Praktikum Zellbiologie

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1 Praktikum Zellbiologie Teil I: Apoptose BSc Studiengang Molecular Life Sciences V. 1.3

2 Zellbiologie I - Inhalt 2 INHALT Seite ZEITPLAN... 3 THEORETISCHE GRUNDLAGEN... 4 Apoptose... 4 Tumornekrosefaktor... 7 Durchflusszytometrie... 8 Nachweis von DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen... 9 Bestimmung der Zellzahl HILFREICHE ANMERKUNGEN ZU PUFFER UND LÖSUNGEN MIKROPIPETTEN DURCHFÜHRUNG Eichen der Mikropipetten Durchflusszytometrie Bestimmung der Zellzahl Durchflusszytometrischer Nachweis von TNFRI und TNFRII auf U937-Zellen.. 18 Immunhistochemie Apoptose I Kultivierung von U937-Zellen unter Zusatz von TNF und Cycloheximid Zellfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst Apoptose II Annexin V-FITC zur Detektion apoptotischer Zellen... 24

3 Zellbiologie I - Zeitplan 3 ZEITPLAN Dienstag: Uhr Seminarraum Biochemie (Rm 19) - Einführungsseminar - Platzübernahme - Eichen der Mikropipetten Versuchseinteilung und Zeitplan: Gruppe Dienstag Mittwoch Donnerstag D Uhr D Uhr D Uhr D Uhr I Uhr I Uhr I Uhr I Uhr I Uhr I Uhr I Uhr I Uhr I A Uhr Uhr I A Uhr Uhr D A Uhr Uhr D A Uhr Uhr D Uhr D Uhr D Uhr D Uhr A1 A Uhr Uhr A1 A Uhr Uhr A Uhr A Uhr A Uhr A Uhr A2 A Uhr Uhr A1 A Uhr A1 A Uhr Uhr A1 A Uhr Uhr Versuche: D Durchflusszytometrie / Margot / 4 h I Immunhistochemie / Patrick / 3 h A1 Apoptose I / Patrick / 4 h A2 Apoptose II / Margot / 5 h

4 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 4 THEORETISCHE GRUNDLAGEN Apoptose Die Apoptose ist ein programmierter Zelltod, ein Selbstmordprogramm einzelner biologischer Zellen, und spielt eine Rolle bei einer Vielzahl zellulärer Vorgänge wie z.b.: Entwicklungsphysiologische Prozesse: Metamorphose von der Kaulquappe zum Frosch Degeneration der Häute zwischen den Fingern und Zehen Absterben von Zellen des Glaskörpers und der Linse, wodurch die Lichtdurchlässigkeit der Augenlinse entsteht Prozesse im adulten Organismus: Selektion von Keimzellen Entfernung entarteter Zellen Kontrolle der Zellzahl und der Größe von Geweben Selektion und Abbau schädlicher Zellen des Immunsystems Die Apoptose lässt sich in zwei Phasen, die Initiations- und die Effektorphase, unterteilen. Bei der Initiation kann das Signal zum Auslösen der Apoptose von außen kommen (Stimulierung bestimmter Rezeptoren) oder durch Prozesse innerhalb der Zelle (DNA-Schäden). Man spricht deshalb auch von einem extrinsischen und intrinsischen Weg. Der extrinsische Weg wird eingeleitet durch Bindung eines Liganden an einen Rezeptor der Tumornekrosefaktor- Rezeptorfamilie (TNFR). Als Ligand können Tumornekrosefaktor (TNF) und andere Cytokine fungieren. Durch die Bindung des Liganden wird der TNFR trimerisiert und die cytoplasmatische Domäne des Rezeptors, eine sog Todesdomäne (death domain, DD), kann dadurch an Adaptermoleküle mit eigener Todesdomäne binden. Das erste dieser Moleküle ist das TNF-Rezeptor assoziierte Protein (TRADD). An dessen Todesdomäne bindet wiederum das Fas assoziierte Protein mit Todesdomäne (FADD). FADD besitzt neben der Todesdomäne auch eine Todeseffektordomäne (death effector domain, DED), worüber die procaspase 8 mit ihrer DED an den Komplex bindet (Abb. 1). Die procaspase 8 kann sich nun durch die entstandene hohe lokale Konzentration autokatalytisch durch Proteolyse aktivieren. Die aktive Caspase 8 löst anschließend die Caspase-Kaskade aus.

5 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 5 Abb. 2: Intrinsische Aktivierung der Apoptose durch Freisetzung von Cytochrom c. Abb. 1: Extrinsische Apoptose Aktivierung durch Trimerisierung von TNFR. Bei der intrinsischen Aktivierung kommt es zur Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Cytoplasma. Dieser Weg kann ausgelöst werden durch Tumor-Suppressoren wie p53, einem Transkriptionsfaktor, der durch DNA- Schädigung aktiviert wird. p53 stimuliert die Expression pro-apoptotisch wirkender Mitglieder der Bcl-2 Familie (z. B. Bax, Bad). Diese bewirken die Freisetzung von Cytochrom c aus dem mitochondrialen Intermembranraum. Cytochrom c bindet im Cytoplasma an den apoptotischen Protease-Aktivierungsfaktor-1 (Apaf-1) und bewirkt eine Konformationsänderung des Proteins, wodurch die Proteinbindedomäne CARD (Caspase-Rekrutierungs-Domäne) zugänglich wird und Apaf-1 an die CARD Domäne der Procaspase 9 binden kann. Dieses Heterodimer bildet das Apoptosom und bewirkt die Aktivierung der Caspase 9, welches die Caspase-Kaskade auslösen kann (Abb. 2). Caspasen sind Proteasen mit einem Cysteinrest im aktiven Zentrum. Sie gehören zur Klasse der Cysteinproteasen und spalten Peptidbindungen C-Terminal von Aspartatresten (Caspase = cysteinyl-aspartate specific protease). Es existieren 13 verschiedene Caspasen beim Menschen, die in Proinflammatorische, Initiator- und Effektor-Caspasen eingeteilt werden. Zum Auslösen der Apoptose werden die Initator-Caspasen Caspase 8 und 9 aktiviert. Diese wiederum aktivieren die Effektor-Caspasen wie Caspase 3, 7 und 6. Die aktivierten Effektor-Caspasen spalten Proteine wie Aktin (im

6 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 6 Abb. 3: Caspase-Kaskade. Abb. 4: Tumornekrosefaktor. Cytoskelett), Lamin (in der Zellkernmembran) und PARP (Poly [ADP-ribose] polymerase), ein Enzym welches für die DNA-Reparatur benötigt wird. Außerdem aktivieren die Effektor-Caspasen eine Nuklease welche zelluläre DNA spaltet (Abb. 3). Nachweis von Apoptose Eine andere Form des Zelltods ist die Nekrose. Die Nekrose ist, anders als die Apoptose, kein physiologischer Vorgang sondern das Absterben einzelner Zellen oder Zellpopulation durch schädigende Einflüsse wie Bakterien, Gifte oder Nährstoff- und Sauerstoffmangel. Apoptose und Nekrose lassen sich experimentell leicht unterscheiden. Bei der Apoptose löst sich die betreffende Zelle aus dem Gewebe und schrumpft. An der Zellmembran bilden sich Bläschen und der Zellkern wird kleiner und dichter gepackt, man spricht auch von einer Chromatin Kondensation. Zusätzlich werden Nukleasen aktiviert, welche die DNA in definierte Fragmente abbauen und somit eine DNA-Leiter erzeugen, die Elektrophoretisch nachgewiesen werden kann. Eine andere Möglichkeit die DNA- Fragmentierung und damit die Apoptose nachzuweisen ist die Verknüpfung der entstehenden 3 OH Gruppen mit markierten Nukleotiden durch das Enzym TdT (Terminale Desoxynukleotidyltransferase). Der Einbau von z.b. fluoreszierenden Nukleotiden kann Mikroskopisch nachgewiesen werden. Diese Methode wird auch als TUNEL-Assay (TdT-mediated dutp-biotin nick end labeling) bezeichnet. Am Ende der Apoptose bleibt ein homogenes Apoptosekörperchen übrig, das durch

7 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 7 Phagozytose abgebaut wird. Dabei wird keine Entzündungsreaktion ausgelöst. Bei der Nekrose hingegen schwillt die Zelle an, wobei deren Plasmamembran zerstört wird. Die Folge ist eine lokale Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes, da Substanzen aus dem Cytoplasma und Zellorganellen freigesetzt werden. Veränderungen in der Plasmamembran sind eines der ersten Anzeichen apoptotischer Prozesse. Dabei kommt es zur Translokation des Phospholipids Phosphatidylserin vom inneren zum äußeren Layer (Abb. 5). Annexin V ist ein Ca 2+- abhängiges, phopsholipid-bindendes Protein mit einer hohen Affinität zu Phosphatidylserin. Darum ist Annexin V besonders gut geeignet, um apoptotische Zellen zu identifizieren, die bereits Phopshatidylserin an der äußeren Membran präsentieren. Unter Verwendung von Propidiumjodid und FITC-konjugiertem Annexin V können apoptotische Zellen (propidiumjodid-negativ) von nekrotischen bzw. bereits toten Zellen (propidiumjodid-positiv) unterschieden werden. Da Phosphatidylserin externalisiert wird bevor DNA-Strangbrüche entstehen ist Annexin V-FITC ein hervorragender Marker, um frühe Stadien der Apoptose zu erfassen. Abb. 5: Annexin V Assay. Nach Apoptose-Induktion wird Phosphatidylserin an der äußeren Plasmamembran transloziert und durch Annexin V nachgewiesen. Tumornekrosefaktor Tumornekrosefaktor (TNF oder auch TNF-α) (Abb. 4) ist ein Cytokin und spielt eine Rolle bei Entzündungen. TNF wird hauptsächlich von Makrophagen produziert und reguliert die Aktivität verschiedener Immunzellen. So kann TNF die

8 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 8 Apoptose, Zellproliferation, Zelldifferenzierung sowie die Ausschüttung anderer Cytokine anregen. TNF bindet an die beiden Rezeptoren TNF-Rezeptor I (TNFRI) und TNF-Rezeptor II (TNFRII). Beide Rezeptoren aktivieren den nukleären Transkriptionsfaktor NF-κB, was zu Zellaktivierung, Zelldifferenzierung, Bildung von Cytokinen und Hemmung der Apoptose führt. TNF-RI kann alternativ auch einen intrazellulären Komplex bilden, der über die Aktivierung spezifischer Caspasen die Apoptose auslöst (Abb. 1). Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting = FACS) ist eine Methode zur Analyse von einzelnen Zellen in Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Ein Durchflusszytometer erlaubt die simultane Messung der relativen Zellgröße, der Granularität sowie zwei bis drei verschiedener Fluoreszenzfarben für mehrere tausend Zellen in wenigen Sekunden. Zur Analyse werden die Zellen durch eine Kapillare gesaugt. Dabei werden die Zellen durch die umgebende Trägerflüssigkeit (isotone Salzlösung) stark beschleunigt, es kommt zur Trennung von kleineren Zellaggregaten und zur Hintereinanderreihung der Zellen (hydrodynamische Fokussierung). Anschließend passieren die einzelnen Zellen für den Bruchteil einer Sekunde einen fokussierte Laserstrahl (Argon-Laser, 488 nm). Die Zellen streuen einen Teil des Lichts, welches mittels Spiegel- und Filtersysteme auf die verschiedenen Fotoverstärker geleitet wird (Abb 6). Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Größe der Zelle und mit ihrer Komplexität. So streuen Granulozyten, die eine raue Oberfläche und in ihrem Inneren viele Vesikel haben, deutlich mehr Licht als Zellen mit glatter Oberfläche. Das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter = FSC) ist ein Maß für die Beugung des Lichts im flachen Winkel und hängt vom Volumen der Zelle ab. Das Seitwärtsstreulicht (Sideward Scatter = SSC) ist ein Maß für die Brechung des Lichts im rechten Winkel, welches von der Granularität der Zelle, der Größe und Struktur ihres Zellkerns sowie der Menge der Vesikel in einer Zelle abhängig ist. Gleichzeitig können Fluoreszenzfarben gemessen werden. Man verwendet dazu fluoreszierende Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden. Auch Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können zur Analyse von Zellen verwendet werden. Die Antikörper sind dabei meist gegen bestimmte Oberflächenproteine gerichtet. Nach Markierung kann dann auch die Sortierung nach diesen Merkmalen erfolgen.

9 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 9 Abb. 6: Prinzip eines Durchflusszytometers. Nachweis von DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen Zur Analyse der DNA werden DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) oder Propidiumiodid (PI, Abb. 7 und 8) verwendet. DAPI lagert sich an A/T-reiche Regionen der kleinen Furche an, PI interkaliert in die Doppelhelix, kann allerdings nur die Zellmembran von toten Zellen und nicht von lebenden Zellen durchdringen. Diese Eigenschaft wird in der FACS-Analyse zur Lebend-Tot-Diskriminierung der Zellen verwendet. Mit PI kann am FACS auch der DNA-Gehalt von Zellen gemessen werden, was für die Analyse des Zellzyklus eingesetzt wird. Ein anderer Fluoreszenzfarbstoff zum Färben von DNA ist der Bisbenzimidazol- Farbstoff Hoechst Dieser Farbstoff hat ähnliche spektrale Eigenschaften

10 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 10 wie DAPI und bindet an A/T-reiche Regionen der kleinen Furche. Hoechst kann jedoch im Gegensatz zu DAPI die Zellmembran durchdringen und somit zur DNA-Färbung in lebenden und fixierten Zellen benutzt werden. Er eignet sich somit ideal zum Nachweis von apoptotisch bedingten Chromatinverdichtungen und -fragmentationen. Abb. 7: Strukturformeln von DNA bindenden Fluoreszenzfarbstoffen. A: DAPI, B: Propidiumiodid (PI), C: Hoechst Abb. 8: Absorptions- und Emissionsspektren. Gezeigt sind die Absorptionsspektren (gestrichelte Linien) und Emissionsspektren (durchgezogene Linien) von DAPI, PI und Hoechst jeweils gebunden an doppelsträngige DNA.

11 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 11 Bestimmung der Zellzahl Die Anzahl von Zellen in einer Suspension kann unter dem Mikroskop mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer bestimmt werden. Die Zählkammer ist im Prinzip ein Objektträger mit einer vertieften Fläche, auf der quadratische Felder mit einer definierten Tiefe eingeätzt sind (Abb. 9). Die Quadrate sind durch eingravierte Linien in ein feines Raster unterteilt. Legt man auf diese Zählkammer ein Deckglas, so beträgt der Abstand zwischen der Unterseite dieses Deckglases und der Oberfläche der Zählkammer genau 0,1 mm. Jedes der vier Quadrate (in den vier Ecken) hat eine Fläche von 1 mm 2. Es berechnet sich ein Volumen von 0,1 µl über jedem dieser Quadrate. Die Zellzahl wird durch Zellzählung der äußeren vier Quadrate (A D) ermittelt mit Abb. 9. Neubauer-Zälhkammer. Links: Das Raster einer Zählkammer nach Neubauer mit den vier äußeren Quadraten A, B, C und D. Rechts: Vergrößerung eines der äußeren Quadrate. Man erkennt wie und welche Zellen gezählt und welche ignoriert werden sollen.

12 Molekularbiologie I Theoretische Grundlagen 12 (Zellzahl : 4) x 10 4 = Zellen/ml Durch Zugabe durch den Farbstoff Trypanblau lässt sich zusätzlich die Vitalität der Zellen bestimmen. Trypanblau kann die Plasmamembran lebender Zellen nicht durchqueren so dass nur tote Zellen blau gefärbt werden.

13 Zellbiologie I Anmerkungen zu Puffer und Lösungen 13 HILFREICHE ANMERKUNGEN ZU PUFFER UND LÖSUNGEN 1. Was ist ein Mol? Das Mol ist die Einheit der Stoffmenge. Es ist definiert als diejenige Menge Substanz, die so viele Elementareinheiten (Atome, Ionen, Moleküle) enthält, wie Atome in 12 g des Kohlenstoff-Isotops C12 vorhanden sind. Das sind 6,022 x Teilchen. 2. Was ist Molarität? Molarität sind die Mole gelöster Substanz/Liter einer Lösung. Somit ist eine 1 molare Lösung (1M) = 1 Mol gelöste Substanz in Gramm pro Liter (1 mol/l). Eine 1 millimolare (mm) Lösung = 0,001mol/l 3. Wie viel Gramm sind in einem Mol? Das ist wiederum unterschiedlich für die verschiedenen Elemente und Verbindungen. Es ist festgelegt durch die Atommasse eines Elements, oder durch die Molekularmasse einer Verbindung, welche die Summe der Atommassen der Atome, die in einer Formel der Verbindung gefunden werden, darstellt. Zum Beispiel ist das Molekulargewicht von Wasser (H 2 O) 2 x das Atomgewicht von Wasserstoff und 1 x das Atomgewicht von Sauerstoff. Zahlenmäßig ist das: (2 x 1,00797)+(1 x 15,9994) = 2, ,9994 = 18,01534 g. Ein anderes Beispiel: Das Molekulargewicht von KCl = 39,1 + 35,45 = 74,55 g. Um also eine 1 M Lösung von KCL herzustellen, benötigt man 74,55 g/l Anmerkung: die oben genannten 74,55 Gramm pro Liter bedeuten die Endkonzentration. Das ist nicht das Gleiche wie 74,55 g zu einem Liter Wasser dazuzugeben. Wenn man solch eine Lösung macht, sollte die zu lösende Substanz zunächst in einem kleineren Volumen Wasser gelöst werden und dann auf den 1 Liter aufgefüllt werden. 4. Was ist eine 1%ige (v/v) Lösung? v/v heißt Volumen pro Volumen. Das bedeutet, dass eine bestimmte flüssige Chemikalie 1% des Gesamtvolumens der Lösung ausmacht. Zum Beispiel enthält 1%ige Glycerollösung 1 ml Gycerol in einem Endvolumen von 100 ml. 5. Was ist eine 1% (w/v) Lösung? w/v heißt Gewicht pro Volumen. Wenn eine Chemikalie ein Feststoff ist, bedeutet eine 1%ige Lösung, dass 1 g auf 100 ml kommt. Zum Beispiel würde eine 1%ige SDS Lösung 1 g SDS in einem Endvolumen von 100 ml enthalten.

14 Zellbiologie I Anmerkungen zu Puffer und Lösungen/Mikropipetten Was ist eine 10X Lösung? Das ist eine Vorratslösung mit einer Konzentration, die 10x höher ist als die Lösung, mit der man arbeitet. Um eine 1X Lösung herzustellen muss man sie 10fach verdünnen. Zum Beispiel um eine 1X Lösung von TE herzustellen muss man 100ml einer 10X TE-Lösung auf ein Endvolumen von 1 Liter verdünnen. 7. Was ist eine 1:10 Verdünnung? Das ist eine Verdünnung, bei dem ein Teil einer Lösung in 10 Teilen gesamt gelöst ist. Um eine 1:10 Verdünnung herzustellen, muss ich 1 Teil der Lösung in 9 Teile einer anderen Lösung geben. Zum Beispiel 100 µl Protein in 900 µl Puffer. Dann habe ich 1 Teil (100 µl) in 1000 µl (1 ml) Gesamtvolumen. MIKROPIPETTEN Eine Mikropipette wird benutzt um Lösungen in Mikrolitermengen aufzuteilen. Sie ist wahrscheinlich das am häufigsten verwendete Arbeitsinstrument in einem molekularbiologischem Labor. Mikropipetten sind Hochpräzisionsgeräte und sollten unbedingt sorgfältig behandelt werden. Sie dürfen nicht auf den Boden fallen, es dürfen keine Flüssigkeiten eingesaugt werden und sie dürfen nie mit einem Volumen unterhalb und oberhalb des angegebenen Bereichs benutzt werden. Unsachgemäße Handhabung beschädigt die Pipette, wodurch sie ungenau wird und nicht mehr exakt das Volumen pipettiert, welches eingestellt ist. Die Erfolgsergebnisse der Versuche im Labor sind stark von der Genauigkeit und dem Umgang mit einer Pipette abhängig. Welche Mikropipette soll man benutzen? Der Praktikumssatz enthält 4 Mikropipetten: 0,5 10 µl (grauer Hub) 2 20 µl (gelber Hub) µl (gelber Hub) µl (blauer Hub) Die erste Zahl zeigt das minimale und die zweite Zahl zeigt das maximal zu pipettierende Volumen der Pipette an. Versuche niemals ein Volumen unterhalb und oberhalb des angegebenen Bereichs einer Mikropipette zu benutzen! Für Volumen, die sich 2 Pipetten teilen ist es genauer die zu verwenden, die das kleinere Volumen hat. Zum Beispiel für 20 µl ist es besser die 2-20 Pipette als die zu benutzen.

15 Zellbiologie I Mikropipetten 15 Wie lese ich das eingestellte Volumen meiner Mikropipette ab? Jede Pipette zeigt 4 Zahlen an: Bei der 0,5 10 µl (grauer Hub) Pipette sowie der 2 20 µl (gelber Hub) Pipette zeigen die oberen beiden Ziffern die Mikroliter und die unteren beiden Ziffern die Dezimalstelle an. Eine Einstellung von 0550 entspricht 5,5 µl. Bei der µl (gelber Hub) Pipette zeigen die oberen drei Ziffern die Mikroliter und die untere Ziffer die Dezimalstelle an. Eine Einstellung von 0550 entspricht 55 µl. Bei der ml (blauer Hub) Pipette zeigen die vier Ziffern die Mikroliter an. Eine Einstellung von 0550 entspricht 550 µl. Wie verwende ich eine Mikropipette? Man muss immer eine Spitze benutzen! Weiße Spitzen für Pipetten mit grauem Hub, Gelbe Spitzen für die Pipetten mit gelbem Hub und blaue Spitzen für Pipetten mit blauem Hub. Den Pipettenhub sanft bis zum ersten Stopp herunterdrücken. Die Spitze in die zu pipettierende Lösung eintauchen und den Pipettenhub sanft loslassen bis der Stopp wieder erreicht ist. Die Spitze mit der Lösung in das dafür bestimmte Gefäß halten und den Hub herunterdrücken bis er am ersten Stopp angekommen ist. Den Pipettenhub über den ersten Stopp hinaus ganz durchdrücken und übriggebliebene Flüssigkeit ausstoßen. Die Spitze aus der Lösung ziehen und den Pipettenhub wieder loslassen. Den seitlichen Knopf benutzen um die Spitze abzuwerfen. Wenn man einige Lösungen in das gleiche Tube pipettieren möchte, ist es das Beste mit dem größten Volumen zu beginnen und dann die kleineren Volumina zuzugeben. Man kann die Lösung dann mischen indem man immer wieder hoch und runter pipettiert. Dabei darf man den Pipettenhub nicht über den ersten Stopp drücken. Außerdem darf man den Pipettenhub nicht zu schnell loslassen, sonst erzeugt man Luftblasen oder es bleibt Lösung an der Pipettenspitze hängen. Wenn man die gleiche Lösung in einige verschiedene Tubes pipettieren möchte, kann man die gleiche Pipettenspitze benutzen. Man muss allerdings sichergehen, dass man keine andere Lösung damit berührt.

16 Zellbiologie I Durchführung: Eichen der Mikropipetten 16 DURCHFÜHRUNG Eichen der Mikropipetten Um zu überprüfen wie genau die Mikropipetten funktionieren, wird das für die jeweilige Pipette maximale Volumen mit Wasser pipettiert und an der Feinwaage das Gewicht des pipettierten Volumens bestimmt. Stellen Sie die µl (blauer Hub) auf das maximale Volumen und setzten Sie eine blaue Spitze auf. Stellen Sie ein leeres 10 ml Becherglas auf die Feinwaage und tarieren Sie die Waage auf null. Pipettieren Sie 1 ml dh 2 O in das Becherglas auf die Waage und notieren Sie das Gewicht. Stellen Sie die Waage wieder auf null und wiederholen Sie den Versuch vier mal. Verfahren Sie mit den anderen Pipetten genauso und tragen die Werte in die Tabelle ein. Ermitteln Sie den Mittelwert und bestimmen Sie die Abweichung der Pipette. Tabelle 7: Eichwerte der Mikropipetten. Pipette µl µl 2 20 µl 0,5 10 µl Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5 Mittelwert Abweichung [%] Zum Ende des Praktikums wird die Eichung der Mikropipetten wiederholt. Sollten sich zu große Abweichungen zu den ersten Messungen ergeben, ist dies auf unsachgemäße Bedienung zurückzuführen und Sie müssen für die Reparatur der Mikropipetten aufkommen!

17 Zellbiologie I Durchführung: Durchflusszytometrie 17 Durchflusszytometrie Im folgenden Versuch sollen die TNF-Rezeptoren TNFRI und TNFRII auf der Oberfläche von U937-Zellen nachgewiesen werden. Die U937-Zellinie entstammt einem histiocytischen Lymphom und zeigt monozytenähnliche Charakteristika. Bestimmung der Zellzahl Vom Praktikumsbetreuer wird eine Zellsuspension der U937-Zellinie zur Verfügung gestellt. Die Zellzahl wird durch Zellzählung in einer Neubauer- Zählkammer ermittelt und auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen/ml eingestellt. Durch Zugabe von Trypanblau lässt sich zusätzlich die Vitalität der Zellen bestimmen. Es werden 10 µl der Zellsuspension mit 10 µl einer 0,5% (w/v) Trypanblaulösung gemischt und kurz bei Raumtemperatur inkubiert. 10 µl dieser Mischung werden mit einer Pipette vorsichtig am Rand zwischen Deckglas und Zählkammer aufgebracht. Kapillarkräfte ziehen die Probe sofort in den Spalt. Die Anzahl der lebenden Zellen (nicht angefärbt) wird in den vier Großquadraten (A-D) ermittelt und die Zellzahl pro Milliliter nach folgender Formel berechnet: (Zellzahl : 4) x 2 (bei Trypanblaufärbung) x 10 4 = Zellen/ml Der Anteil der toten Zellen (blau gefärbt) wird gesondert gezählt und der Prozentsatz der toten Zellen bestimmt. Die Zellsuspension soll nun auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen/ml eingestellt werden. Dazu wird die Gesamtmenge der Zellsuspension für 5 min bei 1000 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet mit der berechneten Menge an GDPBS-Puffer supendiert.

18 Zellbiologie I Durchführung: Durchflusszytometrie 18 Durchflusszytometrischer Nachweis von TNFRI und TNFRII auf U937-Zellen Zum Nachweis von TNFRI und TNFRII auf der Zelloberfläche werden die U937- Zellen mit spezifischen primären Antikörpern gegen die beiden Rezeptoren inkubiert. Der sekundäre Antikörper ist mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) konjugiert. Dieser Fluoreszenzfarbstoff absorbiert bei 494 nm und emittiert bei 521 nm. 500 µl der Zellsuspension (5 x 10 6 Zellen) werden 5 min bei 3000 rpm und 4 C zentrifugiert und das Pellet in 500 µl eiskaltem Methanol suspendiert. Die Inkubation erfolgt für 15 min im Eisbad. Die Zellsuspension wird erneut zentrifugiert (5 min, 3000 rpm, 4 C) und das Pellet wird wiederum in 500 µl GDPBS suspendiert. Es werden vier Eppendorf-Tubes beschriftet und mit je 100 µl Zellsuspension (5 x 10 5 Zellen) gefüllt. Nachfolgend werden die Antikörper-Lösungen nach folgendem Pipettierschema hinzupipettiert: 1) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl GDPBS-Puffer 2) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl anti-tnfri (Ziege anti Human), 1:20 verdünnt mit GDPBS 3) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl GDPBS-Puffer 4) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl anti-tnfrii (Maus anti Human), 1:20 verdünnt mit GDPBS Es wird anschließend für 30 min im Eisbad inkubiert. Die Zellen werden durch Zugabe von 500 µl GDPBS-Puffer gewaschen und 5 min bei 3000 rpm und 4 C zentrifugiert. Die Überstände werden abpipettiert und die Zellpellets in den jeweiligen Verdünnungen der sekundären Antikörper suspendiert: 1) µl anti-ziege FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS 2) µl anti-ziege FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS 3) µl anti-maus FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS 4) µl anti-maus FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS Es wird anschließend für 30 min im Eisbad inkubiert.

19 Zellbiologie I Durchführung: Durchflusszytometrie 19 Die Zellen werden durch Zugabe von 500 µl GDPBS-Puffer gewaschen und 5 min bei 3000 rpm und 4 C zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen, die Zellpellets in 500 µl GDPBS-Puffer suspendiert und in die FACS-Probenröhrchen überführt. Die Proben können nun am Durchflusszytometer analysiert werden. Puffer und Lösungen GDPBS-Puffer: 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 6,5 mm Na 2 PO 4, 1,5 mm KH 2 PO 4, 0,1% (w/v) Gelatine, ph 7,4 Trypanblau: 0,5 % (w/v) in PBS (Giftig!) Auswertung Wie ist die Qualität der Zellen? Forward gegen Sideward-Scatter auftragen! Überlagerung der Kanäle für FITC Lässt sich TNFRI oder TNFRII auf den Zellen nachweisen?

20 Zellbiologie I Durchführung: Immunhistochemie 20 Immunhistochemie In diesem Versuch soll der TNFRI an immobilisierten U937-Zellen nachgewiesen werden. Die Auswertung der gefärbten Zellen wird am Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Jede Gruppe erhält zwei Objektträger (Beschriftung: 1/2) mit bereits immobilisierten und fixierten U937-Zellen (1 x 10 5 ). Die Objektträger werden in ein Becherglas oder einer Küvette mit DPBS-Puffer gestellt und 5 min rehydratisiert. Die Objektträger werden anschließend kurz auf Filterpapier abgetropft, sie dürfen aber nicht austrocknen! Auf beiden Objektträgern sind kreisförmige Areale mit einem Silikonstift begrenzt worden. Auf diese Areale wird nun der Puffer (bei der Kontrolle) bzw. die Antikörper-Lösung pipettiert. Die Objektträger werden entsprechend beschriftet! Die Inkubation erfolgt in einer feuchten Kammer für 60 min bei Raumtemperatur. 1) + 50 µl GDPBS-Puffer 2) + 50 µl anti-tnfri (Ziege anti Human) 1:50 verdünnt mit GDPBS-Puffer Die Objektträger werden anschließend dreimal mit je 50 µl DPBS-Puffer gewaschen und jeweils abgetropft. Nach dem letzten Waschschritt werden sie wiederum kurz abgetropft. Beide Objektträger werden nun mit je 50 µl einer 1:50 verdünnten Lösung des sekundären Antikörpers (anti-ziege FITC-konjugiert) inkubiert. Die Inkubation erfolgt in einer feuchten Kammer für 60 min bei Raumtemperatur. Die feuchte Kammer sollte im Dunkeln stehen, um den Fluoreszenzfarbstoff vor Lichteinstrahlung zu schützen. Nach dreimaligem Waschen mit je 50 µl DPBS-Puffer werden die Objektträger zum Trocknen (5-10 min bei 37 C) gestellt und mit einem Eindeckmittel (Aquatex) überschichtet. Nach dem Trocknen (20-30 min bei RT im Dunkeln) werden die Präparate im Fluoreszenzmikroskop betrachtet und die Beobachtungen dokumentiert. Puffer und Lösungen DPBS-Puffer: 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 6,5 mm Na 2 PO 4, 1,5 mm KH 2 PO 4, ph 7,4

21 Zellbiologie I Durchführung: Immunhistochemie 21 GDPBS-Puffer: DPBS-Puffer + 0,1% (w/v) Gelatine Auswertung Ist ein Fluoreszenzsignal zu sehen? Dokumentieren Sie den Ansatz und die Kontrolle mit identischen Softwareeinstellungen (Belichtungszeit, Verstärkung etc)

22 Zellbiologie I Durchführung: Apoptose I 22 Apoptose I Ziel dieses Versuches ist die Induktion der Apoptose durch TNF über den TNFRI. Die Induktion der Apoptose wird durch gleichzeitige Inkubation mit Cycloheximid beschleunigt und verstärkt. Cycloheximid ist ein Antibiotikum aus Streptomyces griseus, das die Proteinsynthese der 80S-Ribosomen eukaryotischer Zellen hemmt. Vier kleine Petrischalen werden mit je 1 ml RPMI-1640 Medium gefüllt. Anschließend werden 100 µl der ausgeteilten Zellsuspension (1x10 7 Zellen/ml) hinzupipettiert und durch Schwenken gleichmäßig verteilt. Kultivierung von U937-Zellen unter Zusatz von TNF und Cycloheximid Die Zellsuspension in einer Petrischale (Beschriftung: A1) wird mit 2 µl TNF (= 20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg) versetzt. Die andere Petrischale (Beschriftung: K1) bleibt als Kontrolle ohne Zusatz. Die Zellen werden mindestens zwei Stunden bei 37 C und 5 % CO 2 inkubiert. Die morphologischen Veränderungen werden unter dem Mikroskop beobachtet. Zellfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst Die Zellsuspension in einer Petrischale (Beschriftung: A2) wird mit 2 µl TNF (= 20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg) versetzt. Die andere Petrischale (Beschriftung: K2) bleibt als Kontrolle ohne Zusatz. Die Zellen werden drei Stunden bei 37 C und 5 % CO 2 inkubiert. Die Zellen werden durch 5 maliges auf- und abpipettieren von der Petrischale gelöst. Die Zellsuspensionen werden in je ein Eppendorftube (Beschriftung: A2/K2) überführt und 5 min bei 3000 U/min in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert und der Überstand abgenommen.

23 Zellbiologie I Durchführung: Apoptose I 23 Die Zellpellets werden in 500 µl DPBS-Puffer suspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Eine 5 mm Stammlösung des Hoechst Farbstoffes wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt. Es werden 250 µl einer 1:10 mit DPBS-Puffer verdünnten Lösung hergestellt. Die Überstände werden nach der Zentrifugation verworfen und die Zellpellets in je 100 µl DPBS-Puffer suspendiert. Die Zellen werden mit jeweils 100 µl der verdünnten Hoechst Farbstofflösung versetzt und 10 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Durch Zugabe von 500 µl DPBS-Puffer und nachfolgende Zentrifugation (s.o.) werden die Zellen gewaschen. Die Pellets werden nachfolgend wiederum in 100 µl DPBS-Puffer suspendiert. Sowohl die Hoechst gefärbten apoptotischen Zellen als auch die Kontrollzellen werden unter dem Mikroskop (Hellfeld- bzw. Fluoreszenz- Mikroskopie) betrachtet. Dazu werden 10 µl Zellsuspension auf einem Objektträger gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Morphologie der Zellen wie auch die unterschiedlichen Stadien der Chromatinverdichtung sollen fotografisch dokumentiert werden. Puffer und Lösungen DPBS-Puffer: 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 6,5 mm Na 2 PO 4, 1,5 mm KH 2 PO 4, ph 7,4 Cycloheximid: sehr giftig! Hoechst 33258: giftig! Auswertung Vergleich der Zellen nach 2 h Apoptose mit den Kontrollzellen. Die morphologischen Veränderungen fotografisch dukumentieren. Hoechst gefärbte Zellen im Hellfeld und Fluoreszenz aufnehmen, Bilder überlagern, Kontrolle mit apoptotischen Zellen vergleichen.

24 Zellbiologie I Durchführung: Apoptose II 24 Apoptose II Annexin V-FITC zur Detektion apoptotischer Zellen An behandelten U937-Zellen soll Apoptose mittels Annexin V detektiert werden. Durch gleichzeitige Behandlung mit Propidiumjodid können apoptotische Zellen (propidiumjodid-negativ) von nekrotischen bzw. bereits toten Zellen (propidiumjodid-positiv) unterschieden werden. Drei kleine Petrischalen werden auf der Unterseite beschriftet (a, b, c) und mit je 1 ml RPMI-1640 Medium gefüllt. Anschließend werden 100 µl der ausgeteilten U937-Zellsuspension (1x10 7 Schwenken gleichmäßig verteilt. Zellen/ml) hinzupipettiert und durch Nun werden TNF und Cycloheximid nach folgendem Pipettierschema hinzupipettiert: a) keine Zugabe (Kontrolle) b) 2 µl TNF (20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg), 1,5 Stunden Inkubation (erst nach 2 Stunden zugeben!) c) 2 µl TNF (20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg), 3 Stunden Inkubation Während der Inkubation werden die Zellen im Brutschrank bei 37 C und 5 % CO 2 aufbewahrt. Nach der Inkubation werden die Zellsuspensionen in je ein Eppendorftube überführt und 5 min bei 3000 U/min und 4 C zentrifugiert. Die Zellen werden zweimal mit je 500 µl eiskaltem DPBS-Puffer gewaschen, wie oben zentrifugiert und die Zellpellets anschließend in 500 µl Bindungspuffer suspendiert. Es werden 6 Tubes bereitgestellt, beschriftet und die Zellen nach folgendem Schema pipettiert:

25 Zellbiologie I Durchführung: Apoptose II 25 Ansatz Zellen Annexin V-FITC Propidiumjodid µl U937 Kontroll-Zellen (a) µl U937 Kontroll-Zellen (a) 5 µl µl U937 Kontroll-Zellen (a) - 10 µl µl U937 Kontroll-Zellen (a) 5 µl 10 µl µl U937 nach 1,5h Inkubation (b) µl U937 nach 3 h Inkubation (c) 5 µl 10 µl 5 µl 10 µl Die Zellen werden 15 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Es werden je 300 µl Bindungspuffer zugegeben, die Proben in die FACS- Probenröhrchen überführt und innerhalb von einer Stunde am Durchflusszytometer analysiert. Puffer und Lösungen DPBS-Puffer: 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 6,5 mm Na 2 PO 4, 1,5 mm KH 2 PO 4, ph 7,4 Cycloheximid: sehr giftig! Propidiumjodid: sehr giftig! Auswertung: Wie ist die Qualität der Zellen? Forward gegen Sideward-Scatter auftragen Überlagerung der Kanäle für FITC Überlagerung der Kanäle für PI Auftragung PI gegen FITC welche Zellen sind apototisch, welche frühapoptotisch, welche nekrotisch, welche leben?

26 Zur Prüfungsakte verfügen Verwendete KMR Substanzen Nachname: Vorname: Matrikelnummer: Studiengang: Praktikum / Arbeitsbereich: Praktikum Zellbiologie ( CHE / ) Zeitraum / Datum: Verwendete KMR-Substanzen, Kat. I und II: Cas- Nummer Stoffname (IUPAC) und Cat. Verfahren und eingesetzte Menge Acrylamid 40%ige wässrige Lösung zur Polymerisation. Menge:25 ml Cycloheximid wässriger Lösung, 1 mg/ml Menge:10 µg Trypoanblau 0,5 %ige Lösung zum Zellen färben. Menge: 5 mg Kategorie (I oder II) K1B, M1B,R F 2 M2,R E 1B K1B Datum Unterschrift Studierende/r /r Datum Praktikumsleitung

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