl Bradfrd-Lösung dazu pipettieren. 3. Durch mehrmaliges Invertieren mischen und mind. 5 min. bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Lösung in PMMA-Küvetten füllen. 5. Absrptin aller Ansätze bei 590 nm messen. 6. Absrptin aller Ansätze bei 450 nm messen. 7. Qutient A 590 nm /A 450 nm gegen die eingesetzte Prteinmenge auftragen. 8. Nach der Messung Lösung in Behältern für wässrigen Abfall entsrgen. Standardreihe (Bradfrd): Zur Erstellung einer Standardreihe mit bekannten Prteinmengen dient Rinder-Serumalbumin (bvine serum albumin, BSA). Aus der vrhandenen Lösung mit 1 mg/ml (lagert bei -20 C) sll eine 1:10- Verdünnung vrbereitet werden (0,1 mg BSA/mL). Hiervn sind flgende Verdünnungen in Reaktinsgefäßen anzusetzen (jeweils dppelt): BSA [µg] µl (0,1 mg/ml) µl Wasser Unbekannte Prben (Bradfrd): Vn der Bacterirhdpsin Stammlösung wird eine 1:10 Verdünnung vrbereitet (Endvlumen: 300 µl, ausreichend für beide Prteinknzentratinsbestimmungsmethden). Aus dieser 1:10 Verdünnung sind für die Bradfrd-Methde flgende Verdünnungen anzusetzen (jeweils dppelt): Verdünnung A B C D µl Bacterirhdpsinverdünnung (1:10) µl Wasser Bradfrd-Lösung: (bereits vrhanden, lagert bei 4 C) A. 20 mg Cmassie Brillant Blue G-250 (der Serva Blau G-250) werden in 10 ml 95% (v/v) Ethanl größtenteils gelöst. B. 20 ml 85% (w/v) Phsphrsäure hinzugeben und rühren, um den Farbstff quantitativ zu lösen. Mit VE-Wasser vrsichtig auf 200 ml auffüllen und über Nacht rühren. Lösung abfiltrieren und bei 4 C lagern. 2

3 9.1.2 Verfahren B: Pyrgalllrt µl Prteinprbe (mit ptimal 2 bis 40 µg Gesamtprteinmasse) in Reaktinsgefäß vrlegen. 2. mit 1,25 ml Pyrgalllrt-Lösung mischen min. bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Lösung in PMMA-Küvetten füllen. 5. Absrptin bei 600 nm und 470 nm messen. 6. Qutient der Absrptin A 600 nm /A 470 nm gegen die eingesetzte Prteinmenge auftragen. 7. Nach der Messung Lösung in Behältern für wässrigen Abfall entsrgen. Standardreihe (Pyrgalllrt): Zur Erstellung einer Standardreihe mit bekannten Prteinmengen dient Rinder-Serumalbumin (bvine serum albumin, BSA). Hiervn ist eine Lösung mit 1 mg/ml vrhanden (lagert bei -20 C). Aus dieser Stammlösung sind flgende Verdünnungen in Reaktinsgefäßen anzusetzen (jeweils dppelt): BSA [µg] µl (1 mg/ml) µl Wasser Unbekannte Prben (Prygalllrt): Aus der 1:10 Verdünnung der Bacterirhdpsin-Lösung (siehe Prbenvrbereitung für Bradfrd) sind flgende Verdünnungen anzusetzen (jeweils dppelt): Verdünnung A B C D µl Bacterirhdpsinverdünnung (1:10) µl Wasser Pyrgalll-Lösung: (bereits vrhanden, lagert bei RT) A. 1,5 mm Pyrgalllrt-Lösung (PR): 30 mg PR in 50 ml Methanl lösen. B. 10 mm Mlybdat: 24 mg Dinatriummlybdat Dihydrat in 10 ml VE-Wasser lösen. C. 5,9 g Bernsteinsäure, 0,14 g Natriumxalat und 0,5 g Natriumbenzat in 900 ml Wasser lösen. Zu den 900 ml Lösung C 40 ml Lösung A und 4 ml Lösung B hinzugeben. Auf ph 2,5 einstellen und auf 1 L auffüllen. 3

4 9.2 Prtelytischer Verdau Der prtelytische Verdau mit einer Prtease wird vn 2 Gruppen parallel durchgeführt, d.h. Gruppe 1 verwendet Papain, Gruppe 2 verwendet Chymtrypsin (Bitte untereinander absprechen!!). vrbereitete Stammlösungen (werden bei -20 C aufbewahrt, ein Aliqut pr Gruppe): 200 mm Phsphatpuffer, ph 7,0 200 mm Idacetamid (Hinweis: txisch; Entsrgung im Abfallbehälter) 6 mm -Mercaptethanl 100 mm EDTA 500 mm Cystein 1 mg/ml Papain 1 mg/ml Chymtrypsin 200 mm Pefablc SC Flgende Lösung ist anzusetzen: Tris Puffer (100 ml) 10 mm Tris ph 6,8 mit HCl einstellen Aktivierung vn Papain: 1 ml Ansatz (pr Gruppe) 0,1 mg/ml Papain 1 mm EDTA 5 mm Cystein 60 µm -Mercaptethanl Bei 37 C wird dieser Ansatz für mind. 30 min im Wasserbad inkubiert. Verdau: Es sllen Ansätze mit unterschiedlichen Prtease-zu-Bacterirhdpsin-Verhältnissen vrbereitet werden. Für den prtelytischen Verdau wird die ausgegebene Bacterirhdpsin-Stammlösung verwendet (NICHT die Verdünnung vn der Prteinbestimmung), hierbei sll die spektralphtmetrisch bestimmte Knzentratin (über Retinalpeak bei 568 nm) verwendet werden. Im Anhang (siehe 9.4) ist das Pipettierschema für die Verdau-Ansätze zu finden. Hierbei sind flgende Bedingungen einzustellen: 1 mg/ml Bacterirhdpsin (Langsam pipettieren, da die Stammlösung sehr visks ist!) 100 mm Phsphatpuffer 1 mm EDTA 60 µm -Mercaptethanl 5 mm Cystein 4

5 Diese Ansätze werden bei 37 C inkubiert. Direkt nach Zugabe der Prtease (0 min) und in Abständen vn 15, 30 und 60 min werden Prben entnmmen. Hierzu werden 45 µl der Ansätze entnmmen, mit 45 µl 200 mm Phsphatpuffer und 10 µl Inhibitr (200 mm Idacetamid (TOXISCH!) für Papain bzw. 200 mm Pefablc SC für Chymtrypsin), versetzt und bei RT gelagert. Nachdem die Prben vn allen vier Zeitpunkten gesammelt wrden sind, werden sie für 5 min in der Tischzentrifuge (max. rpm) zentrifugiert. Der Überstand kann verwrfen werden. Zum Sediment kmmt dann 1 ml 10 mm Tris- Puffer. Nach Resuspendieren wird wieder für 5 min in der Tischzentrifuge (max. rpm) zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands ist das Sediment in 20 µl 10 mm Tris-Puffer und 25 µl SDS- Prbenauftragspuffer (lagert bei -20 C) aufzunehmen. Anschließend werden pr Prbe je 15 µl auf ein SDS-Gel (14%) aufgetragen (Pr Prtease sllten es 16 Prben sein, für je 4 Knzentratinen und je 4 Zeitpunkte). 5

6 9.3 Elektrphrese Gießen denaturierender SDS-Gele Details und Tipps zum Gießen vn Gelen siehe Skript 6 und 7! Es stehen flgende Acrylamid-Lösungen zur Verfügung: Gel A Gel B 30%ige Lösung (w/v) vn Acrylamid 2%ige Lösung (w/v) vn N,N -Methylen-bisacrylamid Als Puffer sind vrhanden: SDS-Tris-Glycin-Prbenauftragspuffer 15% (w/v) Saccharse 2,5% (w/v) SDS 0,25% (w/v) Natriumcarbnat 0,04% (w/v) Brmphenlblau 25 mm DTT SDS-Stammlösung 20% (w/v) SDS SDS-Tris-Glycin-Trenngelpuffer (4 fach knzentriert) 1,5 M Tris ph 8,8 mit HCl einstellen SDS-Tris-Glycin-Sammelgelpuffer (8 fach knzentriert) 1,0 M Tris ph 6,8 mit HCl einstellen APS-Lösung 10% (w/v) APS Flgender Puffer ist anzusetzen: SDS-Tris-Glycin-Elektrphrese-Puffer (500 ml in VE-Wasser, ausreichend für vier Gele) 0,1% (w/v) SDS 400 mm Glycin 50 mm Tris ph 8,5 stellt sich ein Zunächst ist die Zusammensetzung der Lösungen für die SDS-Plyacrylamidgele auszurechnen (siehe Tab. 1). Zur Herstellung des Trenngels werden zuerst die berechneten Vlumina an Trenngelpuffer, Wasser, Gel A, Gel B und SDS-Lösung vermischt. Anschließend gibt man die entsprechenden Mengen TEMED und APS hinzu und befüllt die Gelkassette mit einer Plastik-Pasteurpipette bis etwa 1,5 cm unterhalb des beren Randes. Um den Sauerstff der Luft vn der radikalischen Reaktin fernzuhalten, swie eine glatte Oberfläche des Trenngels zu erreichen, ist das frisch gegssene Trenngel mit Isprpanl zu überschichten. Nach dem Ausplymerisieren des Trenngels dekantiert man das Isprpanl. Entsprechend zum Trenngel ist das Sammelgel anzusetzen. Direkt nach Zugabe der Plymerisatinsstarter ist das Sammelgel in die Gelkassette zu gießen und ein Taschenkamm einzusetzen. Nach dem Ausplymerisieren kann dieser wieder entfernt werden und die Gelkassette zur Lagerung bei 4 C in feuchte Tücher und Aluflie gewickelt werden. 6

7 Tab. 1: Zusammensetzung der Gellösungen für die denaturierende SDS-Tris-Glycin-Elektrphrese. Es sllen 10 ml Trenngellösung vrbereitet werden (ausreichend für 2 Gele mit den Abmessungen 7,4 cm x 8,7 cm x 0,75 mm). Hierzu ist mit den Lösungen Gel A und Gel B T=14 % und C=4 % einzustellen. Beim Sammelgel (Endvlumen 5 ml) ist Gel AB zu verwenden für T=5 % und C=3,3 %. Trenngel Sammelgel T [%] 14 T [%] 5 C [%] 4 C [%] 3,3 Gesamtvlumen [ml] 10 Gesamtvlumen [ml] 5 Gel A [ml] Gel B [ml] Trenngelpuffer (4x) [ml] H 2 O VE-[mL] Gel A [ml] Gel B [ml] Sammelgelpuffer (8x) [ml] H 2 O VE-[mL] 20% SDS [µl] 50 20% SDS [µl] 25 TEMED [µl] 7,5 TEMED [µl] 5 APS [µl] 75 APS [µl] 50 Die ausplymerisierten SDS-Gele werden in die Laufapparatur eingebaut und die Kammern mit SDS- Tris-Glycin-Elektrphrese-Puffer befüllt. Die Prben (je 15 µl) werden gemeinsam mit 2 µl LMW- Standard auf das SDS-Gel aufgetragen. Die Elektrphrese wird bei 100 V (und 100 ma) gestartet. Wenn die Lauffrnt in das Trenngel einläuft, wird die Spannung auf 150 V erhöht. Die Elektrphrese ist beendet, wenn die Lauffrnt aus dem Gel herausgelaufen ist Cmassie-Färbung Ähnlich wie CBBG, bindet auch der Farbstff Cmassie Brillant Blau R-250 an Prteine. Zusammen mit Kupfer-Inen ergibt sich eine intensive Färbung der Prteinbanden. Die Nachweisgrenze liegt hier bei etwa 0,3 µg pr Bande. Die in der Färbelösung enthaltene Essigsäure srgt hierbei für eine Fixierung der Prteine im Gel. 7

8 Flgende Lösungen sind vrhanden: Cmassie-Färbe-Lösung Lösung A: 5g Cu II SO 4 *5H 2 O 400 ml H 2 O dest 100 ml CH 3 COOH p.a. Lösung B: 1,5g Cmassie Brillant Blue R-250 0,5g Serva Blue G 50mL H 2 O dest 450mL Methanl techn. Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 mischen, über Nacht rühren, danach filtrieren Flgende Lösung ist anzusetzen: Entfärbelösung (falls nicht schn wegen BN-PAGE vrhanden) 2,5 g CuSO 4 5 H 2 O in ca. 250 ml VE-Wasser lösen 50 ml Essigsäure 125 ml Methanl mit VE-Wasser auf 500 ml auffüllen Nach der Elektrphrese inkubiert man das Gel unter leichtem Schütteln für ca. 10 min in Entfärbelösung und dann für mind. 1 h der über Nacht in der Färbelösung. Die Färbelösung wird anschließend wieder in den Vrratsbehälter zurückgeschüttet. Die Entfärbung erflgt s lange, bis der Hintergrund des Gels farbls ist. Die Entfärbelösung ist bei Bedarf mehrmals auszutauschen (Entsrgung in Flüssigabfallkanister). Danach wird das Gel eingescannt (5. Stck AG Dencher) Auswertung der Gele Die Gele sllten im Prtkll s beschriftet werden, dass sich zurdnen lässt, in welcher Spur welche Prbe aufgetragen wurde. Darüber hinaus ist es sinnvll, die Banden des Mlmassen-Standards mit der zugehörigen Masse zu beschriften. Am Beispiel eines SDS-Gels (LMW-Standard) ist eine Kalibriergerade (Lgarithmus der mlaren Masse gegen den R F -Wert) zu erstellen. Mit dieser Geraden lassen sich dann die Massen unbekannter Banden bestimmen. Wenn man kmplexe Prben wie Zellaufschlüsse mit vielen unterschiedlichen Prteinen hat, ist für eine genaue Bestimmung der Banden z.b. Western Bltting, Edman-Sequenzierung der Massenspektrmetrie erfrderlich. Beide Gruppen sllen die Gelbilder untereinander austauschen und im Prtkll sll der Verdau mit beiden Prteasen diskutiert werden. 8

9 9.4 Anhang Pipettierschema für prtelytischen Verdau; (V gesamt = 250 µl pr Ansatz mit der entsprechenden Prteaseknz.) Stammlösungen: Bacterirhdpsin-Stammlösung (Knzentratin wurde in 9.1 bestimmt) 200 mm Phsphatpuffer, ph 7,0 6 mm -Mercaptethanl 100 mm EDTA 500 mm Cystein 0,1 mg/ml aktiviertes Papain 1 mg/ml Chymtrypsin Papain Endknz. [µg/ml] 2,5 aktiviertes Papain (Stammlösung: 0,1 mg/ml) [µl] Phsphatpuffer Endknz.: 100mM [µl] EDTA Endknz.: 1 mm [µl] β-mercaptethanl Endknz.: 60 µm [µl] Cystein Endknz.: 5 mm [µl] Bacterirhdpsin Endknz.: 1 mg/ml [µl] H 2 O [µl] Chymtrypsin Endknz. [µg/ml] 5 Chymtrypsin (Stammlösung: 1 mg/ml) [µl] Phsphatpuffer Endknz.: 100mM [µl] EDTA Endknz.: 1mM [µl] β-mercaptethanl Endknz.: 60µM [µl] Cystein Endknz.: 5 mm [µl] Bacterirhdpsin Endknz.: 1 mg/ml[µl] H 2 O [µl]

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