Analytik Jena bio solutions bietet ein umfassendes Angebot an Kits zur Nukleinsäure-Aufreinigung, für Enzyme, Reagenzien und auch für Additive an.

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1 Analytik Jena bio solutions bietet ein umfassendes Angebot an Kits zur Nukleinsäure-Aufreinigung, für Enzyme, Reagenzien und auch für Additive an. Kits für die Proteinanalyse und molekulare Diagnostik? Auch das haben wir selbstverständlich in unserem Produktangebot.

2 1.0 Reagenzien rapidpcr Reagenzien Polymerasen für rapidpcr rapidpcr Optimierungskits rapidpcr Ready-to-use Kits Standard PCR Reagenzien Polymerasen für PCR Standard PCR ready-to-use Kits Enzyme für RT-PCR Reagenzien und Additive Desoxynukleotide (dntp s) DNA Leitern und Ladepuffer Nukleinsäureaufreinigung mittels Homogenisatoren innuspeed Kits innuspeed DNA Kits innuspeed RNA Kits innuspeed Lysis Tubes Magnetpartikelbasierende Nukleinsäureextraktion Extraktionskits für den InnuPure C Extraktionskits für die KingFisher -Systeme 1.0 Reagenzien Inhaltsverzeichnis Isolierung/Aufreiniging Isolierung genomischer DNA Cleanup-Produkte Isolierung von plasmid DNA Isolierung von total RNA Isolierung mikrobieller DNA oder RNA Kundenspezifi sche Extraktionsreagenzien Molekulare Diagnostik rapidstripe-systeme

3 rapidpcr Reagenzien Polymerasen für rapidpcr 1.1 rapidpcr Reagenzien Einfachste PCR Optimierung 1.0 Reagenzien rapidpcr Reagenzien Neu entwickelte PCR-Systeme und speziell rapidpcrs im SpeedCycler 2 und AlphaSC, die zum Teil in 8 Minuten ablaufen, müssen entsprechend optimiert werden, um eine hohe Ausbeute und zusätzlich hochspezifische Amplifikate zu erhalten. Hierfür bietet Analytik Jena ein beispielloses Tool für die einfachste und schnellste Adaption der PCR Bedingungen: das SpeedTaq oder das SpeedTaq Hot Optimization Set. Jedes Optimierungsset beinhaltet eine Auswahl an 10 verschiedenen PCR-Puffern und eine Polymerase (Standard oder Hot Start), die speziell auf die rapidpcr optimiert ist. Für die bestmögliche Optimierung werden die Puffer mit ph 8 und ph 9 geliefert. Das typische Ausmaß, das nötig ist, um optimale PCR-Bedingungen zu finden (Arbeitsaufwand und Komplexität eingeschlossen), kann nun ohne Probleme und ohne Qualitätsverlust auf ein Minimum reduziert werden. Optimization Buffer Set ph ph Master Mix aus Wasser, dntp s, Template, Primern und SpeedTaq oder SpeedTaq HOT DNA Polymerase rapidpcr mittels SpeedCycler 2 oder AlphaSC Nur wenige Schritte sind nötig, um die erwarteten Ergebnisse zu erhalten: Schritt 1. Vorbereitung des PCR Master Mixes bestehend aus Wasser, dntp s, DNA Target, sequenzspezifischen Primern und dem entsprechenden Enzym (SpeedTaq oder SpeedTaq HOT DNA Polymerase) Schritt 2. PCR Lauf der Proben mit jedem der 10 verschiedenen SpeedAmp Puffern Schritt 3. Gelelektrophorese und Auswertung der Ergebnisse: die Bande, welche die höchsten Ausbeute und beste Spezifität zeigt, entspricht den optimalen PCR-Bedingungen Schritt 4. Bestellung der SpeedTaq DNA Polymerase oder SpeedTaq HOT DNA Polymerase inklusive dem ermittelten Puffer: einfach den entsprechenden Puffer aus der Liste der 10x SpeedAmp Optimization Buffer (einzeln) auswählen und zur Bestellung hinzufügen Reihe C: Puffer 1 5 ph 8, Reihe E: Puffer 1 5 ph 9

4 15 SpeedTaq Optimization Set ph 8 ph 9 M M M M SpeedTaq HOT Optimization Set ph 8 ph 9 M M M M Auswertung der Ergebnisse in Abhängigkeit der gezeigten Beispiele SpeedTaq Optimization Set: Puffer 3 ph 9 ergab die beste Spezifität und Qualität der erwarteten PCR-Produkte. Somit erfolgt die nachstehende Bestellung: : 845-EZ SpeedTaq DNA Polymerase (500 U) inklusive : 845-AK Buffer 3, ph 9 (1 ml) SpeedTaq HOT Optimization Set: Puffer 1 ph 8 ergab die beste Spezifität und Qualität der erwarteten PCR-Produkte. Somit erfolgt die nachstehende Bestellung: : 845-EZ SpeedTaq HOT DNA Polymerase (500 U) inklusive : 845-AK Buffer 3, ph 9 (1 ml) Mehr Informationen zu den Polymerasen finden sie in der Produktbeschreibung der SpeedTaq DNA Polymerase (: 845-EZ ) und der SpeedTaq HOT DNA Polymerase (: 845-EZ ). 1.0 Reagenzien rapidpcr Reagenzien Amplifikation eines 1 kb Fragmentes mit dem SpeedTaq Optimiziation Set und dem SpeedTaq HOT Optimiziation Set im Vergleich. Das gesamte Experiment konnte in unter 20 Minuten beendet werden. Die Größe der Marker sind 1500, 850, 400, 200 und 50 bp. SpeedTaq Optimization Set 845-EZ Units SpeedTaq DNA Polymerase (5 U/μl) 10x SpeedAmp Optimization Buffer Kit (10 x 0,1 ml) Konzentration*: 5 U/μl Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,0, 100 mm KCl, 1 mm DTT, 0,1 mm EDTA, 0,5 % Tween 20, 0,5 % Nonidet P40, 50 % Glycerol. 10x SpeedAmp Buffer Optimization Kit: Puffer 1 5 (ph 8 und ph 9), 0,1 ml (je) MgCl2 ist bereits im gewählten Puffer vorgelegt, somit ist keine separate Zugabe notwendig Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. SpeedTaq HOT Optimization Set 845-EZ Units SpeedTaq HOT DNA Polymerase (5 U/μl) 10x SpeedAmp Optimization Buffer Kit (10 x 0,1 ml) Konzentration*: 5 U/μl Enzymelagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,0, 100 mm KCl, 1 mm DTT, 0,1 mm EDTA, 0,5 % Tween 20, 0,5 % Nonidet P40, 50 % Glycerol. 10x SpeedAmp Buffer Optimization Kit: Puffer 1 5 (ph 8 und ph 9), 0,1 ml (je) MgCl2 ist bereits im gewählten Puffer vorgelegt, somit ist keine separate Zugabe notwendig Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. * Eine Unit ist definiert als die an benötigtem Enzym, welche die Umsetzung von 10 nmol dntp s in eine Polynukleotidfraktion in 30 minuten bei 70 C katalysiert.

5 Polymerasen für rapidpcr SpeedTaq DNA Polymerase 1.0 Reagenzien rapidpcr Reagenzien 845-EZ Optimal für rapidpcr Enorme Amplifikationsgeschwindigkeit von 200 bp/s Einfache Handhabung und applikativ bewährt Extrem thermostabil Beste reproduzierbare Ergebnisse 500 Units Die SpeedTaq DNA Polymerase ist speziell auf extrem schnelle PCR optimiert. Die Elongationszeiten können aufgrund der hohen Amplifikationsgeschwindigkeit von 200 bp/s auf ein Minimum reduziert werden, wodurch sich wiederum die Gesamtlaufzeit der PCR erheblich verkürzt. Die SpeedTaq DNA Polymerase ist ein Gemisch aus einer Taq Polymerase (ultrapure) mit einer zweiten thermostabilen Polymerase. Diese Kombination garantiert äußerste Reinheit, Reproduzierbarkeit und Stabilität. Dementsprechend ist die SpeedTaq DNA Polymerase optimal für Amplifikationen mittels rapidpcr Thermocyclern, wie dem AlphaSC oder SpeedCycler² der Analytik Jena, geeignet. Konzentration*: 5 U/μl Lagerungspuffer des Enzyms: 20 mm Tris-HCl ph 8,0; 100 mm KCl; 1 mm DTT; 0,1 mm EDTA; 0,5 % Tween 20; 0,5 % Nonidet P40; 50 % Glycerol. PCR-Puffer: 10x SpeedAmp Buffer (1 ml). Der entsprechende Puffertyp ist vorher mittels SpeedTaq Optimization Set (Order Nr: 845-EZ ) zu ermitteln, wie auf Seite 14 beschrieben. Die SpeedAmp Puffer enthalten bereits eine optimierte an MgCl2, so dass keine zusätzliche Zugabe nötig ist. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. SpeedTaq HOT DNA Polymerase 845-EZ Units Die SpeedTaq HOT DNA Polymerase ist speziell auf rapidpcr optimiert, bietet jedoch zusätzlich eine verbesserte Spezifität und Sensitivität, wenn low-copy-number Targets in einen komplexen Hintergrund amplifiziert werden sollen oder wenn eine verlängerte Vorbereitung bei Raumtemperatur benötigt wird. Aufgrund der hohen Amplifikationsrate von 200 bp/s kann die Elongationszeit und somit die Gesamtreaktion auf ein Minimum reduziert werden. Die Aktivität der Polymerase ist bei Raumtemperatur inhibiert und wird automatisch während der Heizphase auf die initiale Denaturierung der Probe»angeschalten«. Diese thermische Aktivierung verhindert die Extension unspezifisch angelagerter Primer und die Primer-Dimer Bildung während der geringen Temperaturen der PCR-Vorbereitung. Dadurch ist die Polymerase optimal für die Anwendungen in rapid Thermocyclern, wie dem AlphaSC oder dem SpeedCycler 2 der Analytik Jena geeignet. Das Enzym besitzt eine magnesiumabhängige 5 3 Polymeraseaktivität und eine 5 3 Exonukleaseaktivität, hat aber keine 3 5 Exonukleaseaktivität. Optimal für rapidpcr Enorme Amplifikationsgeschwindigkeit von 200 bp/s High-fidelity kombiniert mit verbesserter Hot Start Spezifität Ermöglicht PCR-Vorbereitung bei Raumtemperatur Keine unspezifischen Nebenprodukte Sehr hohe Spezifität und PCR-Sensitivität Extrem thermostabil Aktivierung: Die SpeedTaq HOT DNA Polymerase benötigt keinen verlängerten Heiz- oder Denaturierungsschritt. Der inhibierende Ligand wird direkt durch die ansteigende Cycler- Temperatur von der Polymerase abgespalten. Konzentration*: 5 U/μl Lagerungspuffer des Enzyms: 20 mm Tris-HCl ph 8,0; 100 mm KCl; 1 mm DTT; 0,1 mm EDTA; 0,5 % Tween 20; 0,5 % Nonidet P40; 50 % Glycerol. PCR-Puffer: 10x SpeedAmp Buffer (1 ml). Der entsprechende Puffertyp ist vorher mittels SpeedTaq HOT Optimization Set (Order Nr: 845-EZ ) zu ermitteln, wie auf Seite 14 beschrieben. Die SpeedAmp Puffer enthalten bereits eine optimierte an MgCl2, so das keine zusätzliche Zugabe nötig ist. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. * Eine Unit ist definiert als die an benötigtem Enzym, welche die Umsetzung von 10 nmol dntp s in eine Polynukleotidfraktion in 30 minuten bei 70 C katalysiert.

6 1.1.2 rapidpcr Optimierungskits 17 10x SpeedAmp Optimization Buffer Kit 845-AK AK AK x 0,10 ml 10 x 0,25 ml 10 x 0,50 ml Die rapidpcr erlaubt vollständige Amplifikationen innerhalb von 8 Minuten. Dies stellt eine enorme Herausforderung für jede Taq Polymerase dar. Für die Optimierung der Taq Funktion in einem rapidpcr Thermocycler wurde eine spezielle Pufferlinie entwickelt. Der Kit enthält eine Auswahl an 10 verschiedenen Puffern, aus welchen der Beste für die jeweilige Anwendung zu ermitteln ist. Der optimale Puffertyp ist anschließend separat erhältlich. Um die Optimierung so effektiv, wie möglich zu gestalten, sind die verschiedenen Puffertypen mit ph 8 und ph 9 in einem Set enthalten. Die SpeedAmp Puffer enthalten bereits eine optimierte an MgCl2, so dass keine zusätzliche Zugabe nötig ist. Eine Optimierungsreaktion mit jeweils allen Puffern erlaubt eine schnelle Auswahl der optimalen PCR-Bedingungen für das jeweilige PCR-System. Hinweis: Die Optimierungspuffer enthalten bereits MgCl2. Jeder SpeedAmp Optimization Buffer Kit enthält 5 verschiedene 10x Puffer ph 8 und 5 verschiedene 10x Puffer ph Reagenzien rapidpcr Reagenzien Einfache PCR Optimierung mittels SpeedCycler Die Amplifikation eines E. coli rrna Gens mittels SpeedAmp Optimization Buffer Kit (Puffer 1 5, ph 8) zeigt beispielhaft die typischen Ergebnisse eines ersten rapidpcr Laufes. Die Ausbeute der mit Puffer 1 und 2 amplifizierten Fragmente ist hierbei eher gering. Die Amplifikationen mit Puffer 4 und 5 führen zu unspezifischen Nebenprodukten. Resultierend ist Puffer Nr. 3 optimal für diese Applikation. Die mitgeführte Negativkontrolle ist in Lane 1 zu sehen und bestätigt die erwarteten PCR-Ergebnisse. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 10x SpeedAmp Optimization Buffer (einzeln) für 0,5 ml für 1,0 ml Produkt/Beschreibung 845-AK AK Buffer 1, ph AK AK Buffer 1, ph AK AK Buffer 2, ph AK AK Buffer 2, ph AK AK Buffer 3, ph AK AK Buffer 3, ph AK AK Buffer 4, ph AK AK Buffer 4, ph AK AK Buffer 5, ph AK AK Buffer 5, ph 9

7 rapidpcr Ready-to-use Kits Speed ready mix 1.0 Reagenzien rapidpcr Reagenzien 845-RM für 100 Reaktionen á 15 μl für 60 Reaktionen á 25 μl Der Speed ready mix ist ein PCR Master Mix, der aus einem für die rapidpcr optimierten Puffer, einer optimalen MgCl2 und den dntp s (datp, dctp, dttp, dgtp) besteht. Daher bietet der Speed ready mix eine vereinfachte und schnellere Präparation eines PCR-Ansatzes. Ein höherer Probendurchsatz mittels AlphaSC oder SpeedCycler 2 wird ohne einen Verlust der PCR-Qualität und Ausbeute problemlos ermöglicht. Zusätzlich kann der Speed ready mix als passender Puffer/dNTP-Mix auch für Real-Time Assays ohne Uracil-DNA Glycosylase genutzt werden. Die zur Verfügung gestellte des Speed ready mixes ist ausreichend für ca. 100 Reaktionen zu je 15 μl oder für ca. 60 Reaktionen zu je 25 μl. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Speed ready mix plus 845-RM für 100 Reaktionen á 15 μl für 60 Reaktionen á 25 μl Der Speed ready mix plus ist ein PCR Master Mix, der aus einem für die rapidpcr optimierten Puffer, einer optimalen MgCl2, den dntp s (datp, dctp, dttp, dgtp) und einer Taq DNA Polymerase besteht. Daher bietet der Speed ready mix plus eine vereinfachte und schnellere Präparation eines PCR Ansatzes. Ein höherer Probendurchsatz mittels AlphaSC oder SpeedCycler ² wird ohne einen Verlust der PCR-Qualität und Ausbeute problemlos ermöglicht. Zusätzlich kann der Speed ready mix plus als passender Puffer/dNTP-Mix auch für Real- Time Assays ohne Uracil-DNA Glycosylase genutzt werden. Die zur Verfügung gestellte des Speed ready mix plus ist ausreichend für ca. 100 Reaktionen zu je 15 μl oder für ca. 60 Reaktionen zu je 25 μl. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden.

8 1.2 Standard PCR reagenzien 1.2 Standard PCR reagenzien Polymerasen für PCR 19 innutaq DNA Polymerase 845-EZ Optimal für Routine-PCR Einfache Handhabung und applikativ bewährt Extrem thermostabil Beste reproduzierbare Ergebnisse 500 Units Analytik Jena s innutaq DNA Polymerase ist eine hochreine, thermostabile, rekombinante DNA Polymerase. Das Enzym hat eine magnesiumabhängige 5 3 Polymeraseaktivität und eine 5 3 Exonukleaseaktivität, besitzt aber keine 3 5 Exonukleaseaktivität. Die extreme Thermostabilität der Polymerase erlaubt die Inkubation bei anhaltend hohen Temperaturen (95 C). Das Enzym ist für die Anwendung in Routine-Reaktionen empfohlen. Konzentration*: 5 U/μl Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,0; 100 mm KCl; 1 mm DTT; 0,1 mm EDTA; 0,5 % Tween 20; 0,5 % Nonidet P40; 50 % Glycerol PCR Buffer: 10x PCR Buffer mit KCl, 100 mm Tris-HCl (ph 8,8 bei 25 C); 500 mm KCl; 0.8 % Nonidet P40 10x PCR Buffer mit (NH4)2SO4, 750 mm Tris-HCl (ph 8,8 bei 25 C); 200 mm (NH4)2SO4; 0.1 % Tween 20 Mg 2+ Lösung: MgCl2 Stocklösung 25 mm 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. innutaq RED DNA Polymerase 845-EZ Units Die innutaq RED DNA Polymerase ist eine spezielle Formulierung, die einen nicht-toxischen und ungefährlichen roten Farbstoff enthält. Die starke Rotfarbe ermöglicht eine einfache und schnelle Überprüfung der Reaktionen, denen das Enzym zugegeben wurde und erleichtert den Nachweis des vollständigen Mischens. Somit ist die innutaq RED DNA Polymerase sehr gut für Standard-Applikationen geeignet. Die Reaktionsprodukte sind sofort für die Gelbeladung vorbereitet und der Farbstoff dient als Marker für den Fortschritt der Elektrophorese. Die Anwesenheit des Farbstoffs hat dabei keine Auswirkung auf die PCR-Effizienz. Das Enzym hat eine 5 3 DNA Polymerase Aktivität und die extreme Thermostabilität der Polymerase erlaubt die Inkubation bei anhaltend hohen Temperaturen (95 C). Einfache visuelle Erkennung Zeitersparnis Direktes Beladen von Agarosegelen Optimal für Routine-PCR Komfortabel, konsistent und bewährt Konzentration*: 1 U/μl Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,0; 100 mm KCl; 1 mm DTT; 0,1 mm EDTA; 0,5 % Tween 20; 0,5 % Nonidet P40; 50 % Glycerol. PCR-Puffer: 10x KCl Reaktionspuffer, ohne MgCl2 10x (NH4)2SO4 Reaktionspuffer, ohne MgCl2 Mg 2+ Lösung: MgCl2 Stocklösung, 25 mm Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. * Eine Unit ist definiert als die an benötigtem Enzym, welche die Umsetzung von 10 nmol dntp s in eine Polynukleotidfraktion in 30 minuten bei 70 C katalysiert

9 Polymerasen für PCR innutaq HOT-A DNA Polymerase 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien 845-EZ High-fidelity kombiniert mit verbesserter Hot Start Aktivität Vorteilhafte PCR-Vorbereitung bei Raumtemperatur Kein ungewollten Nebenprodukte, reduzierter Background Sehr gute Spezifität und PCR-Sensitivität 500 Units Die innutaq HOT-A DNA Polymerase bietet eine verbesserte Spezifität und Sensitivität, wenn low-copy-number Targets in einen komplexen Hintergrund amplifiziert werden sollen oder wenn eine verlängerte Vorbereitung bei Raumtemperatur benötigt wird. Aufgrund der hohen Amplifikationsrate von 200 bp/s kann die Elongationszeit und somit die Gesamtreaktion auf ein Minimum reduziert werden. Die Aktivität der Polymerase ist bei Raumtemperatur inhibiert und wird automatisch während der initialen Denaturierung der Probe»angeschalten«. Diese thermische Aktivierung verhindert die Extension unspezifisch angelagerter Primer und die Primer-Dimer-Bildung während der geringen Temperaturen der PCR-Vorbereitung. Dadurch ist die Polymerase optimal für die Anwendungen in rapid Thermocyclern, wie dem AlphaSC oder dem SpeedCycler² der Analytik Jena geeignet. Das Enzym besitzt eine magnesiumabhängige 5' 3' Polymeraseaktivität und eine 5' 3' Exonukleaseaktivität, hat aber keine 3' 5' Exonukleaseaktivität. Konzentration*: 5 U/μl Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl; 100 mm KCl; 0,1 mm EDTA; 1 mm DTT; 0.5 % Tween 20; 0.5 % Nonidet P40; 50 % (v/v) Glycerol; ph 8,0 (25 C) PCR Buffer: 10x Hot Start Buffer komplett, 200 mm Tris-HCl (ph 8,5 bei 25 C); 500 mm KCl; 15 mm MgCl2 10x Hot Start Buffer ohne MgCl2, 200 mm Tris-HCl (ph 8,5 bei 25 C); 500 mm KCl Mg 2+ Lösung: MgCl2 Stocklösung 25 mm Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. innutaq Long Range DNA Polymerase 845-EZ Units Die innutaq Long Range DNA Polymerase ist ein Gemisch aus einer ultrapuren Taq Polymerase mit einer zweiten thermostabilen Polymerase. Das Enzym ist optimiert für die Amplifikation langer DNA Templates. Durch die Verwendung der innutaq Long Range DNA-Polymerase, ist eine erheblich bessere Genauigkeit im Vergleich zu anderen Standard Taq DNA- Polymerasen möglich. Vorteilhafte und bewährte Amplifikation von langen DNA Templates Längere und genauere Amplifikation Extrem thermostabil Reproduzierbare Ergebnisse Konzentration*: 5 U/μl Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,0; 100 mm KCl; 1 mm DTT; 0,1 mm EDTA; 0,5 % Tween 20; 0,5 % Nonidet P40 und 50 % Glycerol PCR Buffer: 10x PCR Buffer mit KCl, 100 mm Tris-HCl (ph 8,8 bei 25 C); 500 mm KCl; 0,8 % Nonidet P40 10x PCR Buffer mit (NH4)2SO4, 750 mm Tris-HCl (ph 8,8 bei 25 C); 200 mm (NH4)2SO4; 0,1 % Tween 20 Mg 2+ Lösung: MgCl2 Stocklösung 25 mm Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden.

10 21 innutaq TITAN DNA Polymerase 845-EZ Units Die innutaq TITAN DNA Polymerase ist eine hocheffiziente, thermostabile DNA-Polymerase. Dank ihrer genetischen Modifikation, ist die Polymerase bei Raumtemperatur besonders stabil und behält ihre Aktivität unter diesen Bedingungen bis zu 1 Monat. Praktische und zuverlässige Amplifizierung von schwierigen DNA Proben (z. B. GC-reiche Bereiche) Hochstabiles Enzym: 1 Monat bei Raumtemperatur, 24 Monate bei 20 C Empfohlen für einen weiten Bereich an PCR Anwendungen und TA-Klonierung Das Enzym besitzt eine 5 3 Exonukleaseaktivität und hat keine 3 5 Exonukleaseaktivität. Die Polymerase ist anwendbar für ein weites Feld von PCR Assays und auch für die TA-Klonierung. Konzentration*: 5 U/μl Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,7; 100 mm KCl; 0,1 mm EDTA; 50 % Glycerol, Stabilisatoren PCR Buffer: 10x PCR Buffer 1 (ohne Mg 2+ ), 750 mm Tris-HCl, 200 mm (NH4)2SO4, 0.2 % Tween 20 10x PCR Buffer 2 (ohne Mg 2+ und Detergenzien), 750 mm Tris-HCl, 200 mm (NH4)2SO4 Mg 2+ Lösung: MgCl2 Stocklösung 25 mm 10x Enhancer 1: Additivum für die Amplifikation schwieriger Templates (z. B. GC-reiche Regionen) Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien * Eine Unit ist definiert als die an benötigtem Enzym, welche die Umsetzung von 10 nmol dntp s in eine Polynukleotidfraktion in 30 minuten bei 70 C katalysiert

11 Standard PCR ready-to-use Kits PCR ready mix 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien 845-RM PCR ready mix plus 845-RM für 200 Reaktionen á 25 μl für 100 Reaktionen á 55 μl Der PCR ready mix ist ein PCR Master Mix, der aus einem für die PCR optimierten Puffer, einer optimalen Konzentration MgCl2 und den dntp s (datp, dctp, dttp, dgtp) besteht. Der PCR ready mix bietet eine vereinfachte und schnellere Präparation eines PCR- Ansatzes. Es wird ein erhöhter Probendurchsatz mit einem handelsüblichen Thermocycler erreicht, ohne auf die Qualität und Ausbeute der PCR-Produkte zu verzichten. Die zur Verfügung gestellte des Speed ready mixes ist ausreichend für ca. 200 Reaktionen zu je 25 μl oder für ca. 100 Reaktionen zu je 50 μl. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. für 200 Reaktionen á 25 μl für 100 Reaktionen á 55 μl Der PCR ready mix plus ist ein PCR Master Mix, der aus einem für die PCR optimierten Puffer, einer optimalen Konzentration MgCl2, den dntp s (datp, dctp, dttp, dgtp) und einer DNA-Polymerase besteht. Der PCR ready mix plus bietet eine vereinfachte und schnellere Präparation eines PCR- Ansatzes. Es wird ein erhöhter Probendurchsatz mit einem handelsüblichen Thermocycler erreicht, ohne auf die Qualität und Ausbeute der PCR-Produkte zu verzichten. Die zur Verfügung gestellte des Speed ready mixes ist ausreichend für ca. 200 Reaktionen zu je 25 μl oder für ca. 100 Reaktionen zu je 50 μl. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden.

12 1.2.3 Enzyme für RT-PCR 23 innuscript Reverse Transcriptase ist eine gentechnisch veränderte Version der MMLV Reverse Transcriptase. Durch die gentechnische Veränderung besitzt das Enzym eine verbesserte Spezivität und Aktivität bei der cdna-synthese und das in einem breiten Temperaturspektrum von 42 C bis 55 C. Darüber hinaus weist die innuscript Reverse Transcriptase im Vergleich zu herkömmlichen Enzymen eine erhöhte Ausbeute bei der cdna-synthese und liefert ausgezeichnete Ergebnisse bei einer RT-PCR ( Abb. 1,2). Die innuscript Reverse Transcriptase wurde für die cdna- Synthese unterschiedlicher RNA-Ausgangsproben mit Produktgrößen von 0,5 bis 9,0 kb getestet. innuscript Reverse Transcriptase wurde negativ auf detektierbare Endonuklease-, Exonuklease- und RNase-Aktivität getestet. 9 kb 6 kb 1 kb 0,5 kb Temperatur C Abb. 1: 1 3 innuscript Reverse Transcriptase, 4 6 und 7 9 MMLV Reverse Transkriptasen von unterschiedlichen Anbietern A B Temperatur ( C) RNA Ct (drn) 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien Fluoreszenz (drn) Zyklen ng NTC No Ct ng NTC No Ct ng NTC No Ct Abb. 2: Die cdna Synthese aus der gesamt RNA mit oligo-dt-primer wurde bei unterschiedlichen Reaktionstemperaturen (42 C, 50 C, and 55 C) durchgeführt. Die Templatemenge ist die der gesamt RNA, die zur cdna-synthesereaktion zugefügt wurde (100 ng, 10 ng, 1 ng). Die qpcr des ODC-Gens mittels Brilliant SYBR Green qpcr Master Mix (Stratagene) zeigt, dass die jeweiligen RNA n gleiche Ct-Werte unabhängig von der RT-Inkubationstemperatur liefern (Feld A), z. B. 100 ng RNA haben für 42 C Ct = 19,27; für 50 C Ct = 19,30; für 55 C Ct = 19,44 (Feld B). innuscript Reverse Transcriptase 845-EZ EZ EZ Reaktionen NEU Enzymlagerungspuffer: 20 mm Tris-HCl ph 8,0; 0,1 mm EDTA; 1 mm DTT; 0,01 % Igepal CA-630; 0,1 M NaCl; 50 % Glycerol PCR Buffer: 10x RT-PCR Buffer, 500 mm Tris-HCl (ph 8,3 bei 25 C); 750 mm KCl; 30 mm MgCl2 DTT Lösung: DTT Stocklösung, 100 mm

13 Reagenzien und Additive 25 mm MgCl2 Lösung 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien 845-AS x SuperAmp Additive 845-AS x 1,5 ml 25 mm MgCl2 Stocklösung für die Polymerase Kettenreaktion. Die MgCl2-Konzentration muss in Abhängigkeit der PCR-Bedingungen (Taq Polymerase, Primer, Template usw.) optimiert werden. 1,0 ml Das 5x SuperAmp Additive ist ein thermostabiler, chemisch inerter, niedrigmolekularer Zusatz, der aus thermostabilen Mikroorganismen isoliert wurde. Durch eine Stabilisierung der nativen Konformation des Enzyms oder einer Enzymmischung in vitro, erlaubt das 5x SuperAmp Additive eine höhere Ausbeute und einen reduzierten Background. Das 5x SuperAmp Additive erhöht die Thermostabilität von thermophilen Polymerasen und die Halbwertszeit anderer Enzyme in vitro. Weiterhin verhindert das 5x SuperAmp Additive die vorzeitige Denaturierung von Biomolekülen unter thermischen oder anderen Stressbedingungen. Beim Einsatz in DNA-Polymerase-Assays unterdrückt das 5x SuperAmp Additive die Bildung von Fragmenten mit falscher Primerbindung, Primerdimären und Konkatemeren. Das 5x SuperAmp Additive ist äußerst einfach anzuwenden. Es wird keine zusätzliche Optimierung der PCR-Reaktion benötigt. Das Additiv ist mit allen Kombinationen aus voroptimierten Puffern/Additiven kompatibel. Im Gegensatz zu anderen Zusätzen (DMSO, Formaldehyd) ist das 5x SuperAmp Additive stabil, inert und beeinflusst nicht die strukturelle Integrität der genutzten Enzyme oder Templates. Erhöhung der Thermostabilität und der Halbwertszeit des Enzyms Passend für ein breites Spektrum von Enzymen Sehr einfach in der Anwendung Kompatibel mit den meisten Inkubationspuffern Chemisch inert und hitzestabil Hohe Produktausbeute ohne Background Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 10x PCR- Reaktionspuffer mit NH4 845-AS x 1,5 ml Diese Lösung ist ein 10fach konzentrierter Taq Polymerasen-Puffer für die PCR. Der Puffer wurde für eine Erhöhung der Amplifikationsraten, besonders in Hinsicht auf schwierige und längere Templates, optimiert. Er kann mit allen DNA- Polymerasen der Analytik Jena bio solutions verwendet werden. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden.

14 25 10x PCR Reaktionspuffer mit KCl 845-AS x 1,5 ml Diese Lösung ist ein 10fach konzentrierter Taq Polymerasen-Puffer für die PCR. Der Puffer kann mit allen DNA- Polymerasen der Analytik Jena bio solutions verwendet werden. Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien

15 Desoxynukleotide (dntp s) 50x innucleotide Mix (12,5 mm) 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien 845-AS x 0,5 ml Analytik Jena s ready-to-use Nukleotidmix bietet höchste Qualität für Desoxynukleotide. Alle dntp s sind ultra pure (> 98 %) und wurden mittels PCR, RT-PCR und Klenow Reaktionen qualitätsgeprüft. Der ultra pure Mix aus datp, dctp, dgtp und dttp ist 50fach konzentriert mit 12,5 mm je Nukleotid. Die Gesamtmenge je dntp pro Tube beträgt 25 μmol (6.25 μmol je dntp). Reinheit > 98 % (RP-HPLC) Qualitätskontrolle: Die dntp-lösung hat eine Reinheit von > 98 %, deren Funktionalität RNase-frei, Protease-frei in einer Real-Time-Amplifikation anhand eines 30 kb DNA-Fragmentes getestet wurde. Frei von PCR Inhibitoren Packungsgröße: 2 x 25 μmol Konzentration: 12,5 mm pro dntp Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. innucleotide Set (100 mm; 4 x 25 μmol) 845-AS x 0,25 ml Dieses Set besteht aus 4 separaten 100 mm Lösungen (datp, dgtp, dctp, dttp). Jedes Tube beinhaltet 25 μm (250 μl) des entsprechenden Nukleotids. Reinheit > 98 % (RP-HPLC) RNase-frei, Protease-frei Frei von PCR Inhibitoren Qualitätskontrolle: Die dntp-lösung hat eine Reinheit von > 98 %, deren Funktionalität in einer Real-Time-Amplifikation anhand eines 30 kb DNA-Fragmentes getestet wurde. Packungsgröße: 4 x 25 μmol Konzentration: 100 mm pro dntp Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden.

16 1.2.6 DNA Leitern und Ladepuffer bp DNA Ladder Express. 0,5 μg/lane = 5 μl; 1x TBE Puffer; 1,7 % Agarosegel Die innustar DNA Ladder wurde für eine präzise Größenbestimmung von DNA-Fragmenten im Bereich 100 bis 1000 bp auf einem Agarosegel entwickelt. Diese Leiter wurde zufriedenstellend mit anderen auf dem Markt erhältlichen Produkten verglichen. Die innustar DNA Ladder ist langzeitstabil und liefert leicht zu unterscheidende Banden. Eigenschaften der innustar DNA Ladder: 100 Lanes pro Tube 6 Monate bei 4 C stabil lagerbar Frei von dntp s Im konventionellen oder im Express Format lieferbar Express Leiter kann direkt auf das Gel aufgetragen werden Beinhaltet Banden, die das Vielfache von 100 bp bilden, was leicht zu merken ist Gleichmäßige Banden nach der Färbung mittels Ethidiumbromid Volumen: 500 μl/tube Konzentration: 100 ng/μl Empfohlenes Ladevolumen: 5 μl 1.0 Reagenzien Standard PCR Reagenzien Lagerung bei 20 C, wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. innustar 100 bp DNA Ladder Express 845-ST μl 845-ST x 500 μl innustar 100 bp DNA Ladder 845-ST ST x Loading Dye Bromphenolblue 845-ST μl 5 x 500 μl 6 x 1 ml 6x Loading Dye Orange F 845-ST x 1 ml

17 1.3 Isolierung/Aufreiniging 1.3 Isolierung/Aufreiniging Isolierung genomischer DNA innuprep DNA-Aufreinigungssysteme Einführung 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Die innuprep DNA Aufreinigungssysteme wurden für eine sehr effiziente und schnelle Isolierung von DNA aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien entwickelt. Das Extraktionsverfahren basiert auf einer neuartigen Extraktionschemie, welche die Isolierung genomischer DNA auch aus sehr geringen n an Ausgangsmaterial bei hoher Qualität und Quantität ermöglicht. Das Verfahren gestattet es außerdem, hochgradig degradierte DNA zu isolieren. Dies ist besonders dann wichtig, wenn stark verschmutzte Proben, wie auch sehr limitierte Probenmengen aufgearbeitet werden müssen (z. B. forensische Proben). Die isolierte genomische DNA ist frei von Inhibitoren und kann nach der Extraktion sofort für Downstream Applikationen eingesetzt werden. Das Extraktionsverfahren beinhaltet die Lyse der Probe, die nachfolgende Bindung der genomischen DNA an die Oberfläche einer Spin Filter-Membran, das Waschen der gebundenen DNA und die finale Desorption der DNA von der Oberfläche der Filtermembran. Alle Schritte erfolgen in einer Tischzenrifuge. innuprep Forensic Kit Ausgangsmaterial Blut und Blutspuren Haare, Haarwurzeln und Bartstoppeln Fingernägel Briefmarken und Briefumschläge Zigarettenreste Kaugummi Tupferproben Fingerabdrücke von Oberflächen Spermaspuren Alle diese Proben wurden erfolgreich auf die Extraktion von DNA getestet. Extraktionsdauer Ca. 15 Minuten nach Lyse der Probe Extraktion genomischer DNA aus einer Briefmarke und nachfolgende Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz (DYS458-STR Marker für das Y-Chromosom; humanes GAPDH; D21S14 Marker für Aneuploidie auf Chromosom 21). Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden auf einem Agilent Bioanalyzer analysiert. Allgemeiner Ablauf Lysieren Binden Waschen Eluieren 1 3 Briefmarke (weibliche Markierung) 2 4 Briefmarke (männliche Markierung)

18 29 Extraktion genomischer DNA aus Zigarettenresten und anschließende STR Analyse innuprep DNA Micro Kit Ausgangsmaterial Gewebeproben oder Biopsieproben (max. 5 mg) Paraffinierte Gewebeproben Eukaryotische Zellen (max. 1 x 10 6 ) Vollblut (bis 50 μl) Blut-Sticks Extraktionsdauer Ca. 6 Minuten nach Probenlyse Verhältnis A 260 : A 280 1,7 2,0 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innuprep DNA Micro Kit Extraktion genomischer DNA aus 50 μl Vollblut

19 Isolierung genomischer DNA innuprep DNA-Aufreinigungssysteme 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innuprep DNA Mini Kit Ausgangsmaterial Gewebeproben (bis 50 mg) Mundschleimhautabstriche Paraffinierte Gewebeproben Maus- oder Rattenschwänze (0,5 1,0 cm) Eukaryotische Zellen (max. 5 x 10 6 ) Extraktionsdauer Ca. 15 Minuten nach Probenlyse Ausbeute Abhängig von Art und der Probe; Bindungskapazität der Säule > 100 μg genomische DNA innuprep DNA Mini Kit Extraktion genomischer DNA aus verschiedenen Tupferproben (Mundschleimhautabstriche) und nachfolgende Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz (humanes GAPDH) Verhältnis A 260 : A 280 1,7 2,0 innuprep DNA Kits Überblick Die innuprep DNA Aufreinigungssysteme wurden für eine sehr effiziente und schnelle Isolierung von DNA aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien entwickelt. Das Extraktionsverfahren basiert auf einer neuartigen Extraktionschemie. Das Verfahren kombiniert eine extrem effiziente und schnelle Probenlyse mit nachfolgender Bindung der genomischen DNA an die Oberfläche einer Spin Filter-Membran, das Waschen der gebundenen DNA und die finale Desorption der DNA von der Oberfläche der Filtermembran. Die Ausbeute und Qualität der isolierten DNA ist exzellent. innuprep DNA Micro Kit 845-KS KS KS Für die schnelle und effiziente Isolierung genomischer DNA aus kleinsten n an unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien wie Biopsien, Vollblut bis 50 μl, Blut-Sticks und limitierten n an eukaryotischen Zellen.

20 31 innuprep DNA Mini Kit 845-KS KS KS innuprep Swab DNA Kit 845-KS KS KS Für die schnelle und effiziente Isolierung genomischer DNA aus unterschiedlichen n und unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien wie Gewebeproben (bis 50 mg), paraffinierte Gewebeproben, Tupferproben (Abstriche der Mundschleimhaut), Maus- oder Rattenschwänze, eukaryotische Zellen u. a. 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Für die extrem schnelle und effiziente Isolierung hoher Anteile genomischer DNA aus Abstrichen der Mundschleimhaut. Der Kit enthält neben den Extraktionsreagenzien auch optimierte Tupfer für die Probengewinnung. innuprep Swabs 845-SW Stück Jeder Tupfer ist separat und steril in einem Probengefäß verpackt. Der Tupfer besteht aus einem Holzstab und einem Tupfermaterial aus Baumwolle. Ein Tupfer ist der einfachste Weg für eine Probenentnahme unter Feldbedingungen, wobei unterschiedliche Quellen für die Gewinnung der Mundschleimhautabstriche gewählt werden können. Der Tupfer ist einfach in der Anwendung und ist während des Versandes gegen Kontaminationen geschützt. innuprep DNA/ RNA Mini Kit 845-KS KS KS Für die schnelle und effiziente parallele Isolierung genomischer DNA und zellulärer total RNA aus unterschiedlichen Proben (eukaryotische Zellen, Bakterienzellen, Gewebe). innuprep Forensic Kit 845-KS KS KS Für die schnelle und effiziente Isolierung genomischer DNA aus kleinsten n, auch stark verschmutzter, forensischer Proben. Die Extraktionen wurden erfolgreich für eine Vielzahl an Proben getestet (Blut und Blutspuren, Haare, Haarwurzeln und Bartstoppeln, Fingernägel, Briefmarken, Zigarettenresten, Kaugummi, Tupferproben, Fingerabdrücke auf unterschiedlichen Oberflächen, Spermaspuren). Die neuartige Extraktionschemie erlaubt darüber hinaus auch die Rückgewinnung schon stark degradierter Nukleinsäuren.

21 Isolierung genomischer DNA innuprep DNA Kits Überblick 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innuprep Blood DNA Mini Kit 845-KS KS KS innuprep Blood DNA Midi Kit 845-KS KS KS Für die schnelle und effiziente Isolierung genomischer DNA aus Vollblutproben (1 250 μl). Für die Extraktion genomischer DNA aus Vollblutproben von 0,5 ml bis 2,0 ml. Der Kit kombiniert die selektive Lyse der Erythrozyten, die Pelletierung der kernhaltigen Blutzellen und deren nachfolgende Lyse. Nach selektiver Proteinentfernung mittels eines Präzipitationsschrittes wird die DNA an die Oberfläche einer Spin Filter-Membran gebunden und final von der Filtermembran abgelöst. Das Verfahren nutzt dabei eine standardisierte Tischzentrifuge und arbeitet im»mini-format«. innuprep Blood DNA Master Kit 845-KS KS KS Für die Extraktion genomischer DNA aus Vollblutproben von 0,5 ml bis 5,0 ml. Der Kit kombiniert die selektive Lyse der Erythrozyten, die Pelletierung der kernhaltigen Blutzellen und deren nachfolgende Lyse. Die Lyse erfolgt dabei in einem sogenannten PLP Tube, welches alle Lysereagenzien sowie benötigte proteolytische Enzyme schon in einer lagerstabilen Form enthält. Nach der Probenlyse erfolgt eine selektive Proteinentfernung mittels eines Präzipitationsschrittes. Nachfolgend wird die DNA an die Oberfläche einer Spin Filter-Membran gebunden und final von der Filtermembran abgelöst. Das Verfahren nutzt dabei eine Standard-Tischzentrifuge und arbeitet im»mini-format«. Der Kit erlaubt die Isolierung von bis zu 100 μg genomischer DNA. innuprep Plant DNA Kit 845-KS KS KS Bessere Performance Für die schnelle und effiziente Isolierung genomischer DNA aus unterschiedlichen n und Arten von Pflanzenmaterialien (bis zu 100 mg). Der Kit kombiniert die Probenlyse, die nachfolgende Filtration von unlysierten Komponenten mittels einer Vorfiltersäule und der Bindung der DNA an eine Filtermembran. Nach dem Waschen der gebundenen DNA wird diese dann durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers von der Filtermembran abgelöst.

22 33 blackprep Extraktionskits für komplexe Ausgangsprodukte im Detail Die blackprep Kits sind Kits einer neu entwickelten Produktfamilie zur Isolierung genomischer DNA aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien. Die Extraktion der genomischen DNA basiert auf einer neuartigen patentierten Technologie und kombiniert eine sehr effiziente und schnelle Probenlyse mit der nachfolgenden Anbindung der genomischen DNA an eine Filtersäule. Die gebundene DNA wird gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers von der Säule eluiert. Alle Kits sind für die Isolierung der genomischen DNA aus den jeweiligen unterschiedlichen Ausgangsproben optimiert, um eine hohe Qualität und Ausbeute zu erzielen. blackprep Rodent Tail DNA Kit Der blackprep Rodent Tail DNA Kit ist ein Kit einer neu entwickelten Produktfamilie zur Isolierung genomischer DNA aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien. Der Kit dient der Isolierung genomischer DNA aus Mäuse- oder Rattenschwänzen. Die Extraktion der genomischen DNA basiert auf einer neuartigen patentierten Technologie und kombiniert eine sehr effiziente und schnelle Probenlyse mit der nachfolgenden Anbindung der genomischen DNA an eine Filtersäule. Die gebundene DNA wird gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers von der Säule eluiert. Auf Grund der sehr effizienten Probenlyse ist der Extraktionsprozess innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen. Eine bisher übliche Lyse über Nacht ist nicht mehr notwendig. Schematischer Ablauf Lyse des Maus- oder Rattenschwanz Binden der DNA an den Spin Filter Waschen der gebundenen DNA Eluieren der DNA Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Ausgangsmaterial Ratten- oder Mausschwanz Rattenschwanz: max. 0,6 cm Mausschwanz: 1,2 cm Extraktionszeit inkl. Lyseschritt Ca. 3 Stunden Durchschnittliche Ausbeuten und Qualität Mausschwanz: 1,2 cm: μg Rattenschwanz: 0,6 cm : μg Verhältnis A 260:A 280 1,8 2,0

23 Isolierung genomischer DNA blackprep Extraktionskits für komplexe Ausgangsprodukte im Detail 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Applikationsbeispiel Extraktion genomischer DNA aus Mausschwanz (1,0 cm). Darstellung der extrahierten gdna auf einem 0,8 %igem TAE Agarosegel Lane: 1 DNA-Leiter; 2 11 extrahierte gdna Applikationsbeispiel Extraktion genomischer DNA aus Rattenschwanz (0,5 cm). Darstellung der extrahierten gdna auf einem 0,8 %igem TAE Agarosegel Lane: 1 DNA-Leiter; 2 11 extrahierte gdna blackprep Extraktionskits für komplexe Ausgangsprodukte Überblick blackprep Rodent Tail DNA Kit 845-BP BP BP NEU Für die Isolierung genomischer DNA aus Maus- und Rattenschwänzen. Die Extraktion der genomischen DNA basiert auf einer neuartigen patentierte Technologie und kombiniert eine sehr effiziente und schnelle Probenlyse mit der nachfolgenden Anbindung der genomischen DNA an eine Filtersäule.

24 35 innueasy Kits für die extrem schnelle Nukleinsäureextraktion Beschreibung Die innueasy Kits sind eine neue Produktlinie, welche es Ihnen erlaubt die Nukleinsäureextraktion innerhalb kürzester Zeit zu realisieren. Die sonst notwendigen und separat durchzuführenden Schritte der Nukleinsäureisolation können bei diesen Kits entfallen. Das Verfahren basiert auf einer neuen zum Patent angemeldeten Methode. Diese kombiniert die Lyse der Ausgangsprobe unter Verwendung einer festen Formulierung eines Zweikomponenten Reagenziensystems. Eine aufwendige Isolierung der DNA ist somit nicht mehr notwendig. Das führt dazu, dass die komplette Nukleinsäureextraktion und Amplifikation innerhalb von einer Stunde (Probenlyse und rapidpcr) abgeschlossen werden kann. Der Kit enthält alle Reagenzien für die Probenlyse und die nachfolgende Amplifikation. Applikationsbeispiel Direkte Amplifikation einer human GAPDH spezifischen Sequenz aus 3 μl Speichelproben (1; 2), 1 μl Wangenabstrichen (3; 4), 5 μl Vollblutprobe (5; 6) sowie 1 μl Vollblut (7; 8). Der Master Mix enthält neben der extrahierten DNA den SpeedAmp Ready Mix und innutaq HOT-A Taq DNA Polymerase. 25 μl Probenvolumen wurden nachfolgend im AlphaSC eingesetzt. Lane 1, 2: Speichelprobe (Ausgangsmaterial 3 μl), Lane 3, 4: Wangenabstriche (Ausgangsmaterial 1 μl), Lane 5, 6: Vollblut (Ausgangsmaterial 5 μl), Lane 7, 8: Vollblut (Ausgangsmaterial 1 μl) 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innueasy Direct Amplification Kit A (für rapidpcr) innueasy Direct Amplification Kit A ist ein schnelles und einfaches Verfahren zu Probenlyse und nachfolgenden direkten Amplifikation genomischer DNA aus Vollblut, Speichelproben oder Wangenabstrichen. Das Verfahren basiert auf der Lyse der Ausgangsprobe unter Verwendung einer festen Formulierung eines Zweikomponenten Reagenziensystems. Nach Probenlyse wird die Probe direkt in der Amplifikationsreaktion eingesetzt. Alle Reagenzien sind für die Amplifikation mittels rapidpcr-technologie der Analytik Jena AG optimiert. Eine aufwendige Isolierung der DNA ist nicht notwendig. Das Verfahren benötigt ca. 1 Stunde (Probenlyse und Amplifikation). Der Kit enthält alle Reagenzien für die Probenlyse und die nachfolgende Amplifikation. Leiter LW Kitkomponenten Prep A Tube (grüne Verschlusskappe) Prep B Tube (gelbe Verschlusskappe) innutaq HOT-A DNA Polymerase SpeedAmp Ready Mix Ausgangsmaterial Vollblut Speichelproben Wangenabstriche Extraktionszeit inklusive Lyse Ca. 1 Stunde

25 Isolierung genomischer DNA innueasy für die extrem schnelle Nukleinsäureextraktion Überblick 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innueasy Direct Amplification Kit A 845-EP EP EP Reaktionen NEU Kit für die schnelle und einfache Extraktion genomischer DNA aus Vollblut, Speichelproben oder Wangenabstrichen.

26 1.3.2 Cleanup-Produkte 37 Aufreinigung von PCR-Produkten Einführung innuprep PCRpure Kit Der innuprep PCRpure Kit dient der extrem schnellen, einfachen und hocheffizienten Aufreinigung von Amplifikationsprodukten direkt aus PCR-Reaktionsgemischen. Der Kit dient auch der Aufkonzentrierung von Amplifikationsprodukten. Der Aufreinigungsprozess basiert auf einem Zwei-Schritt- Verfahren und ist in ca. 3 Minuten abgeschlossen. Die bisher üblichen Waschschritte entfallen (nur Bindung und Elution). Das Verfahren erlaubt die Rückgewinnung von Amplifikationsprodukten in einem Größenbereich von > 60 bp bis 30 kb mit einer Rückgewinnungsrate von 75 % bis 95 % (in Abhängigkeit von der Amplifikatlänge). Die Elution kann auch mit einem sehr geringen Elutionsvolumen erfolgen (10 μl). Damit werden keine speziellen»minielute«spin Filter-Säulen benötigt. Amplifikation eines 270 bp Fragmentes des humanen p53 Gens. Aufreinigung des Amplifikationsproduktes und nachfolgende DNA-Sequenzierung. 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Ausgangsmaterial PCR-Reaktionsgemische (bis zu 50 μl) Fragmentlängen > 60 bp bis 30 kb Rückgewinnungsrate 75 % bis 95 % (in Abhängigkeit von der Amplifikatlänge) Allgemeines Prinzip Binden Eluieren Bsp. Effiziente Primer Entfernung (vor der Aufreinigung) Bsp. Effiziente Primer Entfernung (nach der Aufreinigung)

27 Cleanup-Produkte Aufreinigung von PCR-Produkten Überblick 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innuprep PCRpure Kit 845-KS KS KS innuprep PCRpure 96 Kit 845-FP FP FP Für die schnelle und effiziente Aufreinigung von Amplifikationsprodukten im Spin Filter- Format, basierend auf einem Zwei-Schritt-Protokoll (Binden und Eluieren). Es sind keine Waschschritte erforderlich. Die gesamte Aufreinigung ist in rund 3 Minuten abgeschlossen. 2 x 96 Reaktionen 4 x 96 Reaktionen 10 x 96 Reaktionen Für die schnelle und effiziente Aufreinigung von Amplifikationsprodukten im 96 Well Format, basierend auf einem Zwei-Schritt-Protokoll (Binden und Eluieren). Waschschritte sind nicht nötig. Die Nutzung von 96 Well Filterplatten in Kombination mit einer Zentrifuge erlaubt die parallele Bearbeitung von bis zu 96 Proben. Die gesamte Aufreinigung von 96 Proben ist in rund 30 Minuten abgeschlossen.

28 39 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Einführung innuprep Gel Extraction Kit Der innuprep Gel Extraction Kit dient der extrem schnellen, einfachen und hocheffizienten Aufreinigung von DNA Fragmenten aus TAE- oder TBE-Agarosegelen. Der Kit basiert auf der initialen Solubilisierung von Agarosegelstücken und der nachfolgenden, selektiven Bindung der DNA an eine Filtermembran. Die gebundene DNA wird anschließend gewaschen und final durch die Zugabe eines Niedrigsalzpuffers von der Filtermembran abgelöst. Alle Puffer sind optimal aufeinander abgestimmt, so dass die Rückgewinnung mit einer hohen Effizienz erfolgt. Die aufgereinigten DNA-Fragmente sind sofort für weitere Applikationen einsetzbar. Ausgangsmaterial TAE- oder TBE-Agarosegele (> 300 mg) Beispiel der exzellenten Qualität des Gelextraktionsverfahrens für eine nachfolgende DNA-Sequenzierung: Amplifikationsprodukt (260 bp) vor Gelextraktion und korrespondierende DNA-Sequenz nach Sequenzierung des aufgereinigten DNA-Fragmentes. 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Extraktionsdauer Ca. 20 Minuten Fragmentlängen 100 bp bis 30 kb Rückgewinnungsraten 75 % bis 95 % (in Abhängigkeit von der Amplifikatlänge) Allgemeines Prinzip Gelsolubilisierung Binden Waschen Eluieren 1 3 Rückgewinnung eines 98 bp Amplifikationsproduktes aus einem 2,0 % TAE Agarosegel; Bestimmung der Rückgewinnungsrate mittels Agilent Bioanalyzer; Rückgewinnungsrate: 85 % bp Fragment vor Aufreinigung 5 98 bp Fragment nach Aufreinigung

29 Cleanup-Produkte Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Überblick 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innuprep Gel Extraction Kit 845-KS KS KS innuprep DOUBLEpure Kit 845-KS KS KS Bessere Performance Für die schnelle und effiziente Extraktion von DNA-Fragmenten aus TAE- oder TBE-Agarosegelen. Bessere Performance Für die schnelle und effiziente Extraktion von DNA Fragmenten aus TAE- oder TBE-Agarosegelen, sowie für die Aufreinigung von Amplifikationsprodukten aus PCR-Reaktionsgemischen mittels der neuartigen Zwei-Schritt-Technologie. innuprep DYEpure Kit 845-KS KS KS Für die effiziente und extrem schnelle Entfernung von Dye Terminatoren aus Sequenzieransätzen mittels der neuartigen Zwei-Schritt-Technologie. Keine Waschschritte oder Ethanolpräzipitation ist mehr nötig.

30 1.3.3 Isolierung von plasmid DNA 41 innuprep Plasmid Kits Einführung innuprep Plasmid Mini Kit Der innuprep Plasmid Mini Kit dient der schnellen und einfachen Isolierung von plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten von 1 5 ml. Das Verfahren basiert auf der Kombination einer alkalischen Lyse und der Bindung von plasmid DNA an eine Filtermembran im Anschluss an die Präzipitation der chromosomalen DNA und bakterieller Proteine. Die gebundene plasmid DNA wird anschließend gewaschen und final durch die Zugabe eines Niedrigsalzpuffers eluiert. Die isolierte plasmid DNA steht dann sofort für eine Vielzahl weiterer Downstream Applikationen zur Verfügung. Ausgangsmaterial 1 ml bis 5 ml Bakteriensuspension Isolierung von pdna aus 2 ml Bakteriensuspension; Vergleich verschiedener Methoden (Bakterienstamm: K12 JM 101; Plasmid: Bluescript; Mitwettbewerber, 4 6 innuprep Plasmid Mini Kit, 7 8 Isopropanol Fällung Reagenzien Isolierung/Aufreinigung Präparationszeit Ca. 16 Minuten Bindungskapazität/Ausbeute Ca. 25 μg Typische Ausbeute aus 2 ml Ausgangsmaterial (high copy Plasmid): 6 14 μg Ausbeute Yield pdna pdna in g in μg Allgemeines Schema Alkalische Lyse Präzipitation chromosomaler DNA und bakterieller Proteine durch Zentrifugation für 10 Minuten Bindung der plasmid DNA Waschen Elution der pdna 0 Wettbewerb innuprep Isopropanol Fällung Restriktionsspaltung mit den Restriktionsenzymen Hind III und EcoRI 3 Isolierung von pdna (Bluescript) mittels innuprep Plasmid Mini Kit. Die pdna wurde für 1 Stunde bei 37 C mit den Restriktionsenzymen Hind III und EcoRI inkubiert. Analyse des Restriktionsverdaus auf einem 1 %igem TAE Agarose Gel. Lane 1: DNA Leiter, Lane 2: pdna ungespalten, Lane 3: pdna HindIII gespalten, Lane 4: pdna EcoRI gespalten, Lane 5: pdna ungespalten, Lane 6: pdna HindIII gespalten, Lane 7: pdna EcoRI gespalten, Lane 8: pdna ungespalten, Lane 9: pdna HindIII gespalten, Lane 10: pdna EcoRI gespalten

31 Isolierung von plasmid DNA innuprep Plasmid Kits Einführung 1.0 Reagenzien Isolierung/Aufreinigung innuprep Plasmid Mini Kit Plus Der innuprep Plasmid Mini Kit Plus dient der schnellen und einfachen Isolierung von plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten von 5 15 ml. Das Verfahren basiert auf der Kombination einer alkalischen Lyse und der Bindung von plasmid DNA an eine Filtermembran im Anschluss an die Präzipitation der chromosomalen DNA und bakterieller Proteine. Die gebundene plasmid DNA wird nachfolgend gewaschen und final durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers eluiert. Die isolierte plasmid DNA steht dann sofort für eine Vielzahl weiterer Downstream Applikationen zur Verfügung. Ausgangsmaterial 5 ml bis 15 ml Bakteriensuspension Präparationszeit Ca. 20 Minuten Exzellente Qualität der isolierten pdna für Sequenzierung Bindungskapazität/Ausbeute Ca. 40 μg Typische Ausbeute aus 15 ml Ausgangsmaterial (high copy Plasmid): μg Allgemeines Schema Alkalische Lyse Präzipitation chromosomaler DNA und bakterieller Proteine durch Zentrifugation für 10 Minuten Bindung der plasmid DNA Waschen Elution der pdna

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