Die Entwicklung der Keimbahn. wahrend der Embryogenese von Caenorhabditis elegans

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Bella Roth
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1 Die Entwicklung der Keimbahn wahrend der Embryogenese von Caenorhabditis elegans Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Universitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Sophie Charlotte Eisner von der Malsburg Thuine

zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.

2 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 1 Einleitung C. elegans als Modellorganismus in der Entwicklungsbiologie Die Embryonalentwicklung von C. elegans Die Keimbahn wird in den c/b-mutanten nicht entwickelt 10 Die Mutanten cib-l(e2300) und cib-l(2303) sind bisher am besten beschrieben 10 Weitere Mutanten in den Genen cib-2, cib-3 und cib Ziele dieser Arbeit 13 2 Ergebnisse 15 cib Der Phanotyp der Mutanten ist sehr variabel Klonierung des Gens cib-1 15 Kartierung und Klonierung des Gens cib-1 16 Das Gen cib-1 codiert fur die Thymidylat-Synthase 17 Die Aktivitat der Thymidylat-Synthase cib-1 wurde in vitro bestatigt dfe-7-rnai verursacht den gleichen Phanotyp wie cib-1 (e2300) 21 Kopie des Phanotyps von cib-1 -Embryonen durch cib-1-rnai in Wildtyp 22 Reduktion der Genfunktion mit RNAi von cib-1 in cib-l(e2300) Zwei weitere Gene zeigen den gleichen RNAi-Phanotyp wie cib-1 25 Die dutp-pyrophosphatase lost nach RNAi den gleichen Phanotyp aus 25 Auch die Thymidylatkinase lost nach RNAi den gleichen Phanotyp aus 26 Eine Inhibition der Synthase bewirkt einen Phanotyp in der spaten Embryogenese 28 Die Termination der Replikation nach ddttp-injektion hat keine Wirkung 29 Die Substitution von dttp oder Thymidin komplementiert nicht cib-l(e2300) 30 Mutanten in der Synthese anderer Nukleotide haben andere Phanotypen 31

4 Ziele dieser Arbeit 13 2 Ergebnisse 15 cib-1 15 2.1 Der Phanotyp der Mutanten ist sehr variabel 15 2.

3 . AST" Inhaltsverzeichnis 2.5 Die Mutante cib-l(e2300) ist mit div-l(tl642ts) vergleichbar 32 Die Mutante div-l(orl48) hat den gleichen Phanotyp wie cib-l(e2300) 32 Die Mutante div-l(tl642ts) arretiert am G2-Zellzyklus-Kontrollpunkt 34 Zellen in cib-l(e2300) arretieren in der G2-Phase wie Zellen in div-l(tl642ts) In cib-l(e2300) wird die DNA-Integritat mit atl-1 chk-1 kontrolliert 37 Die Menge und Integritat der DNA ist in cib-i-embryonen normal 37 Auch mit Histon: :GFP wird keine Veranderung der DNA-Integritat beobachtet 38 DNA-Integritat hangt von der Zellzyklus-Kontrolle ab Wahrend der gesamten Embryogenese wird Zellzyklus kontrolliert 41 cib cib-3(e2280) hat den typischen cib-phanotyp 44 cib-3(e2280) wurde zuerst durch Richard Feichtinger (1990) charakterisiert 44 Der Phanotyp von cib-3(e2280) wird bestatigt 45 Es gibt zusatzliche Defekte in der Gonadenentwicklung Klonierung des Gens cib-3 im Rahmen dieser Arbeit 4g Erste Kartierung der Mutante cib-3(e2280) durch Richard Feichtinger 48 Weiterfuhrende Kartierung der Mutante cib-3(e2280) Komplementation der Mutante cib-3(e2280) mit dem YAC Y23H5 Die codierende Sequenz von cib-3 ist nematodenspezifisch 2.10 In RNAi-Experimenten von cib-3 wird der cifc-3-phanotyp kopiert Kopie des Phanotyps von cib-3(e2280) durch cib-3-rn Ai in Wildtyp52 Reduktion der Genfunktion mit cib-3-knai in cib-3(e2280) Die Injektion von cib-3-dsrna ist effektiver als die Methode der FUtte 2.11 Keine Aktivierung der Zellzyklus-Kontrolle in cib-3(e2280) 2.12 cib-3 interagiert genetisch mit tlo25 Erste Beschreibung von tlo25 in der Diplomarbeit durch Richard Feichti Weitere Charakterisierung des Phanotyps von der Mutante tlo25 4R

G2-Zellzyklus-Kontrollpunkt 34 Zellen in cib-l(e2300) arretieren in der G2-Phase wie Zellen in div-l(tl642ts) 35 2.

4 Ill Inhaltsverzeichnis 2.13 Identifizierung von Interaktionspartnern von cib-3 61 Das System des Yeast-two-Hybrid 61 CIB-3 interagiert im Yeast-two-Hybrid mit sich selbst 61 Im Y2H interagieren mehrere Proteine spezifisch mit CIB-3 62 RACK-1 interagiert auch in C. elegans mit CIB-3 64 Weitere Interaktionspartner gehoren zur Proteinfamilie der Cathepsine L 66 Nur das Cathepsin L F57F5.1 interagiert in C. elegans mit CIB CIB-3 lokalisiert in alien Zellen im Cytoplasma 68 Der c/b-5-promotor wird auf einem Array nicht exprimiert 69 Ein CIB-3 ::GFP-Fusionsprotein lokalisiert in alien Zellen im Cytoplasma 70 cib-3(e2280)-embryomn mit CIB-3: :GFP fluoreszieren Proteine werden in Teilungen der P-Zellinie falsch segregiert 74 PIE-1 als spezifischer Transkriptionsfaktor wird in der Pl-Zelle falsch verteilt 74 MEX-5 wird ebenfalls ab der Pl-Zell-Teilung falsch segregiert Die Spindel in der Pl-Zelle dreht sich normal Keine corticale Polaritat nach symmetrischen Teilungen 81 PAR-2: :GFP lokalisiert nach symmetrischer Teilung nicht am posterioren Cortex 81 PAR-6::GFP lokalisiert vor symmetrischer Teilung am anterioren Cortex normal Die Pl-Zelle teilt sich in seltenen Fallen,,umgekehrt" 87 cib Der Phanotyp der Mutanten ist der typische c/fe-phanotyp 88 Erste Charakterisierung von cib-2(e2293) und cib-2(e2294) durch Claudine Eder 88 Uberpriifung des Phanotyps von cib-2(e2293) und cib-2(e2294) in dieser Arbeit Klonierung des Gens cib-2 durch Henning Schmidt cib-2 hat eine andere Funktion als cib-1 und cib-3 91 Die Zellzyklus-Kontrolle wird cib-2(e2294) in der adulten Keimbahn aktiviert 91 Die Segregation spezifischer Proteine in Mutanten von cib-2 ist normal 92

mit CIB-3 62 RACK-1 interagiert auch in C. elegans mit CIB-3 64 Weitere Interaktionspartner gehoren zur Proteinfamilie der Cathepsine L 66 Nur das Cathepsin L F57F5.1 interagiert in C.

5 Inhaltsverzeichnis IY 3 Diskussion cib-1 94 Das Gen cib-1 codiert fur die einzige Thymidylat-Synthase in C. elegans 94 Der RNAi von Genen der Thymidylat-Synthese fuhrt zum gleichen Phanotyp 95 cib-1 hat eine Funktion bei der Gametenentwicklung 96 Der Nukleotidmangel fuhrt zu einer verlangerten Interphase 96 Welcher Zellzyklus-Kontrollpunkt wird in cib-1 (e2300)-embryonen aktiviert? 97 Die Aktivierung der Zellzyklus-Kontrolle und die ts-phase von cib-l(e23oo) 100 Eine Qualitatskontrolle der DNA-Synthese in der Keimbahnentwicklung cib-3 m In cib-3(e2280) wird die Zellzyklus-Kontrolle nicht aktiviert wie in cib-l(e2300) 102 cib-3 codiert fur ein nematodenspezifisches Protein ohne bekannte Funktion 102 Auch cib-3 hat eine Funktion bei der adulten Keimbahnentwicklung 104 Die Segregation von keimbahnspezifischen Proteinen ist von cib-3 abhangig 104 cib-3 reguliert einen neuen Prozess in der embryonalen Keimbahnentwicklung 106 Wie wirkt CIB-3? 33 * Die Funktion von cib-2 in der Gonade unterliegt der Zellzyklus-Kontroll Maternales CIB-2 ist nicht an der Segregation von Proteinen beteiligt 3.4 Die Entwicklung der embryonalen Keimbahn in C. elegans Zwei neue, essentielle Prozesse fur die embryonale Keimbahnentwickhi 4 Material und Methoden 4.1 Abkurzungsverzeichnis 4.2 Verwendete Losungen und Medien 4.3 Verwendete Stamme 4.4 Haltung und Manipulation von C. elegans 4.5 Molekularbiologische Methoden 5 Literaturverzeichnis 6 Anhang

96 Welcher Zellzyklus-Kontrollpunkt wird in cib-1 (e2300)-embryonen aktiviert?

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