Gebrauchsanleitung ChromoQuant QF-PCR Kit P/N

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1 Gebrauchsanleitung ChromoQuant QF-PCR Kit P/N ChromoQuant Das ChromoQuant in vitro Diagnose-Set QF-PCR 1 zur Analyse von häufigen chromosomalen Erkrankungen der Chromosomen 13, 18 und u Siehe Verpackung Siehe Verpackung C -18 C Vorsichtsmaßnahmen Zur Verwendung mit fluoreszierenden Sequenzern, welche das Filter-Set D für Applied Biosystems ABI PRISM 3100, 310, Genetic Analyzers, und das Filter-Set 2 für Amersham Biosciences MegaBACE 500/1000 unterstützen. Stellen Sie sicher, dass Ihr Sequenzer die Fluoreszenzmarkierungen 6-FAM, HEX und NED unterstützt. Dieses Set wird für die Verwendung mit DNS empfohlen, die aus Fruchtwasser, Mundabstrichen, Speichelflüssigkeit oder Blut gewonnen wurde. Wenn Sie nicht die empfohlene Tag-Polymerase verwenden, kann die Funktion des Sets nicht garantiert werden. Die Tag-Polymerase ist NICHT im Set enthalten! Verwenden Sie immer > 15 ng - < 150 ng DNS pro PCR-Probe, um erstklassige Ergebnisse zu erhalten Um ein optimales PCR-Ergebnis zu erhalten, befolgen Sie die Anweisungen, die für das verfügbare PCR-Gerät angegeben sind. Zerstörte PCR-Caps müssen vor der PCR-Amplifizierung ersetzt werden. Blutbefleckte Patientenproben sollten mit diesem Set nicht analysiert werden, wenn z.b. DNS aus dem Fruchtwasser verwendet wird! Um Kreuzkontaminationen während des PCR-Setups zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Sie für jede Vertiefung in der Mikrotiterplatte, die mit DNS gefüllt werden soll, eine neue Pipettenspitze verwenden. Salz wird die Fragmentauftrennung während der Gelelektrophorese störend beeinflussen. Wir empfehlen nach der PCR eine Entsalzung. Die Qualität von Formamid oder Wasser, das der DNS-Probe vor dem Laden oder der elektrokinetischen Injektion hinzugefügt wird, beeinflusst die Empfindlichkeit. Stellen Sie sicher, dass Sie die beste Qualität verwenden. Reagenzien für die Reinigung von genomischer DNS sind nicht im Set enthalten! 1 Der PCR-Prozess wird von den USA-Patenten 4,683,195 und 4,683,202 und ausländischen Äquivalenten im Eigentum von Hoffman-La Roche AB abgedeckt. Der Nutzer muss für die Verwendung der PCR-Technik eine Lizenz von Hoffman-La Roche besitzen. # , Q D02 1/6

2 Zusammensetzung des Sets 6 Streifen mit je 8 Röhrchen. Jedes PCR-Röhrchen enthält ein gebrauchsfertiges Primer-Gemisch, Ein Streifen mit 8 Röhrchen reicht somit zur Bestimmung des Chromosoms 13, 18 und 21 von acht (8) Patienten aus. Kappen für PCR-Streifen. 1X Enzym-Verdünnungspuffer 300 µl in einem Röhrchen mit Schraubverschluss (weiß), (Tris-Puffer, EDTA) 1X QF-PCR-Puffer 1,5 ml in einem Röhrchen mit Schraubverschluss (gelb) (MgCl 2, (NH 4SO 4) 2, dntps, β-mercaptoethanol, Rinderserumalbumin) Anweisungen zur Lagerung und Haltbarkeit nach dem ersten Öffnen Lagern Sie die unbenutzten PCR-Röhrchen mit dem Primer-Gemisch und dem QF-PCR-Puffer dunkel und bei unter -18 C. Der Enzym-Verdünnungspuffer kann bei 20 C bis +8 C gelagert werden. Es wird empfohlen, nicht verwendete Materialien immer in der wiederverschließbaren Original-Folientasche aufzubewahren. Verwenden Sie ggf. Alufolie, um die Röhrchen vor unnötigem Licht zu schützen, wenn Sie z.b. vor der PCR mit dem Set auf dem Labortisch arbeiten. Haltbarkeit: Siehe Verfallsdatum. Zusätzliche, besondere Reagenzien, die vom Nutzer geliefert werden müssen HotStar Taq polymerase, Qiagen #203203, 250U [5 U µl -1 ] Gelelektrophorese fluoreszierender Größenstandard, z.b. ABI GeneScan -500 [ROX] Produkt # oder Amersham Biosciences ET-ROX Produkt# Dies wird der DNS-Probe nach der PCR, aber noch vor der Gelelektrophorese hinzugefügt. Spalten zum Entsalzen des PCR-Produkts vor der kapillaren Gelelektrophorese. Andere Reagenzien zur Reinigung von genomischer DNS. Vorgehensweise DNS-Reinigung und Vorbereitung Reagenzien zur Reinigung von DNS aus menschlichem Gewebe sind NICHT im Set enthalten. Es wird empfohlen, handelsübliche DNA-Vorbereitungstechniken zu verwenden, die eine reine genomische DNS liefern. Ungeachtet der Vorbereitungsmethode muss die DNS mit Hilfe von sterilem Wasser bis auf eine endgültige Konzentration von 1,5-15 ng/µl verdünnt werden. Mehrfache PCR-Amplifizierung von genomischer DNS 1. Tauen Sie den QF-PCR-Puffer und den Enzym-Verdünnungspuffer bei Raumtemperatur auf und stellen Sie sie auf Eis. 2. Bestimmen Sie die Gesamtanzahl der PCR-Röhrchen (N). 3. In einem separaten Polypropylen-Mikroröhrchen (z.b. 1,5 ml Eppendorf Röhrchen) mischen 1,6 µl Enzym-Verdünnungspuffer, 0,4 µl Taq-Polymerase und 13 µl QF-PCR-Puffer multipliziert mit N. Immer etwas mehr vorbereiten. Die PCR-Röhrchen, die im Lieferumfang des Sets enthalten sind, sind in 8-er Streifen angeordnet. In einem Streifen können jeweils 8 Patienten-Proben analysiert werden. Um die besten Ergebnisse zu erhalten, empfehlen wir Ihnen schnell und auf Eis zu arbeiten. 4. Fügen Sie jedem PCR-Röhrchen 15 µl des Hauptgemisches aus Schritt 3 hinzu. 5. Fügen Sie 10 µl der DNS-Probe ( ng) hinzu. Zum Mischen 5x mit der Pipette pumpen. Endgültiges Volumen 25 µl. 6. Klopfen Sie die Röhrchen in den Streifen leicht gegen den Labortisch oder zentrifugieren Sie sie in einer Mikrozentrifuge herunter, um sicherzugehen, dass alle Reagenzien am Boden des PCR-Röhrchens gesammelt sind. 7. Führen Sie sofort die PCR-Amplifizierung durch. # , Q D02 2/6

3 PCR-Protokoll: Die Schritte 2-4 werden 26 mal (Zyklen) durchgeführt. OBS! Schritt 1 Taq Polymerase Schritt Anzahl der Temp. Dauer Zyklen 1 HotStar Taq, Qiagen 1 95 o C 15 Min. 2 Wiederholen o C 30 Sek. 3 " 57 o C 1 Min. 4 " 71 o C 2 Min o C 5 Min o C 1 Std. 7 Halten 4 o C Gelelektrophorese des amplifizierten DNS-Fragments Entsalzen Sie jede PCR-Probe vor der elektrokinetischen Injektion in die Kapillaren einzeln. Führen Sie die Gelelektrophorese gemäß dem Bedienungshandbuch oder dem optimalen Verfahren im Labor für die beste Auflösung der Fragmente zwischen 135 und 500 Nukleotide durch. Einschränkungen der Methode und Leistungscharakteristika Die Markerinformation eines jeden Chromosoms ist 4x redundant (Chr. 13, 18 und 21). Ein analytisches Ergebnis, bei dem zwei der Marker für ein bestimmtes Chromosom informativ sind, sollte als erfolgreich erachtet werden, und kann als diagnostische Indikation verwendet werden. Dieses Set ist nicht dafür bestimmt, zu beurteilen oder zu bestimmen, ob eine Translokation stattgefunden hat, von der die Chromosomen 13, 18 oder 21 betroffen sind. Die Beurteilung eines trisomen Zustandes bei der chromosalen Stufe kann aber trotzdem möglich sein. Das Set darf nicht verwendet werden, um mosaikartige genetische Anomalien (z.b. Loynisation) zu beurteilen. Normal 1:1 Heterozygot Homozygot Nicht-informativ Trisomie 1:1:1 Trisomie 2:1 Das normale Peak-Verhältnis innerhalb einer STR liegt bei 0,8-1,4. Das Trisomie-Peak-Verhältnis liegt bei <0,65 oder >1,8. Der Bereich oder die Höhe des kürzeren Allels geteilt durch den Bereich oder die Höhe des längeren Allels. Allelenverhältnisse, die in die normalen und anormalen Bereiche fallen, werden als nicht beweiskräftig eingestuft und müssen erneut analysiert werden. Wenn man für ein Chromosom sowohl anormale als auch normale Allelenmuster erhält, ist es nicht zulässig, das Endergebnis als normal oder anormal einzustufen. Es müssen Folgestudien durchgeführt werden. Für genaue Informationen bezüglich der Interpretation von Ergebnissen beziehen Sie sich bitte auf das Benutzerhandbuch für ChromoQuant. Das Benutzerhandbuch kann auf der ChromoQuant-Website heruntergeladen werden oder direkt bei CyberGene AB angefordert werden. Produkt# # , Q D02 3/6

4 ChrommoQuant P/N Marker Identitet Stelle Chr. Grösse bp Farbe Fluoreszenzmarkierung E D13S742 13q Grün HEX G D13S634 13q Blau 6-FAM H D13S628 13q Gelb NED I D13S305 13q Grün HEX B D18S391 18p Grün HEX C2 D18S976 18p Blau 6-FAM F D18S386 18q Grün HEX J D18S535 18q Blau 6-FAM L D21S11 21q Gelb NED N D21S q Blau 6-FAM M D21S q Blau 6-FAM S D21S q Gelb NED B S M L E N F G H J C2 I Kit P/N Röhrchen / Farbe Chromosom QF-PCR Puffer Enzyme Verd. Puffer u 48 / Amber 13, 18, X, Y / Blau 21, X, Y / Rot / Violet / Gelb / Grün X, Y u 48 / Blau 13, 18, # , Q D02 4/6

5 ChromoQuant Kit Lösung 1 - Amber AMEL Xp X/Y (AMEL) - x: Grün HEX Xp22.1 Yp11.2 y: D18S391 18p Tetra Grün HEX D18S976 18p Tetra Blau 6-FAM XHPRT Xq26.1 X Tetra Blau 6-FAM D13S742 13q Tetra Grün HEX D18S386 18q Tetra Grün HEX D13S634 13q Tetra Bleu 6-FAM D13S628 13q Tetra Gelb NED D13S305 13q Tetra Grün HEX D18S535 18q Tetra Blau 6-FAM Lösung 2 - Blau DXS6854 Xq26.1 X Tetra Blau 6-FAM DXS6803 Xq21.31 X Tetra Grün HEX D21S q Tetra Gelb NED SRY Yp11.31 Y (SRY) Blau 6-FAM X22 Xq28Yq X/Y Penta Grün HEX D21S11 21q Tetra Gelb NED D21S q Tetra Grün HEX D21S q Tetra Gelb NED D21S q Tetra Blau 6-FAM D21S q Tetra Grün HEX # , Q D02 5/6

6 ChromoQuant P/N Chromosome PCR-Röhrchen (Rot) D13S762 13q tetra Green HEX D13S252 13q tetra Blue 6-FAM ChromoQuant P/N Chromosome PCR-Röhrchen(Violett) D18S878 18q tetra Green HEX D18S p tetra Blue 6-FAM ChromoQuant P/N Chromosome PCR-Röhrchen (Gelb) D21S q tetra Green HEX D21S q tetra Blue 6-FAM D21S q tetra Green HEX CyberGene AB, Box 30057, Stockholm # , Q D02 6/6