Sequenzierung. Sequenzierung. DNA in den letzten 50 Jahren. Warum Sequenzierung

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1 Sequenzierung von Thomas Grunwald Abteilung für Med. und Mol. Virologie Sequenzierung Hintergrund Allgemeiner Überblick Funktionsweise der Sequenzierung Sequenzierungsprotokoll Auswertung der Daten Probleme und Lösungen Vergleich mit anderen Sequenzen Werkzeuge zum schnellen Erfolg DNA in den letzten 50 Jahren Warum Sequenzierung Vor etwa 50 Jahren wurde gezeigt, dass die DNA der Träger der Erbinformation ist Watson und Crickentdeckten die Struktur der DNA Entdeckung des genetischen Codes in den 60er Jahren Anfang der 80er Jahren wurde die enzymatische Sequenziertechnik entwickelt 1995 Entschlüsselung des ersten Genoms eines Lebewesens Haemophilus influenzae(1,8 MB) 1999 Erstes menschliches Chromosom entschlüsselt Vollständige Roh-Sequenz einer Person (?) 2003 Entschlüsselung des Mausgenom Heute Verfügbare Nukleotide in Genbank: Einsatz der Sequenzierung: Überprüfung von cdna s Bestätigung einer Klonierung oder Mutation PCR-Produkte Untersuchung von Polymorphismen (z.b.: Vaterschaftstest) Herstellung von exakten Genkarten Entschlüsselung des Lebens (?)

2 Wie funktioniert Sequenzierung Mehrere Möglichkeiten der Sequenzierung DNA- 5 -AGCTGGTTAGCTAGATCGGCTAGATCGATCGATCGA -3 Doppelstrang 3 -TCGACCAATCGATCTAGCCGATCTAGCTAGCTAGCT -5 Genaue Analyse der DNA-Sequenz durch Bestimmung der Nukleotidabfolge Sequenzierreaktion nur möglich von einzelsträngiger DNA (ssdna) Chemische Methode (Maxam-Gilbert) Enzymatische Methode oder Didesoxy-Methode (Sanger): Sequenzierenmit Fluoreszenz oder mit Radioaktivität Markierte Primer (Dye-Primer) Markierte dntp s (Dye-Terminator) Gegenstrang muß durch eine Extra -Sequenzierung analysiert werden Chemisches Sequenzieren Prinzip der Herstellung unterschiedlicher DNA-Fragmente Entwickelt von Maxam und Gilbert 1977 Prinzip der DNA -Spaltung durch Chemikalien Markierung von ssdna mit 32 P Aufteilung in 4 Tubes 4 spezifische chemische Reaktionen Tube 1 nur G : DMS (Dimethylsulfat), Piperdine, 20min 37 C Tube 2 A + G : DMS, Formatsäure, Piperdine, ph 2, 30min 37 C Tube 3 C + T : Hydrazin, Piperdin, 10min RT Tube 4 nur C : Hydrazin in 1.5M NaCl, Piperdine, 15min 90 C Beispiel 1: Spaltung der DNA nach G: 32P-TGAAGCTCG Größe 32P-TG AAGCTCG 2 32P-TGAAG CTCG 5 32P-TGAAGCTCG 9 3 Fragmente Beispiel 2: Spaltung der DNA nach A und G: 32P-TGAAGCTCG Größe 32P-TG AAGCTCG 2 32P-TGA AGCTCG 3 32P-TGAA GCTCG 4 CTCG 5 32P-TGAAGCTCG 9 5 Fragmente

3 Chemisches Sequenzieren Didesoxy-Methode Auftragen der einzelnen Tubes auf ein Gel Als Marker alle Tubes mixen Gel-Elektrophorese und größenabhängige Trennung Aufnahme der Banden über Radiographie Analyse der Banden Tube 1: Tube 2: Tube 3: Tube 4: Nur G A + G C + T Nur C Mix Verwendung von markierten Primern oder markierten dntp s Einsatz von Didesoxy-Nukleotiden Thermostabiles Enzym für die Sequenzier-PCR Taq AGACTC Taq Sequenz:...TGAAGCTCG... AGACTCG AGACTCG 1. Beispiel: Radioaktiv-markierte Primer Analyse der Sequenz über Gelelektophrese 4 Reaktionen: Sequenz GAGTCAATTG Primer (P 32) ddatp dntp s Reaktionsmix GA GAGTCA GAGTCAA Primer (P 32) ddgtp dntp s Reaktionsmix G GAG GAGTCAATTG Primer (P 32) ddttp dntp s Reaktionsmix GAGT GAGTCAAT GAGTCAATT Primer (P 32) ddctp dntp s Reaktionsmix GAGTC Eine Reaktion pro Tasche Gel-Elektrophorese Aufnahme der Banden über Radiographie Sequenz: GAGTCAATTG ddatp ddgtp ddttp ddctp 32 Kettenverlängerung P-GGACGTGG 3 -CCTGCACCCTCAGTTAAC...

4 Markierung mit fluoreszierenden Farbstoffen Kapillar-Sequenzierung Reaktionsmix mit Didesoxy-Nukleotiden und normalen Desoxynukleotiden Didesoxy-Nukleotidesind mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert Vorteil: nur 1 Reaktion Jede Geltasche wird durch 1 Kapillare ersetzt Kapillaren fest im Gerät installiert Möglichkeit der Automatisierung Kettenverlängerung Primer -AGCT Primer -AGCT G Primer -AGCTGG Primer -AGCTGG A Primer -AGCTGGAC Gel T G G A C Laser 96-well Platte Laser Puffer Übersetzung in Sequenz TCCA GTTGACG Sequenzierprotokoll Standardprotokoll: Sequenzier- PCR Für Plasmid-DNA: Templatemind. 400ng (bis 1µg) Primer: 3 pmol Zyklenzahl für die Sequenzier- PCR: Bei großen Plasmiden >10kb initialedenaturierung 5 min Dünnwandig Tubes verwenden Endvolumen 20µl Für PCR s: Template30ng Primer: 3 pmol Zyklenzahl Meist unproblematisch Für die meisten Anwendungen geeignet: 95 2: : :30 35x 60 4:00 Ende oder 4

5 Aufreinigen der Sequenzier-PCR DNA-Fällung mit Natriumacetat (3M, ph: 4.6; 10vol%) und 2,5 faches Volumen 96% Ethanol Zentrifugation mindestens 15 Minuten, 4 C Nachwaschen mit 70% Ethanol Zentrifugation, 4 C Pellet trocknen Beachte: Je besser die Flüssigkeit abgenommen wurde, desto reiner die DNA Beladen der Proben Trockenes Pellet mit Probenpuffer aufnehmen Enthält Formamid Probendenaturierung bei 95 C Übertragen auf Eis und in das Sequenziergerät Beim Sequenziergel werden die Proben auftragen ähnlich einem Proteingel, wobei die Taschen mit geraden und ungeraden Zahlen zeitlich unterschiedlich beladen werden Bei Kapillarsequenzierereinfach nur Einsetzen einer 96-well Platte Während des Laufs des Sequenzierers Optik überprüfen und Hintergrund vermeiden Überprüfen des Stromflusses Puffertank im Auge behalten Hoffen Nachbearbeitung der Sequenzierdaten Schlechte Sequenzierungen verwerfen Viele N s in den Sequenzen Peaks zu niedrig Peaks nicht eindeutig Die Rohsequenz muss meist beschnitten werden Hintergrund in den Peaks überprüfen

6 Probleme und Lösungen I Probleme und Lösungen II Rohsignale schwach Signal mit Nebenpeaks meistens zu wenig DNA (bis zu 1µg sind möglich) zu wenig Primer oder Primer bindet schlecht zu geringe Zyklenzahl oder schlechte initiale Denaturierung Pellet schlecht resuspendiert Ausgangs-DNA nicht sauber Primer nicht in Ordnung (n-1 -Primer) schlechter Sequenzierkit (aliquotieren) Doppelpeaks durch Binden mehrerer Primer Primer bindet mehr als einmal Schlechte Analyse Kurze Sequenzen Gel nicht korrekt gelaufen Strom unterbrochen Puffer ausgelaufen Analyseparameter ändern Template mit Sekundärstrukturen Formamid im Auftragspuffer schlecht vor dem Auftragen denaturieren schlechte Aufreinigung Sequenzvergleiche Erstellen eines Contigs Sequenzen in ein geeignetes Format übertragen (.scf) Sequenzdaten in geeigneten Programm überprüfen Erstellen eines Sequenzen-Contigs Vergleichen mit Blast Vergleichen mit Align z.b.: Mit VectorNTI: Öffnen der Datei im ContigExpress Vergleichen der neuen Sequenz mit der Ursprungssequenz über Assemble Ein Contigist eine Sequenz aus mehreren überlappenden Sequenzierungseinzelstücken DNA-Abschnitt Sequenzen

7 Blast-Suche Im Internet unter (NCBI- Homepage) Für die Standard-Nukleinsequenz-Vergleiche blastn verwenden Sequenz in das Fenster einfügen Beachte: nur die zu vergleichende Sequenz einfügen! Formattierung verändern (nicht notwendigerweise) Format anklicken Werkzeuge zum schnellen Erfolg Verwendung von Standard-Primern T7, T3 M13 forward, M13 reverse TA-Klonierung (Invitrogen o.ä.) Klonieren in M13-Phagen-Plasmide (ssdna) Benutzen von Kits zur DNA -Aufreinigung (Qiagen o.ä.) Versenden der DNA-Probe mit Primer Literatur Lab FAQs von Roche Molecular Cloning von Sambrook, CSHL Press Gentechnologie für Einsteiger von T.A. Brown, Spektrum Sequenzier-Handbücher (ABI o.ä.), leider meist in Englisch Gelsequenzierer Kapillarsequenzierer Firmen ABI / PE Biosystems Beckman Coulter Pharmacia u.a. Sequenzierer

8 Taq DNA-Polymerase AmpliTaq CS AmpliTaq FS Klentaq1 Taquenase ThermoSequenase Thermostabile Enzyme

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