peqgold TriFast FL Methode für die gleichzeitige Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus flüssigen Proben.

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1 peqgold TriFast FL Methode für die gleichzeitige Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus flüssigen Proben. Best.-Nr ml ml ml Lagerung: Lichtgeschützt bei 4 C für 12 Monate haltbar. Beschreibung: peqgold TriFast FL ist ein gebrauchsfertiges Reagenz für die simultane Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus Probenmaterial humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen und viralen Ursprungs. Die Methode basiert auf einer Einschritt-Flüssigphasen-Separation. Mit ihrer Hilfe erhält man nicht-degradierte RNAs sowohl aus kleinen als auch aus großen Probenmengen. peqgold TriFast FL ermöglicht auch die gleichzeitige Bearbeitung großer Probenzahlen. peqgold TriFast FL enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat in einphasiger Lösung. Nach der Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf. Die wäßrige Phase enthält die RNA, die Interphase die DNA und die organische Phase die Proteine. Die Trennung mit peqgold TriFast FL ergibt qualitativ und quantitativ sehr gute Ausbeuten. Extrakte zahlreicher Zellsorten beinhalten in der endgültigen RNA-Fraktion noch Material unbekannter Zusammensetzung. Dieses Material ist wasserlöslich und alkoholunlöslich. Es bildet DNA- ähnliche Fäden und hat eine den Nukleinsäuren vergleichbare UV-Absorption. Es hat meist einen hohen Polysaccharidanteil und ist in Guanidinisothiocyanat löslich. Bei Hybridisierungen bewirkt es keine nachteiligen Effekte, führt aber letztlich zu falschen Berechnungen des RNA-Gehaltes. Zellen verschiedener Entwicklungsstadien enthalten unterschiedliche Mengen dieses kontaminierenden Materials. Die einfache Erweiterung der peqgold TriFast FL -Standardmethode durch eine anschließende peqgold OptiPure -Reinigung entfernt diese Verunreinigungen. WARNUNG: peqgold TriFast FL enthält die gesundheitsschädlichen Stoffe Phenol und Guanidinisothiocyanat. Arbeiten mit peqgold TriFast FL dürfen nur mit Handschuhen und Schutzbrille unter einem Abzug erfolgen. Ein Kontakt mit den Augen, der Haut und der Kleidung und ein Einatmen der Dämpfe muß vermieden werden. Sollte es dennoch zu einem Kontakt von peqgold TriFast FL mit der Haut oder den Augen kommen, sind die betroffenen Stellen für mindestens 15 Minuten unter fließendem Wasser zu waschen. Begeben Sie sich danach umgehend in ärztliche Behandlung. Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke geeignet. Es ist weder eine Verwendung für diagnostische Zwecke oder als Arzneimittel, noch eine Verabreichung an Menschen oder Tiere gestattet. PEQLAB_v0815_D 1

2 Gefährliche Inhaltsstoffe Bestandteile Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze TriFast FL DANGER Phenol 30-60%, Guanidinium thiocyanate 10-30%, 2-Mercaptoethanol <1%, CAS: , , H341, H301+H311+H331, H373, H314, H412, EUH032, P201, P280, P273, P301+P330+P331, P302+P352, P304+P340, P307+P310 H- und P-Sätze Erläuterungen H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen (Expositionsweg angeben, sofern schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). H301+H311+H331 Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H373 Kann die Organe schädigen (alle betroffenen Organe nennen) bei längerer oder wiederholter Exposition (Expositionsweg angeben, wenn schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H412 EUH032 P201 P280 P273 P301+P330+P331 P302+P352 P304+P340 P307+P310 A. Anleitung für die RNA-Extraktion Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/ waschen. BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. Bei Exposition: Sofort Giftinformationszentrum oder Arzt anrufen RNA-Extraktionen mit peqgold TriFast FL können in einer Stunde durchgeführt werden. RNA, die dabei extrahiert wird, ist nicht degradiert und frei von DNA und Proteinen. Sie kann für folgende Verfahren weiterverwendet werden: Northern-Analysen, PCR-Reaktionen, Dot-Blot-Hybridisierungen, Poly(A)+-Selektionen, in-vitro-translationen, Klonierungen und RNase-Assays. Wenn aus dem gleichen Material simultan DNA extrahiert wurde, ist es empfehlenswert, die Daten aus Northern-Analysen und anderen Verfahren auf die DNA-Werte, und nicht auf die weniger konstanten RNA-Werte, zu beziehen. PEQLAB_v0815_D 2

3 Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: - Chloroform - Isopropanol - 70 % Ethanol - Hochwertige Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Zentrifugation mit Phenol bei x g!!!) Die RNA-Isolierung mit peqgold TriFast FL besteht aus folgenden Schritten: 1. Homogenisierung 0.75 ml peqgold TriFast FL ml Probe 2. Phasentrennung Homogenat ml Chloroform 3. RNA-Präzipitation wäßrige Phase ml Isopropanol 4. Waschen der RNA 1 ml 75 % Ethanol 5. Lösen der RNA Formamid, 0.5% SDS oder Wasser Wenn nicht anders angegeben, wird die Extraktion bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Homogenisierung a. Biologische Flüssigkeiten: 0.75 ml peqgold TriFast FL mit 0.25 ml Probe pro 5-10 x 10 6 Zellen mischen und Zellen durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Pipette lysieren. b. Gewebesuspension: 0.75 ml peqgold TriFast FL mit 0.25 ml Probe in einem Glas-Teflon- oder einem Polytron- Homogenisator homogenisieren. Proben mit einem zu geringen Volumen sollten mit Wasser auf 0.25 ml aufgefüllt werden. 2. Phasentrennung Die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Pro 1 ml Homogenat 0.2 ml Chloroform zugeben, 15 Sekunden kräftig schütteln und für 3-10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Probe bei x g für 5 Minuten zentrifugieren um eine Phasenauftrennung zu erzielen. Es bilden sich drei Phasen: eine untere, rote Phenol-Chloroform-Phase und eine obere, farblose, wäßrige Phase und eine dazwischen liegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wäßrigen Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine in der dazwischen liegenden Interphase und in der organischen Phase befinden. Das Volumen der wäßrigen Phase beträgt etwa 70 % des eingesetzten peqgold TriFast FL - Volumens. Das verwendete Chloroform sollte frei von Zusätzen wie z.b. Isoamylalkohol sein. PEQLAB_v0815_D 3

4 3. RNA-Präzipitation Die wäßrige Phase in ein neues Röhrchen überführen und pro 0.75 ml eingesetztem peqgold TriFast FL 0.5 ml Isopropanol zugeben, mischen und für 15 Minuten bei 4 C inkubieren. Anschließend 15 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren. Am Boden des Röhrchens setzt sich das weiß-gelbe RNA-Präzipitat ab. Interphase und Phenolphase für eine eventuelle Extraktion von DNA und Proteinen bei 4 C lagern. 4. Waschen der RNA Überstand abnehmen und das RNA-Pellet durch zweimaliges Vortexen in 1 ml 75 % Ethanol und anschließendes Zentrifugieren (10 Minuten, x g, 4 C) waschen. 5. Lösen der RNA Das RNA-Pellet kurz an der Luft oder durch Anlegen eines leichten Vakuums trocknen lassen. Ein vollständiges Trocknen des Pellets verschlechtert die Löslichkeit der RNA und sollte deshalb vermieden werden. Die RNA nicht durch Vakuumzentrifugation trocknen lassen!!! Die RNA durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in deionisiertem Formamid, RNasefreiem Wasser oder in 0.5 %igem SDS lösen. Ein Erhitzen der RNA-Lösung auf C verbessert die Lösbarkeit. Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern sollten Wasser und SDS-Lösungen, die zum Lösen der RNA eingesetzt werden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt werden. peqgold TriFast FL extrahiert Gesamt-RNA einschließlich mrna und rrna. Die erhaltene Lösung ist frei von DNA und Proteinen und hat einen A260/280-Quotienten von Anmerkungen 1. Um RNase-Kontaminationen zu vermeiden, sollten während der gesamten Extraktion Handschuhe getragen und ausschließlich RNase-freie Lösungen und Geräte verwendet werden. 2. Erwartet man nur geringe Mengen von RNA (< 10 µg) sollten 70 µg Glykogen pro 1 ml peqgold TriFast FL als Carrier für die Präzipitation zugesetzt werden. 3. Nach der Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform können die Proben für einige Monate bei 70 C gelagert werden. Das RNA-Präzipitat kann in 75 %igem Ethanol für 1-3 Wochen bei 4 C oder bis zu einem Jahr bei 20 C gelagert werden. 4. Bei der Verwendung von Probenmaterial mit einem hohen Gehalt an Proteinen, Polysacchariden, Fetten oder anderen Bestandteilen ist ein Extra-Reinigungsschritt ratsam. Vor der Phasentrennung mit Chloroform werden die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation für 10 Minuten bei x g und 4 C entfernt. Der Überstand enthält die RNA, während im Pellet die Polysaccharide, extrazellulären Membranbestandteile und hochmolekularen DNAs zu finden sind. Bei Proben aus fettreichem Gewebe kommt es zur Bildung einer schaumartigen Fettschicht, die entfernt werden sollte. Der klare, RNA-haltige Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und die Phasentrennung wie beschrieben durchgeführt. 5. Ein hoher Gehalt an kontaminierendem Material kann auch durch eine Verdünnung der Probe mit Wasser vermieden werden. Dieses Verfahren ist bei Extraktionen von RNA (und DNA) aus Vollblut oder Serum üblich. Eine 1:1-Verdünnung mit Wasser ist dabei ausreichend. Anschließend wird nach dem Standardprotokoll verfahren. Erfahrungsgemäß können aus 1 ml Blut ca µg RNA extrahiert werden. PEQLAB_v0815_D 4

5 Troubleshooting Guide - RNA-Extraktion RNA-Menge zu gering: Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse RNA-Pellet nicht vollständig gelöst A260/280-Quotient < 1.65: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Probe wurde nach der Homogenisierung nicht bei Raumtemperatur gelagert Wässrige Phase war mit der Phenolphase kontaminiert RNA-Pellet nicht vollständig gelöst RNA-Abbau: Zellen wurden nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht direkt eingefroren Zellen wurden durch Trypsinierung zerstört Kontamination mit RNase während der Präparation Die verwendeten Proben wurden nicht bei 70 C gelagert Bei der Elektrophorese lag der ph-wert der Formaldehydlösung unter 3.5 Verringerung von Scherkräften verbessert das 18S und 28S Verhältnis der isolierten RNA DNA-Kontamination: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Die zur Extraktion verwendeten Proben enthielten organische Lösungen z.b. Ethanol, DMSO, konzentrierte Puffer oder hatten einen alkalischen ph-wert B. Anleitung für die DNA-Extraktion Während der Phasentrennung wird die DNA aus der wäßrigen Phase entfernt. Nach der Präzipitation der organischen Phase und einigen Waschschritten wird die DNA in 8 mm NaOH gelöst und neutralisiert. Die mit peqgold TriFast FL gereinigte DNA ist für die PCR, Southern Blotting und Restriktionsverdaus geeignet. Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: Ethanol Natriumcitrat Natriumhydroxid Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten und wird, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. DNA Präzipitation Phenolphase und Interphase ml Ethanol pro 0.75 ml peqgold TriFast FL 2. Waschen der DNA 1 ml 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol 2 ml 75 % Ethanol 3. Lösen der DNA 8 mm NaOH PEQLAB_v0815_D 5

6 1. DNA Präzipitation Wässrige Phase vollständig entfernen und die DNA durch Zugabe von 0.3 ml 100 % Ethanol pro 0.75 ml peqgold TriFast FL präzipitieren. Durch mehrmaliges Invertieren des Tubes sorgfältig mischen und für 2-3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die DNA sedimentieren durch Zentrifugation für 5 Minuten bei x g und 4 C. (Das sorgfältige Entfernen der wäßrigen Phase beeinflußt die Qualität der DNA in hohem Maße.) 2. Waschen der DNA Überstand (Ethanol/Phenolphase) entfernen und für die spätere Proteinextraktion bei 4 C lagern. Das DNA-Pellet zweimal mit 1 ml 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol waschen. Bei jedem Waschschritt die DNA für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 0.1 M Natriumcitrat / 10 % Ethanol inkubieren und danach für 5 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren. Nach den Waschschritten die DNA in 2 ml 75 % Ethanol aufnehmen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung sollte periodisch geschüttelt und anschließend für 15 Minuten bei x g und 4 C zentrifugiert werden. Werden mehr als 200 µg DNA erwartet, sollte ein dritter Waschschritt mit 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol angeschlossen werden. 3. Lösen der DNA Das DNA-Pellet durch Anlegen eines Vakuums für 5-10 Minuten trocknen und durch wiederholtes Aufziehen mit einer Pipette in 8 mm NaOH lösen. Die endgültige DNA-Konzentration sollte mit 8 mm NaOH auf µg/µl eingestellt werden. Für 107 Zellen werden ungefähr ml 8 mm NaOH benötigt. Diese Methode löst die DNA sehr wirksam. Trotzdem enthält die DNA- Lösung oft gelartige Bestandteile, die durch eine Zentrifugation für 10 Minuten bei x g entfernt werden können. Anschließend die DNA in ein neues Röhrchen überführen. Hohe Viskosität der DNA-Lösung deutet auf hochmolekulare DNA hin. Angaben zur Neutralisation der DNA sind in der Tabelle 1 auf Seite 6 zu finden. Bestimmung der DNA-Quantität Um die optische Dichte bei 260 nm optimal messen zu können, wird aus der DNA-Lösung ein Aliquot entnommen und mit Wasser verdünnt. Folgende Annahmen werden getroffen: - 1 A260 Unit entspricht 50 µg doppelsträngiger DNA diploide Zellen aus Mensch, Ratte und Maus enthalten eine theoretische DNA-Menge von 7.1 µg, 6.5 µg bzw. 5.8 µg. Typischerweise sollte 75 % der DNA aus Gewebe eine Größe von kbp haben und 25 % der DNA etwa 20 kbp groß sein. Bei DNA aus Zellen sind 80 % der Moleküle kbp lang und 20 % haben eine Größe von 20 kbp. Die DNA sollte von RNA und Proteinen frei sein und einen A260/280-Quotienten von > 1.7 haben. PEQLAB_v0815_D 6

7 Anwendungen 1. Amplifikation der DNA mittels PCR Nach dem Lösen der DNA in 8 mm NaOH wird der ph-wert mit 0.1 M HEPES auf 8.4 eingestellt. Für jede PCR-Reaktion zwischen 0.1 und 1.0 µg DNA verwenden. 2. Restriktionsverdau ph-wert mit HEPES auf einen angemessenen Wert einstellen (siehe Tabelle 1). Puffer nach Anleitung des Enzym-Anbieters zugeben und wie gewohnt verfahren. Tabelle 1 endgültiger ph-wert 100 mm HEPES (µl) endgültiger ph-wert 1 M HEPES (µl) Anmerkungen 1. Die Phenolphase und die Interphase können über Nacht bei 4 C gelagert werden. 2. Proben können über Nacht in 8 mm NaOH oder für 4 Monate in 75 % Ethanol bei 4 C gelagert werden. Für längere Lagerzeiten sollte der ph-wert auf 8.0 eingestellt und EDTA bis zu einer Endkonzentration von 1 mm zugegeben werden. Die DNA nicht einfrieren! Troubleshooting Guide - DNA-Extraktion Erwartete DNA-Mengen pro 10 6 Zellen Leber und Milz 3-4 µg Skelettmuskulatur, Gehirn und Plazenta 2-3 µg Kultivierte humane, Ratten- und Mauszellen 5-7 µg Fibroblasten 5-7 µg DNA-Menge zu gering Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse DNA-Pellet nicht vollständig gelöst A260/280-Quotient < 1.65 Phenol wurde nicht vollständig entfernt, DNA-Pellet mit 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol waschen DNA-Abbau Gewebe wurde nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht eingefroren Verwendete Proben wurden nicht bei 70 C gelagert Proben wurden mit zu hoher Geschwindigkeit homogenisiert und die DNA wurde zerstört PEQLAB_v0815_D 7

8 RNA-Kontamination Wässrige Phase wurde unvollständig entfernt DNA-Pellet wurde nicht sorgfältig genug gewaschen C. Anleitung für die Protein-Extraktion Proteine können nach der DNA-Präzipitation aus der Phenol/Ethanol-Phase extrahiert werden. Die erhaltene Proteinlösung kann für die Untersuchung spezieller Proteine z.b. mit Hilfe von Western Blotting weiterverwendet werden. Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: SDS Guanidinhydrochlorid Ethanol Isopropanol Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten und wird, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Protein-Präzipitation Phenol/Ethanol-Überstand ml Isopropanol pro 0.75 ml peqgold TriFast FL 2. Waschen der Proteine 2 ml 0.3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Ethanol, 3 x 20 Minuten, 1 x Ethanol (100 %) für 20 Minuten 3. Lösen der Proteine 1 % SDS 1. Protein-Präzipitation Proteine durch Zugabe von 1.5 ml Isopropanol pro 0.75 ml peqgold TriFast FL zum Phenol/Ethanol-Überstand präzipitieren. Die Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 10 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren. 2. Waschen der Proteine Überstand entfernen und das Proteinpellet dreimal mit 2 ml 0.3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Ethanol waschen. Die Proben jeweils für 20 Minuten in 0.3 M Guanidinhydrochlorid / 95 % Ethanol waschen bei Raumtemperatur inkubieren und für 5 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren. Anschließend das Protein-Pellet mit 2 ml 100 % Ethanol vortexen, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und erneut zentrifugieren (5 Minuten, x g, 4 C). 3. Lösen der Proteine Protein-Pellet durch Anlegen eines leichten Vakuums für 5-10 Minuten trocknen und durch Auf- und Abziehen mit der Pipette in 1 % SDS lösen. Um das Pellet vollständig zu lösen kann eine Inkubation bei C notwendig sein. Unlösliche Bestandteile durch eine Zentrifugation für 10 Minuten bei x g und 4 C entfernen und den Proteinüberstand in ein neues Röhrchen überführen. Die Proteinlösung kann sofort verwendet oder bei 20 C gelagert werden. PEQLAB_v0815_D 8

9 Anmerkungen 1. Der kritische Schritt bei der Proteinextraktion ist das Lösen der Proteine. Die folgende Alternative kann zu besseren Ergebnissen führen: Der Phenol/Ethanol-Überstand wird bei 4 C über Nacht gegen dreifach gewechseltes 0.1 %iges SDS dialysiert. Das Dialysat für 10 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren und den klaren Überstand für Western Blotting verwenden, oder bei 20 C einfrieren. 2. Die Proteine sind in 0.3 M Guanidinhydrochlorid in 95 %igem Ethanol oder in absolutem Ethanol bei 4 C für einen Monat und bei 20 C für mindestens ein Jahr stabil. 3. Proteine können in Anlehnung an die Bradford-Methode quantifiziert werden, wenn der SDS- Gehalt unter 0.1 % liegt. Troubleshooting Guide - Protein-Extraktion Protein-Menge zu gering: Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse Protein-Pellet nicht vollständig gelöst Protein-Abbau Gewebe wurde nicht direkt verarbeitet oder eingefroren Banden-Deformation bei der PAGE: Protein-Pellet nicht sorgfältig genug gewaschen PEQLAB_v0815_D 9

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