"Chromatographische Trennverfahren in der Organischen Chemie" Teil: DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE

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1 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite "Chromatographische Trennverfahren in der Organischen Chemie" Teil: DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE (Kurzfassung der Vorlesung, W. Stadlbauer ) 1. Allgemeines Geschichte: Vorläufer der DC sind Kapillarbilder (= Zirkularchromatogramme) von Farbstoffen (Runge, 1822). Namensgebung für Chromatographie durch Tswett (russischer Botaniker, 1903, Auftrennung von Pflanzenfarbstoffen an Calciumcarbonatsäulen; chromatos = Farbe; graphein = schreiben). Entwicklung der DC: Kuhn et al. (1931, Adsorptionschromatographie als Analysenmethode, Trennung von Carotinoiden); Izmailov, Schraiber (Ringchromatogramme auf Al 2 O 3 als Analysenmethode in der Pharmazie); Martin, Synge (1944, Nobelpreis 1952, Papierchromatographie von Aminosäuren); Stahl (1958, Durchbruch der DC, Namensgebung; engl. TLC); Halpaap, Ripphahn (1975, High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC). Anwendung - WANN: Bei schwerflüchtigen Substanzen, bei polaren und unpolaren Substanzen. - Kostengünstige Bearbeitung grosser Probenanzahl in kurzer Zeit; - wenn Probenmaterial GC- und LC-Säulen beschädigen würde; - wenn Detektion mit GC und LC nicht möglich oder sehr aufwendig sein würde; - wenn auch nach der Chromatographie alle Probenbestandteile erkennbar sein müssen (z.b. an Start oder Front); - wenn getrennte Bestandteile einzeln nachgewiesen oder detektiert werden müssen (z. B. Drogenscreening), - wenn keine elektrische Energie vorhanden ist. Anwendung - WO: In der Pharmazie und Drogenkunde, in der klinischen, forensischen und Biochemie (Wirkstoffe, Metaboliten), in der Kosmetologie (Farbstoffe, Konservierungs-, Parfüminhaltsstoffe, Tenside), in der Analytik (Lebensmittel-, Umweltanalytik, Analytik anorganischer und organischer Substanzen), in der Prozess- und Reinheitskontrolle im organischen Syntheselabor. Methoden und Anwendungsformen: Analytische Methoden: qualitative bzw. quantitative Identifizierung mit DC (veraltet: mit Papierchromatographie = PC) Präparative Methode: Präparative Schicht-Chromatographie (PSC): Isolierung der Einzelkomponenten aus chromatographisch aufgetrennten Gemischen durch Extraktion aus der Schicht. Vorteile der DC: Die DC ist eine rein physikalische Methode. Es tritt normalerweise kein Abbau oder Verlust und keine Umwandlung ein, d.h., man kann prinzipiell nach der Durchführung der Chromatographie das untersuchte Analysengut wieder quantitativ und unverändert zurückgewinnen. Literatur: Dünnschichtchromatographie (E. Hahn-Deinstrop), Wiley-VCH 1998 Qualitative und Quantitative Dünnschichtchromatographie (H. P. Frey, K. Zieloff) Wiley- VCH 1992 Dünnschichtchromatographie (H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer) Wiley-VCH 1993 Chromatographie (J. Becker), Vogel-Buchverlag, Würzburg, 1997 (auch für die anderen Teile der Chromatographievorlesung geeignet). Chromatographische Trennmethoden (G. Schwedt) Thieme Trennprinzipien Allgemeine Begriffe: Eine Lösung eines Substanzgemisches (mobile Phase) strömt über eine stationäre Phase (oberflächenreicher Feststoff oder Flüssigkeit, die mit der mobilen Phase nicht mischbar ist). Die in der mobilen Phase gelösten Substanzen haben unterschiedliche Affinität zur mobilen bzw. stationären Phase. Daraus resultieren unterschiedliche Laufstrecken der einzelnen gelösten Substanzen und es kommt zu einer Auftrennung in Einzelkomponenten.

2 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Konzentration: Der Zusammenhang zwischen Stoffmengenkonzentration in der stationären und mobilen Phase wird durch folgende Gleichung ausgedrückt. Diese Funktion wird als Sorptionsisotherme bezeichnet: Cs/Cm= K Cs ist die Konzentration in der stationären Phase, Cm die Konzentration in der mobilen Phase. Für geringe Stoffmengen gilt, dass das Verhältnis der beiden Konzentrationen konstant ist. Wenn die Sättigungskonzentration der stationären Phase erreicht ist, knickt die Kurve ab. Die Konstante K beschreibt im Geraden-Teil die Affinität der Substanz zur stationären Phase: Je grösser K ist, desto höher ist die Affinität zur stationären Phase, d.h., desto langsamer ist die Laufgeschwindigkeit. Trennprinzip Adsorption: Die Trennung erfolgt an der Oberfläche von feinverteilten stationären Phasen (polare Materialien wie z.b. Kieselgel oder Aluminiumoxid). Die Adsorbate (in der mobilen Phase gelöste Stoffe) werden umso stärker zurückgehalten, je polarer sie sind. Eine Desaktivierung der stationären Phase erfolgt durch Wasser und polare Lösungsmittel. Liste der Reihenfolge von polaren Gruppen nach steigender Polarität: Kohlenwasserstoffe < Aromaten < Halogen < O-Alkyl < NO 2 < NR 2 < COOR < CR=O < NH 2 < OH Trennprinzip Verteilung: Die Trennung erfolgt zwischen zwei nichtmischbaren Flüssigkeiten. Eine davon ist auf einem feinverteilten Träger fixiert (z. B. in den Kapillaren von Filterpapier, auf Cellulosepulver, Kieselgur, Dextrangel oder Polyamid). Die Trennung erfolgt nach dem Prinzip der multiplikativen Verteilung Beschreibung des Laufverhaltens R f -Wert (retarding factor, relate to front) dient zur Beschreibung des Laufverhaltens aufgetrennter Substanzen. b b... Laufstrecke der Substanz R f = a a... Laufstrecke des Laufmittels bis zum Mittelpunkt des Substanzflecks gemessen bei unregelmässigen Flecken: Angabe von R f -Bereichen Der Rf-Wert ist nur ein Richtwert, er variiert durch unterschiedliche Trennbedingungen. Der praktisch gefundene Wert ist daher oft sehr unterschiedlich. Bei einem Vergleich zwischen zwei Substanzen muss daher immer mit einem Standard verglichen werden, wobei beide auf derselben Platte aufgetragen werden müssen. Günstige Rf-Werte liegen zwischen 0.2 und 0.8 (unter 0.1 = Sitzenbleiber, über 0.9 = Frontläufer, daher keine Aussage möglich). Qualität der Trennung Als TRENNLEISTUNG wird die Zonenverbreiterung des Substanzflecks entlang der Trennstrecke in Abhängigkeit zur Bodenhöhe bezeichnet. Die Trennleistung ist eine Materialeigenschaft, sie wird durch die geometrische Struktur beeinflusst, d.h. vom Partikeldurchmesser (Korngrösse) und der Korngrössenverteilung. Die Trennstrecke hängt stark von der verwendeten Chromatographieart ab. So entspricht z.b. die Laufstrecke von 10 cm bei der HPTLC einer Laufstrecke von 2 m bei der Gaschromatographie. Als SELEKTIVITÄT wird der Rf-Wert-Unterschied für die getrennten Substanzen bezeichnet, und sie wird durch die chemische Struktur der stationären Phase und die Zusammensetzung des Laufmittels beeinflusst. Trennleistung und Selektivität ergeben zusammen die AUFLÖSUNG in einem Chromatogramm. Insgesamt ist die Auflösung entscheidend für die praktische Anwendung, d.h., ob zwei ähnliche Substanzen getrennt oder nicht getrennt werden (Substanzfleckverbreiterung oder zu kleine Rf-Wert-Unterschiede können eine Trennung verhindern). Quantitative Beziehung: Die Van-Deemter-Gleichung beschreibt diese Zusammenhänge mit drei Parametern: Streudiffusion, Molekulardiffusion und Ad- bzw. Desorption bewirken breitere, unscharfe und verlängerte Flecken.

3 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Empirische Einflussgrössen für die TRENNUNG - Einflüsse auf die stationäre Phase: Aktivität des Adsorbens, Luftfeuchtigkeit, Korngrösse und Korngrössenverteilung, Art des Bindemittels, Schichtdicke und Gleichmässigkeit der Schicht. - Einflüsse auf die mobile Phase: Laufmittelgradient, Fliessgeschwindigkeit, Verunreinigungen im Laufmittel (Einflüsse auf Aktivität durch polare Verunreinigungen, Änderung der Laufmitteleigenschaft durch saure oder basische Verunreinigungen), Veränderung des Laufmittels durch Verdunsten und Auftrennung der Komponenten. - Kammertyp und Konditionierung beeinflussen stark die Trennung, weiters beeinflusst die Kammersättigung die Rf-Werte. - Einflüsse durch unterschiedliche Fleckengrösse aufgrund der Trennleistung und der Auftragung, die Entfernung Start - Laufmitteloberkante, durch die Länge der Trennstrecke und den ph-wert des Laufmittels. 3. DIE STATIONÄRE PHASE Die wichtigste Voraussetzung für die Dünnschichtchromatographie als Routinemethode sind kommerziell erhältliche Sorbentien von gleichbleibender Qualität. Die allgemeinen Eigenschaften werden durch Art und Aktivität der Sorbentien bestimmt. Chemische Zusammensetzung und Struktur: Ein allgemeine Einteilung unterscheidet zwischen polaren bzw. hydrophilen Phasen (straight/normal phases) sowie unpolaren bzw. lipophilen Phasen (Umkehrphasen, reversed phases, RP). Daneben gibt es noch mittelpolare Phasen durch modifizierte Sorbentien. Praktische Bedeutung besitzen vor allem Kieselgel, modifizierte Kieselgelarten, Aluminiumoxid, Cellulose, modifizierte Cellulose und in Spezialfällen Polyamid. KIESELGEL wird für ca. 90% aller Trennungen verwendet. Kieselgel ist ein amorphes Pulver mit einigen Si-OH- Gruppen pro 10 nm2 an der Oberfläche. Kieselgel bildet mit den Trennsubstanzen vor allem Wasserstoffbrücken aus (Prinzip: Adsorptionschromatographie). Durch die Si-OH-Gruppen reagiert Kieselgel schwach sauer. modifiziertes Kieselgel: Bedeutung haben hydrophob gemachte Kieselgele, hergestellt durch Reaktion mit Silanen, die Amino-, Dihydroxy- oder Nitrilgruppen tragen (RP). Durch geeignete Reaktion erhält man auch chirale Kieselgele, die optisch aktiv sind und zur Trennung optischer Isomerer verwendet werden können. Probleme bei der Verwendung von Kieselgel: Isomerisierungen durch den schwach sauren Einfluss und die feine Verteilung auf einer grossen Oberfläche, Abbau (Ringöffnung) von b-lactamen, Kondensation von Aceton (das oft als Laufmittel verwendet wird). ALUMINIUMOXID (Prinzip: Adsorptionschromatographie) besitzt in der Dünnschichtchromatographie ähnliche Eigenschaften wie in der Säulenchromatographie. Es gibt neutrales, basisches (AlO 2 - hältiges) und saures (Al 3+ hältiges) Aluminiumoxid. Weiters werden verschiedene Aktivitätsstufen (Stufe I-V) durch Desaktivierung mit Wasser hergestellt. Dabei werden die aktivsten Stellen mit 0-18% Wasser belegt. Probleme: Es kann zur Verseifung von Estern kommen, oder es tritt Autoxidation von Fettsäuren ein. Auch Wanderungen von C=C-Doppelbindungen, die bereits erwähnte Kondensation von Aceton sowie Isomerisierungen können auftreten. POLYAMID Prinzip: Verteilungschromatographie durch polare Wechselwirkungen (H-Brücken) CELLULOSE (Prinzip: Verteilungschromatographie) verhält sich ähnlich wie die Papierchromatographie und ist daher besonders für hydrophile Substanzen geeignet, während reines Kieselgel und Aluminiumoxid vorwiegend für lipophile Substanzen geeignet ist (bei RP gelten die umgekehrten Verhältnisse). Typische Anwendungsbeispiele für Cellulose sind Aminosäuren und Kohlenhydrate. Acetylierte Cellulose (RP) wird für für polycyclische Aromaten, Chinone, Carbonsäuren verwendet. Cellulose-Ionenaustauscher sind für Peptide, Enzyme, Nucleotide, Nucleoside geeignet.

4 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Vergleich mit Papierchromatographie: Vorteile der DC: die Trennung verläuft viel schneller, die Folien und Platten sind auch mit aggressiven Lösungsmitteln besprühbar, es wird eine bessere Trennung (schärfere Flecken = bessere Trennleistung) erzielt. Vorteile der PC: die Chromatogramme sind besser archivierbar, man hat eine grössere Papierauswahl und die Materialien sind insgesamt billiger. Korn- und Porencharakteristik: Die Trennleistung wird von der geometrischen Struktur beeinflusst, die Selektivität hauptsächlich von der chemischen Struktur. Für eine gute Trennleistung wird ein kleiner Partikeldurchmesser und eine enge Korngrössenverteilung benötigt. Partikelgrösse und Form: Kieselgel für DC-Zwecke hat einen Partikeldurchmesser von 5-40 mm. Die Oberfläche und das Porenvolumen beeinflussen die in der Sorptionsisotherme dargestellten Adsorptionskraft. Die Oberfläche beträgt durchschnittlich m 2 pro Gramm, das Porenvolumen ca. 6 nm. Standardmaterial weist gebrochenes Material auf, sphärische Partikel (LiChrospher) besitzen gesteigerte Trennleistung. Schichteigenschaften: Die Schichtdicke beträgt ca mm in der Dünnschichtchromatographie und mm in der präparativen Schichtchromatographie. Als Binder wird meist Gips verwendet, das Plattenmaterial ist je nach Anforderungen Glas, Kunststoff oder Aluminium. Es gibt auch spezielle DC-Materialien, die eine Schicht mit Konzentrierungszonen enthalten. Daraus resultieren kleinere Flecken und eine bessere Auflösung. Schichtzusätze: Fluoreszenzindikatoren zur Detektion mittels Fluoreszenzlöschung (manganaktiviertes Zinksilikat...grün, säurestabile Wolframate...blau), Imprägnierungen zur schnellen Detektion (z. B. Coffein für polycyclische Aromaten). 4. DIE MOBILE PHASE Der Grund für das Strömen des Fliessmittels ist der Kapillardruck. Dieser hat seine Ursache darin, dass das das Fliessmittel von der ebenen Oberfläche des Vorratsgefässes in die kapillaren Hohlräume mit engem Krümmungsradius strömt, da dadurch die Oberflächenspannung verringert wird. Die Wahl des Laufmittels hat einen entscheidenden Einfluss auf die Trennung. Je stärker das Laufmittel an der stationären Phase adsorbiert wird, desto grösser ist seine Elutions- (Verdrängungs)-kraft, d.h., desto grösser wird der Rf-Wert der zu trennenden Substanzen. Im Extremfall wird das Adsorbat gar nicht mehr adsorbiert, da das Laufmittel bereits alle aktiven Stellen des Adsorbens besetzt hat. Einfluss des Laufmittels: Das Laufmittel hat daher zwei wichtige Eigenschaften in der DC: es ist sowohl Konkurrent um aktive Adsorptionsstellen und bewirkt auf der anderen Seite die Solvatisierung von Substanzen, d.h., die Lösung im Laufmittel. Die Zusammensetzung des Laufmittelgemisches muss nicht mit der MOBILEN PHASE identisch sein, da auch das Laufmittel chromatographiert wird (in der Verteilungschromatographie wird dem Laufmittel ausserdem noch z. B. das Wasser für die Ausbildung der stationären Phase entzogen). Dazu kommen noch Verdunstungseffekte, die das Auftreten von sog. b-fronten bewirken. Die Eigenschaften verschiedener Laufmittel werden in der Eluotropen Reihe für die Adsorptionschromatographie zum Ausdruck gebracht. Die eluotrope Reihe ist eine empirische Ordnung der Laufmittel nach steigender Elutionskraft (für Kieselgel und Aluminiumoxid) und entspricht im allgemeinen der Dielektrizitätskonstanten (in Klammern angeführt), mit Ausnahme einiger "Ausreisser", die durch andere Eigenschaften (z.b. Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen) verursacht werden: Cyclohexan (2) < Tetrachlorkohlenstoff (2) < Toluol (2) < Chloroform (5) < Dichlormethan (9) < Acetonitril (37) < 2-Propanol (22) < Essigester (6) < Aceton (21) < [Pyridin(12)] < Ethanol (25) < Dioxan (2) < THF (7) < Methanol (32) <[ Wasser (80) Es gilt allgemein, dass ab Essigester eine Desaktivierung der stationären (Adsorbens-)Phase eintritt.

5 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Umkehrung der eluotropen Reihe bei Polyamid als stationärer Phase (RP). Das Laufmittelgemisch für Verteilungschromatographie (Papierchromatographie und Cellulose) enthält stets einen unpolaren organischen Anteil und einen stark polaren Anteil (meist Wasser) Die polare Phase wird am Träger angereichert und bildet dadurch die stationäre Phase, während die mobile Phase lipophiler wird. Dadurch ist eine Auftrennung stark polarer Verbindungen möglich. 5. Kammersättigung: Ohne Kammersättigung verdampft ein Teil des Lösungsmittels in Frontnähe. Dadurch ist zwar mehr Laufmittel nötig, was besonders bei grossen Kammern zu berücksichtigen ist, auf der anderen Seite steigen die Rf-Werte, was bei Trennproblemen mit kleinen Rf-Werten von Vorteil sein kann. Gesättigte Kammern liefern lineare R f -Werte, was bei grossen R f -Werten von Vorteil ist. 6. Einfluss verschiedener Laufmittel auf ein Trennproblem: In unpolaren oder stark polaren Laufmitteln ist oft keine Trennung zu beobachten, während mässig polare Laufmittel im mittleren R f -Bereich die beste Auftrennung liefern. Ermittlung geeigneter Trennbedingungen: Die Festlegung der Trennbedingungen resultiert aus der Wechselwirkung der Faktoren MOBILE PHASE, STATIONÄRE PHASE und UNTERSUCHUNGSGUT. Man kann daraus eine logische "Wahrheitstabelle" ableiten, die die Zusammenhänge grob widerspiegelt, obwohl natürlich jedes Trennproblem am besten meist nur von einem Trennprinzip optimal gelöst wird. Untersuchungsgut Trennprinzip stationäre Phase mobile Phase hydrophil Adsorption inaktiv polar hydrophil (+) Verteilung hydrophil (+) unpolar (+) lipophil (+) Adsorption aktiv (+) unpolar (+) lipophil Verteilung lipophil polar Laufmittelwahl: bei komplizierten Problemen sind vor Beginn eigener Untersuchungen Literaturrecherchen von Vorteil. Dabei sollten toxische Komponenten durch ähnliche aus der eluotropen Reihe ersetzt werden. Um einen groben Überblick zu erhalten, welches Laufmittel für das Trennproblem geeignet ist, können durch einen Spot- Test auf einer DC-Folie mehrere Laufmittel auf ihre Eignung untersucht werden. Dazu lässt man nach dem Auftragen der Substanz das Lösungsmittel verdunsten. Dann setzt man eine Kapillare mit dem zu testenden Laufmittel in die Mitte des Substanzflecks auf und lässt das Laufmittel auf diese Weise zufliessen. Dadurch erhält man ein zirkulares Chromatogramm, das grob anzeigt, ob die Substanz in dem getesteten Laufmittel überhaupt läuft, und ob eine Trennung zu beobachten ist. Häufig verwendete Laufmittel: für die gängigen Trennprobleme haben sich die folgenden Laufmittelgemische bewährt: DC auf Kieselgel: Aceton-Toluol 1:10 (für eher unpolare Substanzen) Chloroform-Aceton 7:3 (für eher polare Substanzen). Bei sehr polaren Substanzen kann (wenig) Ethanol oder Methanol zugesetzt werden, Carbonsäuren laufen durch Zusatz von einigen Tropfen Eisessig besser, bei basischen Verbindungen kann mit Pyridin oder Triethylamin eine bessere Trennung erreicht werden. Wenn man vor der Entscheidung steht, welches Laufmittel(gemisch) man für ein bestimmtes Trennproblem verwenden soll, so ist vor allem die Struktur der zu trennenden Substanzen zu berücksichtigen. Hier kann mit der alten Chemikerweisheit "similia similibus solvuntur" eine grobe erste Entscheidung getroffen werden.

6 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite DC(=PC) auf Cellulose n-butanol-aceton-eisessig-wasser 3:3:7:2 (für saure Substanzen) i-propanol-ammoniak-wasser 6:3:1 (für basische Substanzen) Auch hier gilt wieder, dass Säuren in stark sauren Laufmitteln getrennt werden, Basen in basischen Laufmitteln. 7. Praktische Hinweise zur Durchführung Handhaben der Fertigschichten: Zuschneiden und Kanten versäubern, Platte möglichst nicht berühren. Die Aktivität entspricht der Luftfeuchigkeit des Labors, daher ist ein Voraktivieren normalerweise nicht notwendig. Probenvorbereitung: kein besonderes Thema; bei der Adsorptionschromatographie keine wasser-feuchten Proben verwenden. Die Substanz muss vollständig gelöst sein. Wenn nur ein Teil gelöst ist, so würde das eine vollkommen falsche Zusammensetzung der Probe vortäuschen. Daher ist es wichtig, ein gutes, aber leicht flüchtiges Lösungsmittel zu verwenden. Dieses sollte ausserdem ungiftig sein, nicht zu polar und nicht zu hoch siedend sein. Polare Lösungsmittel erzeugen in der Startzone Ringchromatogramme, die im Extremfall 2 Substanzen vortäuschen können. In der Adsorptionschromatographie wird zum Lösen meistens ACETON verwendet. In der Verteilungschromatographie auf Cellulose wird zum Lösen meistens WASSER oder ETHANOL verwendet Probe und Vergleich müssen im gleichen Lösungsmittel gelöst sein, um keine nichtreproduzierbare Desaktivierung der Platte zu erhalten. Auftragen der Probe: Da die Rf-Werte manchmal konzentrationsabhängig sind, müssen Vergleichssubstanzen auf derselben Platte wie die Probe chromatographiert werden. Bei der Dünnschichtchromatographie wird die Substanz punktförmig aufgetragen, bei der Präparativen Schichtchromatographie bandförmig. Die Substanz darf nicht zu konzentriert aufgetragen werden, da sonst Schwanzbildung durch Übersättigung der Schicht auftritt. Erklärbar ist das durch gekrümmte Adsorptionsisothermen. Vor dem eigentlichen Chromatographievorgang muss das Lösungsmittel vollständig entfernt werden, da sich sonst die Laufmittelzusammensetzung für die einzelnen Substanz-Probanden in nicht reproduzierbarer Weise ändert (unterschiedliche Laufstrecken, b-fronten). Analytische Chromatogramme: Zuerst wird die Startlinie markiert (bei der aufsteigenden DC ca mm vom unteren Rand entfernt). Die Laufstrecke soll mindestens 7-10 cm betragen. Die Markierung wird mit einem weichem Bleistift am äusseren Rand durchgeführt. Am oberen Rand können noch weitere Beschriftungen angebracht werden (meist Probenbezeichnungen). Präparative Trennungen werden meist auf 20x20cm-Platten mit 2 mm Schichtdicke durchgeführt. Im Abstand von 2-3 cm vom unteren Rand wird eine Startlinie aufgetragen (mit einem Auftragegerät oder mit Lineal und Pipette). Die Startlinie wird mit Auftragegeräten aufgebracht, man kann dabei bis ca. 200 mg Substanz auftrennen. Es muss auf genügend Laufmittelvorrat geachtet werden. Auftragemethoden: Man verwendet Kapillaren oder Spritzen, deren Volumen für qualitative Untersuchungen nicht bekannt zu sein braucht. Diese Kapillaren kann man selbst aus Glasrohren oder Schmelzpunktsröhrchen über dem Bunsenbrenner ziehen. Auftragen für qualitative DC's: Kapillaren aufsetzen, Kapillaren sollten sich vollständig füllen und entleeren. Die Konzentration soll möglichst so gewählt werden, dass ein einmaliges Auftragen ausreicht. Die Startzonen sind vor dem nächsten Auftragen und dem Entwickeln vollständig zu trocknen. Auftragemethoden für quantitative Untersuchungen: Man verwendet Mikrokapillaren mit definiertem Volumen. Für DC verwendet man Volumina von ml, für HPTLC Volumina von ml. Zur reproduzierbaren Auftragung gibt es spezielle Auftragegeräte.

7 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Positionierung der Proben: bei quantitativen DC's wird doppelt aufgetragen (um eine Plattenhälfte versetzt), um Ungleichmässigkeiten der Schicht auszugleichen. Bei Identitätsproblemen wird überlappend aufgetragen, weil dadurch ein besserer Vergleich möglich ist als durch nebeneinanderliegende Flecken. 8. ENTWICKELN Aufgabe des Laufmittels: Das Laufmittel soll nicht nur das Substanzgemisch lösen, sondern auch die Trennsubstanzen über die Sorbensschicht transportieren und das anstehende Trennproblem durch geeignete Trennstrecken (R f -Werte) lösen. Anforderung an das Laufmittel: Ausreichende Reinheit - ausreichende Stabilität - geringe Viskosität - lineare Adsorptions/Verteilungsisotherme - mittlerer Dampfdruck - geringe Toxizität. Reinheit des Laufmittels: Für qualitative Untersuchungen ist die Reinheit der üblichen Lösungsmittel ausreichend (eventuelle Verunreinigen könnten auch aus der Entwicklungskammer stammen, wenn z.b. das Laufmittel die Startflecken löst). Für quantitative Untersuchungen sind hochgereinigte Lösungsmittel für die Chromatographie notwendig. ACHTUNG: manchen Lösungsmitteln sind Stabilisatoren zugesetzt (Chloroform kann z.b. Ethanol enthalten). Begriff der MOBILEN PHASE: Das Laufmittel wird bei der Wanderung in eine flüssige stationäre Phase (in die Poren des Sobens) aufgetrennt. Bei der Verteilungschromatographie kommt es zur Verarmung an Wasser, bei der Adsorptionschromatographie zur Verarmung an polaren Laufmittelbestandteilen. Der Rest = mobile Phase. Durch unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der Laufmittelbestandteile: Ausbildung von b-fronten. Die Auswahl der Laufmittel erfolgt nach der eluotropen Reihe (gilt streng nur für Kieselgel); zuerst mit mittlerer Elutionskraft und reinen Lösungsmitteln beginnen. Niedrige Viskosität ist vorteilhaft (Zeitfaktor). Die Toxizität ist zu beachten, ebenso das Auftreten von b-fronten, denn diese täuschen falsche R f -Werte vor und vermindern die Selektivität. Ansetzen und Aufbewahren von Laufmitteln: Die einzelnen Teilvolumina müssen einzeln abgemessen werden und dann erst gemischt werden, sonst kommt es zu Fehlern durch Volumsänderungen. Die Zusammensetzung ist in Volumsteilen angegeben. Das Mischen erfolgt bereits im Vorratsbehälter, erst dann wird das Laufmittel in die Chromatographie-Kammer gegeben und gut verschlossen halten, um teilweises Verdampfen/Verdunsten zu verhindern. Das Laufmittel in der Chromatographie-Kammer darf nicht zu oft wiederverwendet werden: maximal 2-3 mal, denn durch ungleiche Verdunstung, chemische Reaktion der Komponenten oder bevorzugte Adsorption einer Komponente kann es zur Verarmung von Laufmittelanteilen kommen. Dadurch ändert sich die Laufmittelzusammensetzung in unkontrollierter Weise. Bedenkliche Laufmittel (Benzen, Ether, CKW) und kritische Laufmittel (Säuren, Alkohole, Ester) beachten. Die gebräuchlichste Technik ist die Aufsteigende Entwicklung: Dabei wird die DC-Platte so in die Kammer gestellt, dass die DC-Schicht unterhalb der Startpunkte benetzt wird (die Startpunkte dürfen auf keinen Fall in das Laufmittel tauchen!). Durch die Kapillarkräfte steigt das Laufmittel max. ca. 20 cm hoch und transportiert dabei das Trenngut. Die Startflecken vergrössern sich zur Front hin. Wenn die gewünschte Laufhöhe erreicht ist, wird die Platte aus der Kammer genommen, die Laufmittelfront am Rand durch Einritzen oder mit einem Bleistift markiert, und die Platte getrocknet. 8.8 Mehrfachentwicklung: jeweils nach Zwischentrocknung und eventueller Rekonzentrierung erfolgt eine erneute Entwicklung. Meist verwendet man verschiedene Laufmittel, um z.b. unpolare Verunreinigungen an die Front zu befördern, bevor man das eigentliche Substanzgemisch auftrennt. Durchlaufentwicklung: Dazu verwendet man eine DC-Kammer mit einem Schlitz im Deckel. Während der Entwicklung verdampft das Lösungsmittel kontinuierlich an der Front und man erreicht dadurch eine bessere Auflösung für kleine Rf-Werte, während grosse Rf-Werte zusammengestaucht werden.

8 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Horizontale Entwicklung: man verwendet eine eben liegende Platte, das Laufmittel wird z.b. über einen seitlichen Docht oder Kapillarspalten zugeführt. 9. DC-Trennkammern Kammer-Arten: Hier gibt es zwei Arten: mit grossem Gasraum (Normal-Kammer) und kleinem Gasraum (Sandwich-Kammer). Der Grund dafür ist, dass bei grossen Kammern und präparativen Platten der Laufmittelverbrauch oft so gross ist, dass das Laufmittel nicht immer bis zum Ende der Trennung ausreicht. Das wird durch die Sandwichtechnik vermieden. Die gesättigte Normalkammer ist für 2 DC-Platten bis zum Format 20x20 cm geeignet. Die Wände werden mit Filterpapier ausgekleidet, wobei das Filterpapier so zugeschnitten wird, dass seitlich ein Sichtfenster frei bleibt, um den Trennvorgang beobachten zu können. Die Kammer wird 1 cm hoch mit Laufmittel gefüllt. Bei der nichtgesättigter Kammer fliesst mehr Laufmittel durch Platte, da ein Teil des Laufmittels an der Front verdampft. Daraus resultieren grössere Rf-Werte in der unteren Hälfte des Chromatogramms. andere Kammerarten: Normalkammer für 2 Platten, Schräge Kammer (braucht weniger Laufmittel), runde Kammern (z.b. für analytische DC's). Die Doppeltrogkammer hat eine Schwelle am Boden der Kammer. Man kommt dadurch mit weniger Lösungsmittel aus, sie wird auch für Vorbeladung verwendet. Kammern mit kleinem Gasraum: Die Sandwichkammer wird dann verwendet, wenn die Schicht nicht mit Laufmitteldampf vorbeladen werden soll. Die Linearkammer wird für die horizontale Entwicklung benötigt. Meist verwendet man diese Technik für die HPTLC. Um den Laufmittelverbrauch klein zu halten, wird in einer Sandwichtechnik durch eine Gegenplatte der Gasraum klein gehalten, der Laufmittelzufluss erfolgt seitlich über Kapillarspalten in einem Glasstreifen. Diese Kammerart ist besonders für hohe Probenzahlen und schnelle Analysen geeignet (70 Parallelproben). Durchführung der Entwicklung: Während der Entwicklung dürfen keine grossen Temperaturschwankungen auftreten, da es sonst zur Ausbildung unregelmässiger Fronten kommt. Die Platten sind auch stets vor Sonnenlicht zu schützen, da sonst die Gefahr besteht, dass Photoreaktionen auf der Platte stattfinden. Eindimensionale Entwicklung: häufigste Entwicklung, speziell bei quantitativen DC's. Mehrdimensionale Entwicklung: Die erste Auftragung erfolgt in einer Ecke, zuerst wird aufsteigend nach oben entwickelt und getrocknet. Dann wird die Platte um 90 gedreht und erneut in einem anderem Laufmittel entwickeln. Dadurch kann auf einer einzigen Platte durch die Vortrennung eine bessere Trennwirkung erzielt werden. Für schwertrennbare Gemische, oder zum Nachweis von Reaktionen, die während der Entwicklung auf der Platte auftreten. 10. Trocknen: Das Laufmittel muss schnell von der Schicht entfernt werden, da sonst nachträgliche Diffusion die Flecken vergössert und die Qualität des Chromatogramms verschlechtert. Auf der Platte befindliches Laufmittel verschlechtert auch die nachfolgende Detektion. Das Trocknen erfolgt waagrecht, bei empfindlichen Substanzen mit kalter Luft, sonst mit warmer Luft (nicht zu heiss trocknen, da sonst durch Thermolyse und Abdampfen der Substanzen die Qualität des Chromatogramms verschlechtert wird). Entsorgen des Laufmittels in die entsprechenden Behälter; dann DC-Kammer gut reinigen, da sonst Verschmutzungen Artefakte auf den nachfolgenden Chromatogrammen bewirken. Die Kammer muss gut getrocknet werden, um eine unkontrollierte Veränderung des nächsten Laufmittels zu verhindern.

9 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite DETEKTION: Nach dem Entwickeln und Trocknen werden die getrennten Substanzen detektiert. Visuelle Detektion: färbige Substanzen sind direkt auf dem Chromatogramm im sichtbaren Licht erkennbar (Farbstoffe, färbige Verbindungen) Detektion mit UV-Strahlung: Dazu verwendet man schwache UV-Lampen (ca. 15 W) mit Wellenlängen von 254 und 366 nm. Substanzen, die das UV-Licht von 254 nm absorbieren (Aromaten, längere konjugierte C=C-Systeme), verringern die Emission des auf der Platte aufgebrachten Fluoreszenzindikators F 254. Durch diese Fluoreszenzlöschung (quenchen) erscheinen die Substanzen als dunkle Flecken auf fluoreszierendem hellgrünem oder hellblauen Untergrund. Da die Löschung bei UV-absorbierenden Substanzen proportional zur Substanzmenge ist, kann man hier auch grobe quantitative Aussagen treffen. Substanzen, die durch UV-Licht von 366 nm zur Eigenfluoreszenz angeregt werden, erscheinen als leuchtende farbige Flecken am dunklen Chromatogramm. Diese Fluoreszenz ist stark strukturabhängig und kann keinesfalls zu einer mengenmässigen Beurteilung herangezogen werden. Derivatisierung ist immer dann notwendig, wenn die Substanzen nicht färbig sind und auch auf UV-Licht durch quenching oder Fluoreszenz nicht (oder nicht genügend) ansprechen. Auch kann eine Steigerung der Selektivität und eine Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit erreicht werden. Der häufigste Fall ist die postchromatographische Derivatisierung nach dem Entwickeln und Trocknen. Dies wird durch Aufbringen von Nachweisreagenzien erreicht. Buchhinweis: Dünnschichtchromatographie - Reagenzien und Nachweismethoden (H. Jork, W. Funk, W. Fischer) Wiley - VCH 1993 Anfärbereagenzien für Dünnschicht- und Papierchromatographie (Reagenzien - Merck, Darmstadt, 1980). Derivatisierungsreaktionen: - Thermo- oder Photochemische Reaktion: Zersetzung, Reaktion mit modifizierten Kieselgelschichten - Aufsprühen von Nachweisreagenzien (häufigste Technik) - Tauchen von DC-Platten (umweltfreundlicher, billiger) - Bedampfen von DC-Platten - Reaktion mit Iod, Chlor,... Derivatisierung durch Aufsprühen: Dazu ist ein Laborsprüher mit Druckluft oder Treibgas notwendig. Das Besprühen muss immer im Abzug oder in einer Sprühbox durchgeführt werden, um die giftigen, aggressiven Reagenznebel und Lösungsmitteldämpfe nicht einzuatmen (Handschuhe und Schutzbrillen!). Das Chromatogramm wird schräg in die Sprühbox gestellt, dann wird mit gleichmässigem Sprühnebel auf die Platte gesprüht. Es ist darauf zu achten, dass sich keine Tröpfchen bilden. Es wird solange gesprüht, bis die Schicht leicht glänzt. Oft muss nach dem Sprühen erwärmt werden, um die Reaktion zwischen Substanzflecken und Reagens zu vervollständigen. Die entstandenen Flecken müssen sofort mit Bleistift gekennzeichnet werden, denn oft verblassen diese nach kurzer Zeit. Derivatisierung durch Tauchen: Statt Sprühen kann man auch Tauchvorrichtungen verwenden, die z.t. automatisiert sind. Vorteile gegenüber Sprühen: gleichmässigere Belegung der Schicht - keine Abhängigkeit vom Sprühgerät - exakte quantitative Auswertung - bessere Reproduzierbarkeit - keine Kontamination des Arbeitsplatzes - keine Sprüheinrichtung mit Abzug notwendig. Manuelles Tauchen ist nicht gut reproduzierbar, aber einfach. Automatische Tauchgeräte: mit definierter Verweilzeit, Senken und Heben sind gut reproduzierbar. Tauchlösungen sollten weniger konzentriert sein als Sprühlösungen, Wasser wird meist durch Alkohol ersetzt. Die Trennsubstanzen dürfen nicht im Tauchmittel löslich sein. Grosse Substanzmengen und lange Tauchzeiten bilden "Kometenschweif". Nach dem Tauchen wird die Platte mit Luft abgeblasen und getrocknet. Oft muss nach dem Tauchen noch erwärmt werden, um die Reaktion zu beschleunigen. Die entstandenen Flecken müssen auch hier sofort mit Bleistift gekennzeichnet werden, denn oft verblassen diese nach kurzer Zeit.

10 Skriptum: Chromatographische Trennverfahren Seite Beispiele von Derivatisierungsreagenzien. Ninhydrin für den Nachweis von Aminosäuren, Aminen,...(0.2% Ninhydrin in Ethanol, Sprühen oder Tauchen) Vanillin - Schwefelsäure für höhere Alkohole, Steroide, etherische Öle...(0.5-1% Vanillin in Ethanol/konz. Schwefelsäure [1:10], Sprühen oder Tauchen) Ammonmolybdat-Cersulfat für höhere Alkohole, Steroide,...(4% Ammonmolybdat und 10% Cer(IV)sulfat in 10% Schwefelsäure, Sprühen oder Tauchen) Anisaldehyd-Schwefelsäure für Polyalkohole, Steroide, Terpene...(1% Anisaldehyd in konz. 2% Schwefelsäure/ Eisessig, Sprühen oder Tauchen) Kaliumpermanganat für Polyalkohole, Polycarbonsäuren, ungesättigte Verbindungen...(1% KMnO 4 in Wasser oder Sodalösung, Sprühen oder Tauchen) Bedampfen mit Ioddämpfen - unspezifischer Nachweis vieler Substanzen...(Glasschale mit Iod in verschlossenem Glasgefäss) Bedampfen mit Chlor und nachfolgende Reaktion mit KI/Stärke für den Nachweis von Säureamiden (Chlor aus KMnO 4 /Salzsäure erzeugen, dann mit KI/Stärkelösung sprühen). 12. AUSWERTUNG Visuelle Auswertung: qualitativ: Bei der Kontrolle von Syntheseansätzen zur Identifikation oder Reinheitsprüfung muss man immer mit Vergleichs-(Referenz)-substanzen am selben Chromatogramm arbeiten, denn die Rf-Werte sind nicht genau reproduzierbar. Bei unklaren Ergebnissen müssen auch Konzentrationsreihen hergestellt werden, denn die Rf-Werte ändern sich z.t. durch nichtlineare Sorptionsisothermen mit der Konzentration. Wenn die Rf-Werte sehr ähnlich sind, so stellt man sich - wenn vorhanden - ein Gemisch aus den beiden zu untersuchenden Substanzen her und untersucht, ob sich beide trennen lassen. Eventuell muss noch mit geänderten Laufmitteln experimentiert werden. halbquantitativ: Man kann durch Konzentrationsreihen eine Untersuchung durchführen, ob Grenzwerte deutlich unter- oder überschritten werden. Dazu wird die Probe und mehrere Konzentrationen der interessierenden Substanz am selben Chromatogramm aufgetragen. Die ähnlichsten Flecken werden nochmals nebeneinander aufgetragen. Die Auswertung erfolgt durch visuellen Vergleich oder Messung der Fleckendurchmesser. Die Genauigkeit beträgt dabei etwa ± 10%. quantitative optische Auswertung: Zur direkten quantitativen Auswertung werden gleiche Volumina von Standard und Probe auf die Platte aufgetragen. Nach dem Entwickeln wird das Chromatogramm mit dem Spektralphotometer abgescannt. Dazu wird das Chromatogramm mit UV/vis im Absorptionsmaximum in Reflexion vermesssen. Zusätzlich gibt es noch Kopplungsmethoden zur Substanzidentifikation (z.b. FT-IR, RAMAN und MS) Etwas ungenauer wird das (meist derivatisierte) Chromatogramm digitalisiert und durch ein Computerprogramm ausgewertet. 13. DC-Auswertegeräte: UV-Vis DC-Scanner: analoges Spektralphotometer-System mit Photomultiplier, sehr genau, aber empfindlich und störungsanfällig. Auswertung mittels Digitalisierung: Digitaler Bildaufnahmeteil und Datenverarbeitung, aber derzeit noch keine exakte quantitative Auswertung möglich; Vorteil: einfach, billig, robust. 14. DC-Chromatographiekurs (im Rahmen der organisch-chemischen Übungen) = Photochemische Umlagerung von Azobenzen, Auftrennung der (E)- und (Z)-Isomeren mittels N N N N Dry-Flash-Chromatographie (oder mittels DC im LA-Praktikum)) und DC-Analyse der Extrakte. =Auftrennung eines Aminosäurengemisches und DC-Identifizierung nach Derivatisierung mit trans (E) - Azobenzen cis (Z) - NH 2 O O O Ninhydrin R + O OH O N =DC-Analyse eines unbekannten Substanzgemisches und Identifizierung durch O OH O UV-Detektion sowie Derivatisierung durch Tauchen in Vanillin-Schwefelsäure