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1 (C) SchulLV 1 von 8 Wortherkunft NEWS NEWS NEWS Banküberfall in der 11 Avenue NEWS NEWS NEWS Das ist dein erster Fall als Kriminalpolizist und gleich eine so große Sache: Ein Bankräuber ist nachts in die Bank of Scotland eingebrochen und hat eine millionenschwere Beute gemacht. Seine Tat war gut geplant, die Spurensicherung konnte am Tatort keine auffälligen Spuren sicherstellen. Zumindest fast! Gefunden wurde ein einzelnes Haar. Das soll nun den Täter überführen. Wie du als Kriminalpolizist weißt, ist hierfür eine DNA-Analyse des Haars nötig. Wenn du dich nur erinnern würdest, was es mit dieser DNA auf sich hat und wieso man den Täter damit überführen kann. Das Wort DNA ist auf den englischen Begriff deoxyribonucleic acid zurückzuführen. Im deutschen wird die DNA mit DNS (= Desoxyribonukleinsäure) abgekürzt. Die DNA ist der Träger des Erbguts und kommt sowohl in allen Organismen als auch in speziellen Viren vor. Damit ist sie eines der wichtigsten Moleküle innerhalb der Lebewesen. Bausteine Die DNA gehört einer der vier großen Gruppen von Biomolekülen an: den Nucleinsäuren. Diese Makromoleküle bestehen aus unzähligen Bausteinen, die sich Nukleotide nennen. Den Nukleinsäuren lässt sich auch die RNA (= ribonucleic acid, deutsch: RNS = Ribonukleinsäure) zuordnen. Nukleotide sind aus drei Komponenten zusammengesetzt: 1. Phosphorsäure ( ) 2. einer Pentose (= Monosaccharid), im Spezialfall der DNA Desoxyribose 3. einer Nukleobase (= Nukleinbase) Nukleobasen reagieren in wässrigen Lösungen basisch, daher ihr Name. In der DNA finden sich insgesamt vier Nukleobasen: Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Abbildung 1: Die vier Nukleobasen der DNA Abbildung 1 zeigt die Strukturformeln der Nukleobasen, die in der DNA vorkommen. Auffällig ist, dass sich die Struktur von Adenin und Guanin sowie die Struktur von Cytosin und Thymin recht ähnlich ist. Aufgrund dieser Struktur werden Adenin und Guanin als Purin-Basen bezeichnet, Cytosin und Thymin als Pyrimidin-Basen. Purin- und Pyrimidin-Basen verhalten sich aufgrund ihrer räumlichen Struktur komplementär (= zueinander passend). Treffen zwei komplementäre Nukleobasen aufeinander, d.h. eine Eselsbrücke: Ist dir aufgefallen, dass die beiden Pyrimidin-Basen Cytosin und Thymin je ein y im Namen tragen?

2 (C) SchulLV 2 von 8 Purin- und eine Pyrimidinbase, bildet sich ein Basenpaar aus, das durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten wird. Die Basenpaarungsregel besagt dabei, dass sich immer eine Purin-Base mit einer Pyrimidin-Base verbindet. Bei der DNA sind Adenin und Thymin komplementär sowie Guanin und Cytosin. Zwischen Adenin und Thymin bilden sich dabei genau zwei Wasserstoffbrückenbindungen aus, zwischen Guanin und Cytosin hingegen drei. Zwischen Adenin und Cytosin kann sich keine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden, auch nicht zwischen Guanin und Thymin, weil deren Struktur nicht zusammen passt. Verbindet sich eine Nukleobase mit einem Zucker, entsteht ein Nukleosid. Dabei lassen sich folgende Nukleoside unterscheiden: 1. Adenosin = Adenin + Pentose Bei der DNA: Desoxyadenosin = Adenin + Desoxyribose 2. Guanosin = Guanin + Pentose Bei der DNA: Desoxyguanosin = Guanin + Desoxyribose 3. Cytidin = Cytosin + Pentose Bei der DNA: Desoxycytidin = Cytosin + Desoxyribose 4. Thymidin = Thymin + Pentose Bei der DNA: Desoxythymidin = Thymin + Desoxyribose Verbinden sich nun noch ein, zwei oder drei Phosphatreste mit einem dieser Nukleoside, erhält man letztlich ein Nukleotid. Aus dem Namen des Nukleotids wird schnell erkenntlich, aus wie vielen Phosphatresten, welchem Zucker und welcher Nukleobase es zusammengesetzt ist. Adenosinmonophosphat = Adenosin + ein Phosphatrest Bei der DNA: Desoxyadenosinmonophosphat = Abbildung 2: Aufbau der Nukleoside und Nukleotide Desoxyadenosin + ein Phosphatrest Adenosindiphosphat = Adenosin + zwei Phosphatreste Bei der DNA: Desoxyadenosindiphosphat = Desoxyadenosin + zwei Phosphatreste Adenosintriphosphat = Adenosin + drei Phosphatreste Bei der DNA: Desoxyadenosintriphosphat = Desoxyadenosin + drei Phosphatreste Ersetzt man das Nukleosid Adenosin durch die Nukleoside Guanosin, Cytidin oder Thymidin, erhält man die entsprechenden Nukleotide. Die Namensgebung erfolgt dabei wie im Beispiel mit dem Nukleosid Adenosin. Abbildung 2 zeigt den schematischen Aufbau der drei möglichen Nukleotide, die mit der Nukleobase Adenin entstehen können. Wahrscheinlich ist dir die Energiewährung ATP (= Adenosintriphosphat) bekannt. Sie ist eine wichtige Komponente bei Stoffwechselprozessen. Mehr dazu erfährst du im Skript zum Thema Stoffwechsel - Einführung. Die Verknüpfung der Nukleotide zu einer Nukleinsäure und damit auch zur DNA ist in Abbildung 3 vereinfacht als Ausschnitt dargestellt. Bei der Verbindung der Nukleotide zu einem Doppelstrang gilt stets die Basenpaarungsregel. Die komplementären Basen Adenin und Thymin sowie Guanin und Cytosin halten über

3 (C) SchulLV 3 von 8 Wasserstoffbrückenbindungen zusammen. Weiterhin ist der Abbildung zu entnehmen, dass die Einzelstränge der DNA unterschiedliche Enden haben, den 3' und den 5' Strang. Nukleotide, die die Einzelstränge aufbauen, können nur am 3'-Ende anknüpfen. Dort befindet sich eine OH-Gruppe, mit der sich der Phosphatrest des nächsten Nukleotids verbinden kann. Abbildung 3: Nukleotidabfolge im DNA-Strang Der Wissenschaftler Erwin Chargaff beschrieb in Hinblick auf die Nukleotide innerhalb der DNA verschiedene Gesetzmäßigkeiten. Diese Gesetzmäßigkeiten sind als Chargaff'sche Regeln bekannt. Alle Arten haben eine unterschiedliche Basenzusammensetzung. Das bedeutet, die Häufigkeit mit der Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin in den DNA Strängen der Arten vorkommen, ist immer anders. Gemeinsam ist allen Arten jedoch, dass die DNA ausschließlich die Nukleotide Adenosinmonophosphat (AMP), Guanosinmonophosphat (GMP), Cytidinmonophosphat (CMP) und Ribothyminmonophosphat enthält. Die Gesamtmenge der Purinbasen in der DNA entspricht der Gesamtmenge der Pyrimidinbasen. Da Adenin und Thymin komplementäre Basen sind, entspricht die Gesamtmenge von Adenin in der DNA der Gesamtmenge von Thymin. Gleiches gilt für das Mengenverhältnis von Guanin und Cytosin. Auf Basis dieser Regeln gelang es 1953 den Biochemikern James D. Watson und Francis H. C. Crick (Abbildung 4), auch die räumliche Struktur der DNA zu erklären. Sie fanden heraus, dass das langkettige DNA-Molekül schraubenförmig gedreht ist und damit eine Helixstruktur ausbildet (Abbildung 5). Für diese Erkenntnis erhielten James D. Watson und Francis H. C. Crick 1962 den Nobelpreis für Medizin. Gene Die DNA lässt sich in viele verschiedene Abschnitte gliedern, die wiederum Informationen zur Synthese von Proteinen oder anderen Molekülen codieren. Diese Abschnitte werden Gene genannt. Bei der eukaryotischen DNA kann ein Gen zudem in Exons (= engl. expressed region, Übersetzung: ausgedrückte Region) und Introns (= engl. Intervening regions, Übersetzung: dazwischenkommende Regionen) gegliedert werden (siehe Abbildung 6). Exons sind die codierenden Abschnitte der Gene, nur sie enthalten letztlich Informationen für den Bauplan der Proteine. Beim Menschen gibt es je Gen meist acht Exons mit 145 Nukleotiden. Introns enthalten keine Informationen, sie sind nicht codierend. Die Anzahl der Introns ist von Gen zu Gen unterschiedlich. Introns sind

4 (C) SchulLV 4 von 8 oftmals wesentlich länger als Exons, da sie aus weitaus mehr Nukleotiden bestehen. Welche Funktion die Introns im Organismus haben ist Abbildung 4: James D. Watson und Francis H. C. Crick noch nicht vollständig Quelle: modifiziert nach wikipedia.org- geklärt. Um Proteine Cold Spring Harbor Laboratory, Bearbeitung: synthetisieren zu Jan Arkesteijn und Marc Lieberman (CC BY-SA 2.5) können, müssen ausschließlich codierende Abschnitte vorliegen. Wie Exons Gen: verkleben und die Introns Ein Gen ist ein Abschnitt auf einem herausgeschnitten werden, DNA- oder RNA-Molekül, der damit nur noch codierende Erbinformation codiert. Der Abschnitt Abschnitte vorliegen, besteht aus einer bestimmten findest du im Skript Nukleotidsequenz. Proteinbiosynthese erklärt. Eukaryoten: Unter Eukaryoten versteht man Lebewesen verstanden, deren DNA von einem echten Zellkern umgeben ist. Abbildung 5: Doppelhelix Quelle: wikipedia.org - Michael Ströck, Bearbeitung: BioLV (CC BY-SA 3.0) Abbildung 6: Ein Gen Quelle: wikipedia.org - National Human Genome Research Institute Schaubild zur DNA Das nachfolgende Schaubild soll dir nochmal einen Gesamtüberblick über den Aufbau der DNA geben:

5 (C) SchulLV 5 von 8 Abbildung 7: Ebenen der DNA Quelle: wikipedia.org - National Human Genome Research Institute (public domain), Bearbeitung: BioLV DNA-Analyse DNA-Analysen (= Gentests) werden in verschiedenen Anwendungsbereichen benötigt. Mit diesen Verfahren lassen sich beispielsweise Verwandtschaftsbeziehungen klären (Stichwort Vaterschaftstest), die Qualität von Nahrungsmitteln kontrollieren, genetisch bedingte Krankheiten ermitteln und in der Kriminalistik Täter überführen. Mit einer DNA-Analyse des gefundenen Haares kommt man auch dem Bankräuber aus dem Eingangbeispiel leicht auf die Schliche. Nachfolgend werden zwei Methoden zur DNA-Analyse näher betrachtet und sowie ein Verfahren, das der DNA-Analyse vorangestellt ist.

6 (C) SchulLV 6 von 8 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion, englisch polymerase chain reaction (daher die Abkürzung PCR), ist ein Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer Teile des DNA-Strangs. Bei verschiedenen DNA-Analyse-Methoden ist dies ein notwendiger Prozess, um genügend DNA-Moleküle für die Analyse vorliegen zu haben. Die PCR findet in einem Thermocycler und speziellen Versuchsgefäßen statt (Abbildung 7), d.h. ausschließlich außerhalb eines Organismus (= in vitro). In den Versuchsgefäßen befinden sich die zu vervielfältigende DNA, zwei Primer (für jeden Doppelstrang der DNA ein Primer), eine DNA-Polymerase, freie Nukleotide und eine Lösung, in der Primer und DNA-Polymerase unbeschadet arbeiten können. Der Ablauf der PCR lässt sich in drei Schritte gliedern: 1. Denaturierung: In diesem ersten Schritt wird die DNA-Doppelhelix zunächst auf ca. 95 C erhitzt. Dabei brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren auf und die DNA-Stränge werden getrennt. Es entstehen DNA-Einzelstränge. 2. Hybridisierung: Jetzt wird die Temperatur auf ungefähr 60 C abgekühlt. Das ist nötig, damit sich nun die Primer (= DNA-Sequenz, die als Startpunkt für die DNA-Polymerase fungiert) an das 3'-Enden der DNA-Stränge anlagern können. 3. Elongation: Im letzten Schritt wird die Temperatur bis auf ca. 69 C angehoben. Die DNA-Polymerase (= Enzym zur Synthese von DNA) setzt am Primer an und synthetisiert mittels freier Nukleotide den fehlenden DNA-Strang. Dabei arbeitet sie ausschließlich in 5' 3'-Richtung Werden die einzelnen Schritte der PCR mehrmals hintereinander ausgeführt (meist mal), erhält man die gewünschte Menge an DNA. Abbildung 8: A: Thermocycler, B: Reaktionsgefäße Quelle: A: wikipedia.org - Magnus Manske, B: wikipedia.org - kochstudio; Beschriftung: BioLV Genetischer Fingerabdruck Unter dem genetischen Fingerabdruck versteht man ein für jeden Menschen individuelles DNA-Profil. Es wird z.b. erstellt, um Straftäter zu überführen. Um den genetische Fingerabdruck einer Person zu erhalten, erfolgt zunächst die Verdopplung der DNA mittels PCR. Um das DNA-Profil zu erhalten, werden dann nur die Introns untersucht, denn jedes Intron besteht aus gleichartigen Sequenzen (= repeats) mit zwei bis zehn Nukleotiden. Diese Sequenzen wiederholen sich 3-40 mal und werden als Short Tandem Repeats (STR) bezeichnet. Die Abfolge der Nukleotide innerhalb der STR ist bei allen Säugern gleich. Wie viele STR es gibt, ist jedoch von Individuum zu Individuum unterschiedlich. Der genetische Fingerabdruck beschreibt damit die Anzahl der sich wiederholenden Sequenzen in den Introns der DNA. Er ist für jedes Individuum einzigartig. Über Gelelektrophorese können dann Bandenmuster der unterschiedlich langen Introns sichtbar gemacht werden.

7 (C) SchulLV 7 von 8 In unserem Beispiel könnte man aus dem gefundenen Haar DNA isolieren und einen genetischen Fingerabdruck erstellen. Diesen könnte man dann mit dem DNA-Profil von verdächtigen Personen vergleichen. Gleicht das Bandenmuster des Haars dem eines Verdächtigen, so ist der Täter mit großer Sicherheit überführt. Die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Personen bei den untersuchten Introns exakt die gleiche Anzahl an STR-Wiederholungen haben, ist sehr gering. Damit ist das DNA-Profil fast so einzigartig wie ein Fingerabdruck (Abbildung 8). Sequenzanalyse nach Sanger Diese Methode wird im Skript Hinweise auf die Evolution nochmals etwas genauer behandelt Abbildung 9: Fingerabdruck Quelle: wikipedia.org - wilfredor (CC BY-SA 3.0) Bei der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger kann eine genaue Nukleotidabfolge abgelesen werden, wohingegen beim genetischen Fingerabdruck ausschließlich die Länge der DNA-Stücke ermittelt wird (= Fragmentlängenanalyse). Bei Sangers Methode wird die DNA in ihre beiden Einzelstränge aufgetrennt. Dann wird nur mit einem der beiden komplementären Stränge weitergearbeitet. Vier dieser identischen Einzelstränge werden in vier Versuchsansätzen benötigt. Ein Versuchsansatz enthält jeweils: einen Einzelstrang einen Primer vier verschiedene Nukleotide (Desoxyadenosintriphosphat (datp), Desoxyguanosintriphosphat (dgtp), Desoxycytidintriphosphat (CdTP) und Desoxythymidintriphosphat (dttp)) die DNA-Polymerase und eine fluoreszierende Base als Abbruchnuklid (entweder fluoreszierendes Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin). Zu Beginn des Versuchs lagert sich der Primer am 3' Ende des DNA-Einzelstrangs an. Er bildet den Startpunkt für die DNA-Polymerase, die dann mit Hilfe von freien Nukleotiden beginnt, den fehlenden Einzelstrang zu synthetisieren. Sobald aber eine fluoreszierende Base eingebaut wird, wird die DNA-Synthese abgebrochen. So wird zum Beispiel im ersten Versuchsansatz mit einer fluoreszierenden Adenin-Variante als Abbruchnukleotid der DNA-Strang immer dann abgebrochen, sobald ein Nukleotid mit dem fluoreszierenden Adenin anstatt des normalen Adenins aus dem Nukleotid datp eingebaut wird. Der Einbau der Abbruchnukleotide erfolgt dabei rein zufällig. Es entstehen unterschiedlich lange DNA-Fragmente, die je nach Versuchsansatz entweder bei fluoreszierenden Adenin-, Guanin-, Cytosin- oder Thyminbasen abgebrochen werden. In einem letzten Schritt, der Gelelektrophorese, werden die Fragmente der Länge nach sortiert. Kurze DNA-Fragmente wandern weit weg vom Startpunkt, lange Fragmente bleiben nahe des Startpunktes. Zum Schluss kann die Basensequenz abgelesen werden, dabei beginnt man gegenüber dem Startpunkt. Die folgende Abbildung 9 zeigt das Verfahren noch einmal schematisch:

8 (C) SchulLV 8 von 8 Abbildung 10: Sequenzanalyse nach SANGER Quelle: modifiziert nach wikipedia.org - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0)

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