Funktionelle Charakterisierung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase des Hepatitis-C-Virus

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1 Funktionelle Charakterisierung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase des Hepatitis-C-Virus Untersuchung molekularer Mechanismen der Substratspezifität von DNA-abhängigen DNA-Polymerasen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie an der Ruhr-Universität Bochum angefertigt am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund vorgelegt von Janina Cramer aus Düsseldorf

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3 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von März 2001 bis April 2004 am Max-Planck- Institut für molekulare Physiologie in Dortmund unter der Anleitung von Herrn Prof. Dr. Alfred Wittinghofer durchgeführt. 1. Gutachter: Prof. Dr. Alfred Wittinghofer 2. Gutachter: Prof. Dr. Hermann Weingärtner Eidesstattliche Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Dortmund, 22. April 2004

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5 I. EINLEITUNG 1 A Das Hepatitis-C-Virus (HCV) 1 1. Klassifizierung und Aufbau des Virus 1 2. Weltweite Verbreitung 3 3. Der Lebenszyklus 4 4. Die Übertragung von HCV und Pathogenese der Virusinfektion 6 5. Therapie 7 6. Die virale Polymerase Struktur der HCV-Polymerase Biochemische Charakterisierung der HCV-Polymerase Oligomerisierungsverhalten RNA-Bindung Der Initiationsmechanismus Self-priming Mechanismus P/t-abhängige Synthese De novo Synthese (primerunabhängige Synthese) 14 B DNA-abhängige DNA-Polymerasen Charakteristika und Klassifizierung Substratspezifität von DNA-Polymerasen Die HIV-1 Reverse Transkriptase Struktur der HIV-1 Reversen Transkriptase Mechanismus der Reversen Transkriptase katalysierten Polymerasereaktion Das Klenow Fragment Struktur des Klenow Fragments Mechanismus der durch das KF katalysierten Polymerasereaktion Die Dbh-bypass-Polymerase Die Y Familie der DNA-Polymerasen Die DinB Subfamilie Die Struktur der Dbh-bypass-Polymerase Funktionelle Aspekte der Dbh-bypass-Polymerase 27 C Zielsetzung Funktionelle Charakterisierung der Polymerase des Hepatitis-C-Virus 27

6 2. Untersuchungen zur Substratspezifität von DNA-Polymerasen 28 II. MATERIAL Chemikalien Modifizierte und radioaktiv markierte Nukleotide Proteine und Standards Nährmedien für die Kultivierung von Bakterien Bakterienstämme und Plasmide Oligonukleotide RNA-Oligonukleotide DNA-Primer/Template-Substrate Geräte und Materialien Säulen und Säulenmaterial Puffer 36 III. METHODEN 37 A Molekularbiologische Methoden Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in Lösungen Reinigung von DNA bzw. RNA mittels Phenol-/Chloroform-Extraktion Isopropanolfällung von Nukleinsäuren Restriktionshydrolyse von DNA Isolierung von DNA aus Agarosegelen Ligation von Plasmid-DNA Herstellung elektrokompetenter Escherichia coli-zellen (E. coli) Transformation von E. coli durch Elektroporation von Plasmid-DNA Glyzerinkulturen von Bakterien Plasmidisolierung aus Bakterien im kleinen Maßstab Plasmidisolierung aus Bakterien im großen Maßstab DNA-Sequenzierung 41 B Proteinbiochemische Methoden Denaturierende SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese SDS-(PAGE) Proteinexpression Zellaufschluss durch Ultraschall Proteinkonzentrationsbestimmung Konzentrationsbestimmung durch Absorptionsbestimmung bei 280 nm 45

7 4.2 Konzentrationsbestimmung nach Bradford Konzentrationsbestimmung nach Ehresmann Aufkonzentrierung und Umpuffern von Proteinlösungen Reinigung von Fragmenten der HCV-Polymerase (NS5B) Ni-NTA-Säule Poly(U)-Säule Reinigung der Dbh-Polymerase Hitzedenaturierung HiTrap SP Säule Gelfiltration Reinigung der HIV-1 Reversen Transkriptase Erste Ammoniumsulfatfällung DNA/RNA-Fällung DEAE-Säule Heparin-Säule Zweite Ammoniumsulfatfällung Gelfiltration Reinigung des Klenow Fragments der E. coli DNA-Polymerase Ni-NTA-Säule Gelfiltration Nachweis von freien Cysteinen mit Ellmanns Reagenz Farbstoffkopplung am freien Cysteinrest der Dbh-Polymerase MALDI-TOF Massenspektroskopie (MS) RNAse-Test Test auf Terminale Transferase (TNTase) Aktivität 57 C Nukleinsäuren Denaturierende Polyacrylamid-Harnstoff Gelelektrophorese (PAGE) Präparative Polyacrylamid-Harnstoff Gelelektrophorese (PAGE) Analytische Polyacrylamid-Harnstoff Gelelektrophorese (PAGE) Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Radioaktive Markierung von DNA bzw. RNA am 5 -Ende durch die T4 Polynukleotid Kinase (PNK) Endmarkierung von Oligonukleotiden Markierung eines Dinukleotid-Primers Oxidation der 3 -Hydroxylenden von Oligonukleotiden 61

8 5. Kopplung von Mansylchlorid an modifizierte Oligonukleotide Reversed Phase HPLC-Reinigung Herstellung von DNA/DNA- und RNA/RNA-Primer/Template 63 D Enzymkinetische Methoden Gleichgewichts-Fluoreszenzspektroskopie Transiente Fluoreszenzmessungen (Stopped-Flow) Transiente Fluoreszenzmessungen durch Relaxation nach einem Drucksprung Quench-Flow Messungen Charakterisierung sehr schneller Einbaukinetiken Charakterisierung langsamer Einbaukinetiken Auswertung des zeitabhängigen Nukleotideinbaus Ermittlung der Affinität der Nukleotide zur Polymerase Auswertung des konzentrationsabhängigen Nukleotideinbaus Untersuchungen zum Nukleotideinbau durch die HCV-Polymerase Nukleotid-Einbaustudien mit Hilfe radioaktiv markierter Primer Nukleotid-Einbaustudien mit Hilfe radioaktiv markierter Nukleotide Filterbindungsassays Analytische Gelfiltration Gelshift-Analysen Untersuchung von Oligomerisierungszuständen mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS) Bestimmung von Polymeraseaktivitäten Standard Polymeraseassay zur Abschätzung der Aktivität von HIV-1 RT Standard Polymeraseassay zur Abschätzung der Aktivität von HCV-Polymerase 78 IV. ERGEBNISSE 79 A Biochemische Charakterisierung der Hepatitis-C-Virus Polymerase Klonierung und Expression von NS5B 21 und NS5B Präparation von NS5B 21 und NS5B Biochemische Charakterisierung von NS5B 21 und NS5B Standardpolymerasetest Test der Präparation auf RNase-Verunreinigungen Test der Präparation auf Terminale Transferase Verunreinigungen Optimierung der Pufferbedingungen Optimierung der Reaktionstemperatur 87

9 3.6 Bestimmung der Anzahl der Oberflächencysteine durch Ellmann s Reagenz Oligomerisierungsverhalten von NS5B 21 und NS5B Untersuchung des Oligomerisierungsverhaltens mittels analytischer GF Untersuchung des Oligomerisierungsverhaltens durch native PAGE Untersuchung des Oligomerisierungsverhaltens durch DLS Charakterisierung der RNA-Bindung durch NS5B 21 und NS5B Affinität verschiedener Nukleinsäuresubstrate zu NS5B 21 und NS5B Bestimmung der Affinität zu dsrna Bestimmung der Affinität zu ssrna Kinetik der RNA-Bindung an die HCV-Polymerase Bestimmung der Assoziation von ssrna und HCV-Polymerase Bestimmung der Dissoziation von ssrna von der HCV-Polymerase Charakterisierung der Polymeraseaktivität von NS5B 21 und NS5B Primerabhängige Synthese De novo Synthese Primerabhängige Synthese mit einem Dinukleotidprimer Test des Konzeptes Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von ATP während der Initiation Affinität von ATP während des korrekten Nukleotideinbaus Stabilität des Initiationskomplexes Variation der Vorinkubationszeit Vorverdünnungen in verschiedenen Puffern Verlängerung des Dinuklotidprimers in Anwesenheit verschiedener Nukleotide 114 B Untersuchung der molekularen Mechanismen der Substratspezifität von DNA-Polymerasen Präparationen der verschiedenen DNA-Polymerasen Präparation der Dbh-bypass-Polymerase Präparation des Klenow Fragments Präparation der HIV-1 RT Biochemische und kinetische Charakterisierung der Dbh-bypass-Polymerase Charakterisierung der DNA-Bindung durch die Dbh-bypass-Polymerase Kopplung von Mansylchlorid an Oligonukleotide Farbstoffkopplung am freien Cysteinrest der Dbh-Polymerase Affinität verschiedener DNA/DNA-p/t zur Dbh-Polymerase 124

10 2.1.4 Kinetik der Dbh-p/t-Assoziation Kinetik der Dbh-p/t-Dissoziation Charakterisierung des Nukleotideinbaus durch die Dbh-bypass-Polymerase Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von T R TP Affinität von T R TP während des korrekten Nukleotideinbaus Ratenbestimmung des Fehleinbaus von T R TP Affinität von T H TP während des Fehleinbaus Bestimmung des Elementeneffekts beim korrekten Einbau von α-s-ttp Bestimmung des Elementeneffekts beim Fehleinbau von α-s-dttp Charakterisierung des Nukleotideinbaus durch das Klenow Fragment Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von T R TP Affinität von T R TP während des korrekten Nukleotideinbaus Ratenbestimmung des Fehleinbaus von T R TP Affinität von T R TP während des Fehleinbaus Charakterisierung des Nukleotideinbaus durch die HIV-1 RT Ratenbestimmung des korrekten Einbaus von T R TP Affinität von T R TP während des korrekten Nukleotideinbaus Ratenbestimmung des Fehleinbaus von T R TP gegenüber einem Template G Affinität von T R TP während des Fehleinbaus Zusammenfassung der Ergebnisse beim Nukleotideinbau durch HIV-1 RT wt, HIV-1 RT M184V, KF - und Dbh 145 V. DISKUSSION 148 A HCV-Polymerase Terminale Transferase Aktivität Funktion der Oberflächencysteine der HCV-Polymerase Oligomerisierungsverhalten der HCV-Polymerase RNA-Bindung durch die HCV-Polymerase Initiationsmechanismen der HCV-Polymerase Primerabhängige Synthese De novo Synthese Dinukleotidprimer Template Switching Übergreifende Diskussion zu den funktionellen Aspekten der HCV-Polymerase 167

11 B Substratspezifität von DNA-Polymerasen Dbh-bypass-Polymerase HIV-1 RT Klenow Fragment Übergreifende Diskussion zu den molekularen Mechanismen der Substratspezifität von DNA-Polymerasen 177 VI. ZUSAMMENFASSUNG 181 A Funktionelle Charakterisierung der HCV-Polymerase 181 B Untersuchungen zur Substratspezifität von DNA-Polymerasen 182 VII. ANHANG 184 A Grundlagen der Kinetik Ermittlung der Dissoziationskonstanten (K d ) aus Gleichgewichts-Fluoreszenztitrationen Analyse von Verdrängungstitrationen mit dem Programm Scientist 186 B Definitionen 187 C Abkürzungsverzeichnis 187 D Literaturverzeichnis 190 VIII. DANKSAGUNG 209

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13 Einleitung 1 I. Einleitung A Das Hepatitis-C-Virus (HCV) 1. Klassifizierung und Aufbau des Virus Aus dem Plasma eines chronisch an Non-A-non-B-Hepatitis erkrankten Schimpansen gelang Ende der 80er Jahre die Isolierung des Genoms des Hepatitis-C-Virus 1,2. Die Analyse des Isolats durch Sequenzierung ergab, dass es sich um ein einzelsträngiges RNA-Virus positiver Polarität mit einer Länge von etwa Nukleotiden handelt 1,3-5. Der Aufbau des Hepatitis- C-Virus ist mittlerweile gut bekannt. Es handelt sich dabei um ein sphärisches, etwa 50 nm großes, umhülltes RNA-Virus (vgl. Abbildung I-1). Das HC-Virus wurde nach dem internationalen Komitee der Nomenklatur und Taxonomie von Viren in die Familie der flaviviridae, in einem neuen Genus der Hepaciviren zugeordnet 6. Abbildung I-1: Schematischer Aufbau des Hepatits-C-Virus (Quelle: Visible Genetics; Das HCV-Genom (Abbildung I-2) besteht aus einem einzigen offenen Leserahmen, der von nichtkodierenden Sequenzregionen flankiert wird (NCR s). Die nichtkodierende Region am 3 Ende (3 NCR) des HCV-Genoms besteht aus drei verschiedenen Abschnitten, der variablen Region, der polyuridinreichen Region und der hochkonservierten 98 Nukleotide langen

14 2 Einleitung Region am äußeren 3 Ende 7-9. Es wird spekuliert, dass die 3 NCR als Element der Replikation des RNA-Genoms dient. Die Translation eines Aminosäuren langen Vorläuferproteins erfolgt über eine interne Ribosomenbindungsstelle, die in der nichtkodierenden Region am 5 -Ende des HCV-Genoms lokalisiert ist 10,11. Durch zelluläre und virale Proteasen erfolgt die ko- und posttranslationale Spaltung des Polyproteins in 10 verschiedene Produkte. Ein weiteres Protein scheint in einem überlappenden Leserahmen in der Sequenz des Core (C)-Proteins kodiert zu sein Am N-Terminus des Vorläuferproteins sind die sog. strukturellen Proteine C, E1, E2 und p7 lokalisiert. Die Prozessierung des Polyproteins in die einzelnen reifen strukturellen Proteine erfolgt durch Signalpeptidasen der Wirtszelle. Das dabei entstehende C-Protein bildet später das Kapsid des Virus, welches schützend das virale Genom umgibt 15 (vgl. Abbildung I-1). Die beiden Glykoproteine E1 und E2 sind Bestandteil der für umhüllte Viren charakteristischen Membranhülle, die das Nukleokapsid umgibt 16. Bei dem letzten der vier strukturellen Proteine handelt es sich um das kurze hydrophobe Peptid p7, welches die strukturellen von den nichtstrukturellen (NS) Proteinen trennt. Bis heute ist die Funktion dieses Peptids unklar 17. Die nichtstrukturellen Proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B sind für die Replikation des viralen Genoms erforderlich. Im Gegensatz zu den strukturellen Proteinen erfolgt die Prozessierung des Polypeptids im Bereich der NS-Proteine durch virale Proteasen. Die Spaltung der Verbindung zwischen NS2 und NS3 wird autokatalytisch über die NS2-Protease und der N-terminalen Proteasedomäne von NS3 erreicht 18,19. Charakterisierungen der NS2/3-Proteaseaktivität führten bisher zu zwei Annahmen. Zum einen wird vermutet, dass es sich dabei um eine Cysteinprotease handelt, mit Histidin- und Cystein-Aminosäureseitenketten, die essentiell für die autokatalytische Spaltung sind 20. Eine andere Vermutung ist, dass es sich um eine Metalloproteaseaktivität handelt, die durch Metallionen stimuliert und in Anwesenheit von EDTA inhibiert werden kann 18,19. Das NS3-Protein besitzt insgesamt drei enzymatische Funktionen: Eine N-terminale, Chymotrypsin ähnliche Serin-Protease, die für die Spaltung der restlichen Polyproteinsequenz in die nichtstrukturellen Proteine NS4A, NS4B, NS5A und NS5B verantwortlich ist 21,22. Die verbleibende C-terminale Sequenz beinhaltet eine Nukleosidtriphosphatase, sowie eine Helikaseaktivität 23,24. Das Polypeptid NS4A ist ein essentieller Kofaktor der NS3-Serinprotease 21,21,21,25,26. Es wird als integraler Bestandteil in die N- terminale β-barrel -Struktur des NS3-Enzymkerns eingelagert 27,28. Die Funktion des hydrophoben NS4B-Proteins ist nicht bekannt. Es scheint jedoch eine direkte Beteiligung an der Modulation der NS5A-Hyperphosphorylierung aufzuweisen 29,30. Die für die Phosphorylierung von NS5A erforderlichen zellulären Kinasen konnten ebenfalls bislang noch nicht identifiziert werden. NS5A ist nachweislich an der Resistenzentwicklung von infizierten Zellen gegen die antivirale Aktivität von Interferon-α (IFN-α) beteiligt Außerdem konnte eine

15 Einleitung 3 direkte Interaktion von NS5A mit der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) NS5B gezeigt werden 35. Diese Interaktion scheint eine dosisabhängige Modulation der Polymeraseaktivität nach sich zu ziehen. Abbildung I-2: Schematische Darstellung des HCV-Genoms und der darauf kodierten viralen Proteine. 2. Weltweite Verbreitung Weltweit leiden nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) etwa 170 Millionen Menschen an einer chronischen Hepatitis C Infektion 36. In Deutschland sind etwa Personen chronische Träger des Hepatitis-C-Virus. Jährlich kommen schätzungsweise Neuinfektionen hinzu. Das HC-Virus zählt heute zu den 10 häufigsten Todesursachen in Deutschland. Aufgrund der weltweiten Verbreitung des Virus besitzt diese Erkrankung den Status einer Epidemie (vgl. Abbildung I-3). Dennoch ist die globale Verbreitung des Virus aufgrund der unterschiedlichen medizinischen und hygienischen Standards sehr ungleichmäßig. Während die Prävalenz in Zentraleuropa mit einem Prozent relativ niedrig ist, finden sich in anderen Teilen der Welt wesentlich höhere Durchseuchungsraten: In Ostasien und Indien zeigt sich eine Prävalenz von 1,5 bis 1,9 %, in Nordafrika und Saudiarabien werden Größenordnungen von bis zu 2,1 % angegeben. In Ägypten ist der Anteil an mit HCVinfizierten Menschen mit 24 % am höchsten. Dort wurde HCV in der Vergangenheit durch infizierte Spritzen und Kanülen im Zuge einer parenteralen Therapie der Schistosomiasis weitergegeben.

16 4 Einleitung Abbildung I-3: Weltweite Verbreitung des HC-Virus (Entnommen aus The Hepatitis C Viruses C. H. Hagedorn und C. M. Rice Springer-Verlag 2000). 3. Der Lebenszyklus Derzeit existiert nur ein sehr lückenhaftes Verständnis hinsichtlich des Lebenszyklus des HCVirus. Hauptproblem hierbei ist die eingeschränkte Verfügbarkeit eines geeigneten Zellkultursystems. Bislang war es ausschließlich möglich das Virus in Tiermodellsystemen wie dem Schimpansen zu untersuchen 37. Kürzlich ist es jedoch gelungen, ein subgenomisches Replikon des HC-Virus zu etablieren, mit dem detailliertere Untersuchungen der viralen Replikation möglich sind 38. Studien mit diesem Replikon dürften zu einem entscheidenden Fortschritt bei der Entschlüsselung molekularer Details der HCV-Replikation beitragen. Die natürlichen Wirtszellen des Virus sind Hepatozyten. Dies konnte durch den Nachweis hoher Konzentrationen an HCV-RNA und NS-Proteinen in Biopsiematerial der Leber geklärt werden 39. Es herrscht jedoch eine kontroverse Diskussion inwieweit das Virus in der Lage ist sich auch in anderen Gewebetypen als der Leber zu replizieren. So konnte das Virus ebenfalls in periphären mononukleären Zellen (PBMC s) sowie in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Sperma und Tränen nachgewiesen werden. Das Andocken des Viruspartikels an seine Zielzelle erfolgt vermutlich über die Interaktion des glykosylierten Hüllproteins E2 mit dem zellulären Oberflächenrezeptor CD81 LDL-Rezeptor diskutiert Als möglicher alternativer Eintrittsweg wird der. Das zweite Hüllprotein E1 scheint an der Membranfusion beim

17 Einleitung 5 Eintritt des Virus in die Zelle beteiligt zu sein 44. Detaillierte Analysen über die zelluläre Aufnahme des Virus gibt es derzeit aufgrund des fehlenden Zellkultursystems jedoch nicht. Abbildung I-4: Lebenszyklus des Hepatits-C-Virus. Die Virusvermehrung erfolgt ausschließlich im Zytoplasma der Wirtszelle (Abbildung I-4). Das virale Genom wird anders als bei HIV bzw. als beim Hepatitis-B-Virus (HBV) nicht in das Genom der Wirtszelle integriert. Die Replikation des HCV-Genoms erfolgt durch einen membranassoziierten Replikationskomplex in unmittelbarem Kontakt mit den Membranstrukturen des endoplasmatischen Retikulums (ER) 45. Dies konnte auch bei einigen anderen (+)-Strang-RNA-Viren wie z.b. beim Poliovirus und bei Flaviviren beobachtet werden 46,47. Alle nichtstrukturellen Proteine zeigen eine deutliche Kolokalisation mit den Membranen des ER s 45, Die NS-Proteine NS2, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B scheinen im direkten Kontakt zur Membran zu stehen, während die Helikase NS3 indirekt über den Kofaktor NS4A kolokalisiert. Des Weiteren wurden zahlreiche Interaktionen zwischen den NS Proteinen nachgewiesen Diese Beobachtungen unterstützen die These, dass ein hochgeordneter Multiproteinkomplex für die Replikation des viralen Genoms erforderlich ist. Die replikative Aktivität ist hoch, und die tägliche Produktion von Virionen beläuft sich auf etwa 10 12, was einer Rate von etwa 50 Partikeln pro Hepatozyte entspricht Die hohen Replikations- und Fehlerraten der viralen Polymerase gehen mit einer schnellen Ausbildung von Virusvarianten einher. Die hohe Variabilität der Aminosäuresequenz einer kleinen Region innerhalb der NS5B-kodierenden Sequenz, führte zu einer Klassifizierung des Hepatitis-C-Virus in 6 Genotypen mit jeweils mehreren Subtypen 58. In einem einzigen HCV-infizierten Patienten

18 6 Einleitung existiert das Virus nicht als eine definierte Variante, sondern als Gemisch vieler verschiedener Virusvarianten, die sich oft nur durch wenige Aminosäuren unterscheiden 59. Diese nur geringfügig von der Hauptsequenz abweichenden Virusvarianten werden als Quasi-Spezies bezeichnet. 4. Die Übertragung von HCV und Pathogenese der Virusinfektion HCV wird praktisch durch jeden direkten Blutkontakt (wie bei Transfusionen oder beim unmittelbaren Kontakt zweier offener Wunden) verbreitet. Viele Träger dieses Virus wurden während Bluttransfusionen in den 70ern und 80ern mit dem Virus infiziert. Bluter und Dialysepatienten wurden zu dieser Zeit mit 90 %iger Wahrscheinlichkeit durch kontaminierte Lösungen infiziert. Durch effektive Tests, die seit 1990 durchgeführt werden, wurde dieser Übertragungsweg jedoch drastisch eingeschränkt und macht heute weniger als 5 % der Gesamtübertragung aus. Das Übertragungsrisiko durch sexuelle Kontakte oder während der Schwangerschaft und Stillzeit wird mit 6 % als eher gering eingestuft. Nadelstichverletzungen im Gesundheitswesen aber auch beim Tätowieren, beim Piercen, bei der Akupunktur und beim Drogenkonsum sind dagegen eine sehr häufige Übertragungsursache. Dabei stellt der Drogenkonsum mit 30 bis 40 % die Hauptursache dar. Der Verlauf einer chronischen HCV-Infektion ist individuell sehr unterschiedlich. Menschen und Schimpansen sind bislang die einzigen bekannten Wirte, bei denen das Virus eine Infektion hervorrufen kann. Der Krankheitsverlauf ist dabei sehr ähnlich. Die Infektion verläuft in den allermeisten Fällen vom Betroffenen völlig unbemerkt. Eine akute Phase, die sich durch Gelbfärbung der Haut und grippeähnliche Symptome äußert, tritt bei HCV- Patienten eher selten auf. Häufigere Symptome sind harmlosere Beschwerden wie Müdigkeit, Abgeschlagenheit, Gelenkschmerzen, Appetitlosigkeit, die fälschlicherweise meist anderen Ursachen zugeschrieben werden. Bei etwa 20 % der Patienten gelingt es dem Immunsystem das Virus in der akuten Phase zu eliminieren. Der überwiegende Teil von ca. 80 % entwickelt jedoch eine chronische Form der Hepatitis (vgl. Abbildung I-5). Die chronische Entzündung der Leber führt schließlich zu einer starken Schädigung des Lebergewebes. Diese erfolgt dabei nicht in erster Linie durch das Virus selbst, sondern durch das eigene Immunsystem das die Leberzellen angreift. Der Anteil an vernarbtem (fibromatösem) Gewebe nimmt ständig zu, so dass die Leber immer weniger ihre Aufgaben wahrzunehmen vermag. In über 20 % der Fälle entsteht eine Leberzirrhose, wie sie auch häufig bei Alkoholikern zu beobachten ist (vgl. Abbildung I-5). Das Risiko Leberkrebs vor dem Hintergrund einer Leberzirrhose zu entwickeln ist eher selten und beträgt etwa 1 bis 4 % Trotzdem gilt Hepatitis C heute als eine der wichtigsten, indirekten Ursachen des primären Leberkrebs. Der

19 Einleitung 7 Infektionsverlauf erstreckt sich über einen Zeitraum von 20 bis 30 Jahren und endet in der Regel tödlich. Abbildung I-5: Fortschritt der HCV-Infektion. Aus der chronischen Hepatitis entwickelt sich eine voranschreitende Zirrhose, die zu einem hepatozellulären Karzinom führen kann (Quelle: 5. Therapie Die gegenwärtig am häufigsten angewendete Therapie besteht aus einer Kombination des Nukleosidanalogon Ribavirin und Interferon α2b. Bei einer Behandlungsdauer von 48 Wochen schlägt die Therapie in 40 % der Fälle an 64,65. Dieser Prozentsatz stellt jedoch einen Durchschnittswert dar. Die verschiedenen Genotypen des Virus reagieren unterschiedlich gut auf diese Therapie. Außerdem kommt es bei einigen der zunächst erfolgreich behandelten Patienten zu Rückfällen. Seit einigen Jahren wird auch ein modifiziertes Interferon α2b in Kombination mit dem Guanosin ähnlichen Ribavirin eingesetzt. Dieses sog. pegylierte Interferon hat den Vorteil, dass es über längere Zeit in gleichbleibenden Konzentrationen im Körper vorliegt und daher nicht täglich gespritzt werden muss. Hierdurch konnte eine Verbesserung der Ansprechrate auf 54 % im Vergleich zur Behandlung mit Ribavirin und unpegyliertem Interferon erzielt werden. Aber auch hier können Rückfälle auftreten und zudem ist die Ansprechrate bei Trägern des HCV-Genotyp 1, der in Europa vorherrscht, wesentlich geringer 66,67.

20 8 Einleitung 6. Die virale Polymerase Bei dem NS5B-Genprodukt handelt es sich um die virale Polymerase, einem 66 kda großen, membranassoziierten, globulären Protein. Die HCV-Polymerase besteht aus 591 Aminosäuren und ist somit um 100 Aminosäuren länger als die verwandte Poliovirus Polymerase. Die zusätzlichen Aminosäuren befinden sich am C-Terminus der Polymerase 68. Es wird angenommen, dass die HCV-Polymerase über einen C-terminalen Anker an das ER gekoppelt ist und dort Teil eines großen Replikationskomplexes ist 53,69. Anhand des in allen RNA- Polymerasen konservierten GDD-Motivs (Mg 2+ /Nukleotid-Bindungsmotiv) 70 konnte dem NS5B-Protein 1996 die Funktion einer viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (engl. RdRp) zugeordnet werden 51,58,69,71. Die rekombinante Expression und Aufreinigung des viralen Enzyms gestaltete sich als schwierig und gelang zunächst nur unter Verwendung eines auf Insektenzellen basierenden Expressionssystems 51,72,73. Nachdem klar wurde, dass die Löslichkeitsprobleme, die bei der Aufreinigung des Enzyms auftraten, auf einen C-terminalen, hydrophoben Membrananker zurückzuführen waren, konnte durch die Deletion der letzten 21 bis 55 C-terminalen Aminosäuren ein rekombinantes Protein in aktiver, löslicher Form unter Verwendung verschiedener Expressionssysteme erhalten werden 51,69,71, Einige der Präparationen waren dabei aus noch ungeklärten Gründen nur partiell aktiv 78. Im Folgenden soll noch näher auf die einzelnen Merkmale der HCV-Polymerase eingegangen werden. 6.1 Struktur der HCV-Polymerase Bisher konnten mehrere dreidimensionale Strukturen der NS5B-Polymerase mittels Röntgenstrukturanalyse gelöst werden 68, Fast alle Strukturen basieren auf der Sequenz des BK Klons (HC-BK, Genotyp 1b), während die Struktur von O Farrell et al. (2003) 82 auf den cdna-klon HC-J4 83 zurückgeht. Die Isolate HC-BK und HC-J4 unterscheiden sich auf Primärsequenzebene in 24 Aminosäuren. Das Enzym besitzt die für Polymerasen typische Form einer rechten Hand, die aus den sog. Finger-, Daumen- und Handflächen-Domänen gebildet wird (vgl. Abbildung I-6). Im Gegensatz zu anderen Polymerasen sind Finger- und Daumen-Domänen ausgedehnter, so dass hierdurch ein geschlosseneres aktives Zentrum (engl. fully encircled active site) vorliegt. Die einzige weitere bekannte Polymerase, die diese geschlossene Form des aktiven Zentrum aufweist, ist die Polymerase des Bateriophagen φ6 84. Die Finger-Domäne besteht aus zwei Subdomänen, den sog. α- und β-fingern. Es wird angenommen, dass die α-finger in die Diskriminierung von DNA-Substraten involviert sind 68. Dahingegen zeigen die β-finger eine ähnliche Struktur wie die entsprechende Domäne der

21 Einleitung 9 HIV Reversen Transkriptase 85. Diese strukturelle Ähnlichkeit der β-finger und des aktiven Zentrums deutet auf eine evolutionäre Verbindung zwischen diesen beiden viralen Enzymen hin 68,81. Die Daumen-Domäne weist an ihrer Rückseite zwei Helix-Motive auf, die an armadillo Repeats (arm) erinnern. Ein solches aus 42 Aminosäuren bestehendes arm -Motiv ist in nicht verwandten Proteinen für die Interaktion mit anderen Proteinen verantwortlich 86. Die Spezifität dieser Interaktion ist noch unbekannt. Auch bei der HCV-Polymerase könnte dieses arm -ähnliche Motiv für die Interaktion mit anderen viralen oder zellulären Proteinen verantwortlich sein 79. Zwei konservierte Sequenzen D-X 4 -D und GDD sind im Handflächen-Motiv aller RdRp s zu finden und für den Nukleotidtransfer erforderlich. Die katalytisch essentiellen Aspartate (D220, D318 und D319) weisen dieselbe geometrische Anordnung wie bei anderen Polymerasen auf 68. A B Abbildung I-6: Kristallstruktur der HCV-Polymerase (NS5B 21). Die Finger-, Handflächenund Daumen-Domänen sind in den Farben Blau, Magenta und Grün eingefärbt. Die in der Daumen- Domäne befindliche β-schleife ist dunkelgrün dargestellt. Der in das aktive Zentrum ragende N- Terminus ist in gelb und die beiden Mangan-Ionen in hellblau eingefärbt. A zeigt die Seitenansicht und B die Aufsicht des Enzyms (Quelle: O Farrell et al. (2003) 82 ). Die kürzlich veröffentlichte Struktur eines Komplexes aus HCV-Polymerase (NS5B 21) und einem kurzen RNA-Oligomer (ru 5 ) zeigt, dass zahlreiche Interaktionen zwischen der Nukleinsäure und Aminosäureresten der Finger-Domäne bestehen 82. Die RNA ist in einer

22 10 Einleitung Grube gebunden, die vom N-Terminus des Enzyms zum aktiven Zentrum verläuft und somit quasi die einzelsträngige RNA in das aktive Zentrum leitet. In Abwesenheit eines Nukleinsäuresubstrats ist diese Grube von Wassermolekülen ausgefüllt. Die Substratbindungstasche ist zu klein, um ein RNA-Primer/Template-Substrat zu binden. Dazu müsste eine geringfügige Bewegung der Daumen-Domäne erfolgen 79. Es wird vermutet, dass die Polymerase keine ausgeprägten Umstrukturierungen bei der Bindung eines RNA-Substrats durchläuft, wie dies zum Beispiel für die HIV-1 RT gezeigt werden konnte 81. Das Enzym scheint stattdessen in Abwesenheit der Substrate bereits in der für den sofortigen Einbau von Nukleotiden typischen geschlossenen Konformation vorzuliegen 79,81. Diese Vermutung wird durch den Vergleich der kürzlich veröffentlichten Strukturen des Apoenzyms und eines RNA/NS5B 21-Komplexes unterstützt 82. Hierbei konnte nahezu keine Veränderung der Cα- Atome im Bereich der Finger-Domäne beobachtet werden. Auch ein Vergleich mit dem ternären Komplex der HIV-1 RT deutet auf eine geschlossene Konformation in Abwesenheit der Substrate hin. Die offensichtliche Rigidität der Proteinstruktur wird vermutlich durch zwei Loops innerhalb der Finger-Domäne stabilisiert, die ausgedehnte hydrophobe und hydrophile Kontakte mit der angrenzenden Daumen-Domäne aufweisen. Das Nukleotid gelangt durch einen engen, positiv geladenen, trichterförmigen Kanal zum aktiven Zentrum der Polymerase. Während die Kristallstruktur von NS5B 21 des HC-J4 Klons nur eine einzige Nukleotidbindungstasche im aktiven Zentrum des Enzyms aufweist 82, konnte in der Struktur der HCV-Polymerasevariante NS5B 55 des HC-BK Klons interessanterweise eine zweite Nukleotidbindungstasche identifiziert werden 80. Diese ist etwa 30 Å vom aktiven Zentrum entfernt in der Nähe der Kontaktstelle zwischen Daumen- und Finger- Domäne lokalisiert und ist spezifisch für GTP. Die funktionelle Relevanz dieser zweiten Bindungstasche ist bisher rein spekulativ. Es wird angenommen, dass möglicherweise eine Verbindung zu der beobachteten Stimulation der de novo Synthese in Anwesenheit hoher GTP-Konzentrationen besteht. Die Bindung des GTP könnte durch allosterische Regulation zu einer Konformationsänderung führen, die entscheidend für die Initiation der de novo Synthese sein könnte. Allerdings konnte in der Kristallstruktur in Abwesenheit eines Template-Substrats kein Hinweis auf eine solche Bewegung gefunden werden. Eine weitere Funktion könnte im Zusammenhang mit einer möglichen Oligomerisierung stehen, die für eine effektive Initiation erforderlich ist. So wurde eine Dimerisierung postuliert, die Auswirkungen auf die Aktivität haben soll 87. Die Interaktionsfläche zwischen zwei NS5B- Molekülen liegt dabei im Bereich der zweiten Nukleotidbindungstasche, so dass ein gebundenes GTP stabilisierende Einflüsse besitzen könnte. Auch für die Poliovirus Polymerase wurde eine Oligomerisierung beobachtet, die ebenfalls wichtig für die Aktivität sein könnte

23 Einleitung 11 Der C-Terminus und die nur in der HCV-Polymerase vorkommende β-lasche befinden sich in der nukleotidgebundenen Form in der Nähe des aktiven Zentrums. Es wird angenommen, dass dieser Domäne eine regulative Funktion während der viralen Replikation zukommt 91. Das Fehlen eines Teils des C-Terminus, wie es in der Struktur des NS5B der Fall ist, führt im Vergleich zur NS5B 21 Struktur 82 zu einer Verschiebung des Rückgrads der β- Lasche. Durch eine Deletion der β-lasche um 8 Aminosäuren kann die HCV-Polymerase doppelsträngige RNA-Substrate binden und weist zudem eine höhere Aktivität auf 91. Daher wird vermutet, dass die β-lasche möglicherweise die Funktion übernimmt, das 3 Ende der RNA im aktiven Zentrum entsprechend zu positionieren. 6.2 Biochemische Charakterisierung der HCV-Polymerase Es existieren viele Veröffentlichungen, die sich mit einer biochemischen Charakterisierung der HCV-Polymerase beschäftigen. Dennoch besteht bisher nur ein sehr lückenhaftes und grobes Verständnis hinsichtlich der genauen Funktion dieser Polymerase. Die Sequenz der charakterisierten NS5B-Proteine leitet sich aus verschiedenen Subvarianten des HCV- Genotyps 1b ab, wodurch sich Unterschiede in den biochemischen Eigenschaften ergeben, die einen Vergleich der publizierten Ergebnisse erschweren. Des Weiteren wurden die Studien mit unverkürzten Proteinen oder mit C-terminal verkürzten Varianten (NS5B 21 oder NS5B 55) durchgeführt. Zudem stammen die Proteine aus verschiedenen Expressionssystemen (Bakterien, Insektenzellen) mit unterschiedlichen N- bzw. C-terminalen Modifikationen (Histidin- oder GST-Fusionstag). Die HCV-Polymerase zeigt in Abwesenheit anderer zellulärer und viraler Proteine eine Polymeraseaktivität und ist in der Lage, das gesamte HCV-Genom in vitro zu replizieren 45,51,69,71,75. Es scheint keine Templatespezifität vorzuliegen, und die Polymerase ist imstande, sowohl strukturierte als auch unstrukturierte RNA aus verschiedenen Quellen als Substrat zu nutzen 51,69,71,74,76, Eine C-terminale Verkürzung der Polymerase um 21 Aminosäuren zeigt in vitro keine signifikanten Auswirkungen auf die steady-state Polymeraseaktivität im Vergleich zur wt Polymerase 75. Außerdem konnte gezeigt werden, dass durch eine C- terminale Verkürzung um 55 Aminosäuren die Aktivität sogar erhöht wird. Des Weiteren schienen die C-terminalen 55 Aminosäuren nicht an der RNA-Bindung beteiligt zu sein 71. Eine N-terminale Verkürzung oder eine Modifikation am N-Terminus der HCV-Polymerase resultiert in einer starken Hemmung der Polymeraseaktivität. Werden z.b. die ersten 19 Aminosäuren deletiert, so kann nur noch eine Polymeraseaktivität von 1/200 im Vergleich zu der unveränderten Polymerase beobachtet werden 71.

24 12 Einleitung Biochemische Studien haben gezeigt, dass hohe Konzentrationen an GTP stimulierend auf die RNA-Synthese wirken 76,95. Auch bei der strukturverwandten φ6 Polymerase konnte diese Stimulation nachgewiesen werden Oligomerisierungsverhalten Die Ergebnisse von detaillierten Studien über das Oligomerisierungs- bzw. Dimerisierungsverhalten von Polymerasen deuten darauf hin, dass die Oligomerisierung bzw. Dimerisierung eine kritische Rolle hinsichtlich der enzymatischen Aktivität spielen kann 88-90,97,98. Es wird angenommen, dass auch bei der HCV-Polymerase eine Oligomerisierung erfolgt, die einen starken Einfluss auf die Polymeraseaktivität haben soll 87,99,100. Zwei Aminosäuren (E18 und H502) sind essentiell für die Dimerisierung zweier HCV-Polymerasen, sowie für die Polymeraseaktivität 87. Das Enzym liegt laut dieser Studie hauptsächlich als Monomer und Dimer und weniger in höher oligomerisierter Form vor. Die Ergebnisse einer anderen Studie besagen hingegen, dass das Enzym vorwiegend in der monomeren Form vorliegt und im Komplex mit einer hairpin-rna zur Ausbildung von Oligomeren neigt 101. Eine weitere Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von Wang et al. (2002) 99 mit der verkürzten HCV- Polymerasevariante NS5B 51 zeigte, dass eine starke intrinsische Oligomerisierung des Enzyms vorliegt. Durch Zugabe des Detergenz CHAPS konnte das Protein in die monomere Form überführt werden. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Oligomerisierung der Polymerase die RNA-Synthese sowohl bei der Initiation als auch bei der Elongation in kooperativer Weise beeinflusst RNA-Bindung Die HCV-Polymerase unterscheidet strikt zwischen einem RNA- und einem DNA-Template, sowie zwischen einem NTP und einem dntp 51,69,73. Bei der RNA-Bindung sind etwa 8 bis 10 Nukleotide in der RNA-Bindungsfurche der Polymerase eingebettet 102. Für eine stabile Bindung von RNA sind daher Templatelängen von mehr als 5 Nukleotiden erforderlich 92,103. Das Enzym (NS5B 21 aus Bakterien) ist vermutlich nicht in der Lage, beliebige RNA- Substrate zu binden. So konnte beobachtet werden, dass RNA mit ausgeprägter Sekundärstruktur nicht gebunden wird 104. Bisher wurden keine direkten Bindungsstudien von partiell doppelsträngigen RNA-p/t- Substraten veröffentlicht. Die Bindung solcher RNA-Substrate konnte nur indirekt über Nukleotideinbaustudien nachgewiesen werden 71,104,105. Im Widerspruch hierzu wurde in einigen Studien keine primerabhängige Synthese nachgewiesen, wodurch angenommen wurde, dass auch eine Bindung von RNA-p/t-Substraten durch die HCV-Polymerase auszuschließen sei 63,78,81,92. Von den Gruppen, die eine Diskriminierung doppelsträngiger

25 Einleitung 13 RNA-Substrate beobachtet haben, werden mehrere mögliche Ursachen diskutiert. Ein Grund könnte die im Vergleich zu anderen Polymerasen geschlossenere Struktur des aktiven Zentrums sein. Es wird jedoch vermutet, dass die Hauptursache bei der für die HCV- Polymerase einzigartigen β-schleife in der Daumen-Domäne zu suchen ist. Diese reicht in das aktive Zentrum und stellt somit ein sterisches Hindernis für ein doppelsträngiges Nukleinsäuresubstrat dar 81. Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstützt, dass die sehr ähnliche RNA-abhängige RNA-Polymerase des 3D Poliovirus diese β-schleife nicht aufweist und nachweislich dsrna bindet 106,107. Eine Deletionsmutante der HCV-Polymerase, die eine verkürzte β-schleife aufweist, war im Gegensatz zum wt Enzym in der Lage, ein p/t- Substrat für die primerabhängige Synthese zu nutzen 91. Auch in dieser Studie wurde davon ausgegangen, das die wt Polymerase ein p/t-substrat nicht binden kann. Um einen katalytisch kompetenten Komplex auszubilden, muss die zu bindende RNA im Bereich des 3 Endes einzelsträngig sein 92,102. Nach der Templatebindung können kurze RNA-Primer mit einer Länge von 1 bis 3 Nukleotiden an komplementäre Bereiche am 3 Ende des Templates binden. Molekulare-Modeling Studien mit einem Komplex aus HCV Pol/Template/Primer/Nukleotid ermöglichten Einblicke in die wahrscheinliche Funktion der β-schleife 81,92. Demnach ist die β-schleife dafür verantwortlich, das 3 Ende der viralen RNA so zu positionieren, dass eine effiziente Initiation der Polymerasereaktion erfolgen kann. Weiterhin wird vermutet, dass der flexible C-Terminus der Polymerase an der Regulation der Initiation beteiligt ist 91,104, Der Initiationsmechanismus Die HCV-Polymerase ist in der Lage, die RNA-Synthese über verschiedene Initiationsmechanismen durchzuführen. Hierzu gehören der sog. self-priming (copy-back) Mechanismus, die primerabhängige Synthese und die de novo Synthese, die nachfolgend näher erläutert werden. Noch herrscht Unklarheit darüber, welcher dieser drei Initiationsmechanismen in einer infizierten Zelle vorherrscht Self-priming Mechanismus Zunächst konnte gezeigt werden, dass die RNA-Synthese durch die HCV-Polymerase durch einen self-priming oder auch copy-back Mechanismus erfolgt 51,92,95. Bei dieser Art von RNA-Replikation erfolgt die Initiation durch das intramolekulare Rückfalten des 3 Endes der RNA. Dabei bildet die rückgefaltete RNA einen komplementären Bereich mit der nachfolgenden Sequenz aus, wodurch für die Polymerase ein Primer mit einem freien 3 -Hydroxylende für den weiteren Einbau von Nukleotiden entsteht. Dieser Mechanismus wurde jedoch als sehr unspezifisch eingestuft und daher als mögliche Replikationsstrategie des Virus in der Zelle abgelehnt 74.

26 14 Einleitung P/t-abhängige Synthese Anhand von Studien mit langen homopolymeren RNA-Template-Substraten mit kurzen homopolymeren Primern konnte festgestellt werden, dass die HCV-Polymerase (unverkürztes Protein aus Insektenzellen) zur p/t-abhängigen Synthese fähig ist 51,71. Zudem konnte durch Variation der Primerlänge gezeigt werden, dass die HCV-Polymerase (unverkürztes Protein) Primer mit einer Länge von 8 bis 10 Nukleotiden und um 30 Nukleotide bevorzugt 105. Die Autoren begründen diese Steigerung der Polymeraseaktivität mit einer optimalen Positionierung des 3 Endes des Primers im aktiven Zentrum der Polymerase. Ein 30 Nukleotide langer Primer wird benötigt, wenn zwei Polymerasen kooperativ an der RNA gebunden vorliegen. Dennoch gibt es auch mehrere Studien, bei denen eine primerabhängige Synthese mit Primerlängen über 3 Nukleotide nicht nachgewiesen werden konnte 81,92. Bei diesen Untersuchungen wurden im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Studien verkürzte Varianten der HCV-Polymerase eingesetzt (NS5B 21) De novo Synthese (primerunabhängige Synthese) Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass das wt Enzym und die um 21 Aminosäuren verkürzte Variante (NS5B 21) der HCV-Polymerase zur de novo Synthese (primerunabhängigen Synthese) fähig ist 74,95,102,103,109. Dabei handelt es sich um einen Mechanismus, der schon bei vielen (+)-Strang-RNA-Viren beobachtet werden konnte 110. Die de novo Initiation erfolgt bevorzugt durch den Einbau eines GTP gegenüber von einem Template Cytidin 95. Es konnte aber auch schon eine de novo Synthese der HCV-Polymerase mit einem ATP als Initiationsnukleotid beobachtet werden 95,103,109. RNA-Polymerasen zeigen in der Regel einen höheren K m -Wert für das Initiationsnukleotid als für dasselbe Nukleotid während des Elongationsprozesses 95,103,111,112. Studien mit verschiedenen Templates haben ergeben, dass nicht jedes Template für eine de novo Initiation geeignet ist und dass das RNA-Template bestimmte Voraussetzungen zu erfüllen hat. So ist z.b. die Sekundärstruktur der RNA entscheidend für eine Effizienz der de novo Synthese 74,102. Die de novo Synthese stellt einen attraktiven Mechanismus für die virale RNA-Replikation dar, da es hierbei zu keinem Verlust genetischer Informationen kommt und zudem keine zusätzlichen Proteine für die Initiation benötigt werden 72,80. Ausgehend von den röntgenkristallographischen Daten der Polymerase des doppelsträngigen Bateriophagen φ6 im Komplex mit Oligonukleotiden und NTPs wurde ein de novo Initiationsmechanismus postuliert 84. Aufgrund der hohen strukturellen Ähnlichkeit der Bateriophagen φ6 Polymerase zur HCV-Polymerase könnte dieser Mechanismus auch auf die HCV-Polymerase zutreffen.

27 Einleitung 15 B DNA-abhängige DNA-Polymerasen 1. Charakteristika und Klassifizierung DNA-abhängige DNA-Polymerasen katalysieren die chemische Reaktion der DNA-Synthese (vgl. Abbildung I-7). Abbildung I-7: Schematische Darstellung der Nukleinsäuresynthese. (Entnommen aus Genes VI, Oxford University Press (1998)). Bei dieser Reaktion erfolgt ein nukleophiler Angriff der 3 -Hydroxylgruppe des Primers an das α-phosphat des einzubauenden Nukleotids unter Bildung einer Phosphodiesterbindung. Dabei wird ein Pyrophosphatmolekül, bestehend aus der β- und γ-phosphatgruppe des Nukleotidtriphosphats, als Abgangsgruppe freigesetzt. In dieser Weise wächst die neusynthetisierte Nukleinsäurekette in 5 3 Richtung entsprechend komplementär zum Templatestrang. Die korrekte Positionierung des einzubauenden dntp erfolgt dabei unter Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zur komplementären Base im Templatestrang, dem sogenannten Watson-Crick Basenpaar. Die Polymerisationsreaktion beim Einbau eines Nukleotids erfolgt in mehreren Schritten. Um dem Falscheinbau eines Nukleotids entgegen zu wirken, kommt es dabei zu Konformationsänderungen, die zur Nukleotidselektion und der richtigen Positionierung des Substrats beitragen 113. Bei den verschiedenen Polymerasen sind diese Konformationsänderungen je nach Funktion der Polymerase mehr oder weniger stark

28 16 Einleitung ausgeprägt, so dass die Genauigkeit der DNA-Synthese zwischen 10-2 bis 10-5 Fehlern je einzubauender Base variieren kann. Die Fehlerrate der Polymerasen kann durch eine 3 5 Exonuklease Aktivität um den Faktor 100 reduziert werden. Diese sog. Korrekturlesefunktion der Polymerase (engl. proof-reading) ermöglicht es, falsch eingebaute Nukleotide am Primerende auszubauen, bevor diese weiter verlängert werden. Die Einteilung der DNA-Polymerasen aus verschiedenen Organismen wurde ursprünglich aufgrund von Sequenzhomologien zu den E. coli Polymerasen Pol I, II, und III und damit zu den entsprechenden Genen pola, polb und polc, in die Familien A, B und C vorgenommen 114,115. In den letzten Jahren wurden jedoch weitere Polymerasen identifiziert, die keine Homologien zu den E. coli Polymerasen aufwiesen. Dies führte zur Einordnung in drei weitere Polymerasefamilien: D, X, und Y. Obwohl große Unterschiede in Größe, spezieller Funktion und Ursprung der Polymerase bestehen, scheint der prinzipielle Ablauf der enzymkatalysierten Synthese für alle bisher bekannten DNA-Polymerasen universell zu sein. Zwei saure Aminosäurereste, bei denen es sich in der Regel um zwei Aspartate handelt, sind hochkonserviert und besitzen eine essentielle Funktion bei der Katalyse der Polymerasereaktion Die Carboxylatgruppen der Aminosäureseitenketten sind an der Koordination zweier divalenter Metallkationen beteiligt 119. Bei den Metallionen handelt es sich in der Regel um Magnesiumionen, die die Polymerasereaktion durch Koordination der beteiligten Gruppen energetisch erleichtern. Alle DNA-Polymerasen, deren drei-dimensionale Struktur aufgeklärt wurde, zeigen eine Proteinkonformation die an die Form einer leicht geschlossenen rechten Hand erinnert. Diese übergeordnete Struktur kann in bestimmte Domänen unterteilt werden die als Daumen, Finger und Handfläche bezeichnet werden 116, Jede dieser Subdomänen ist funktionell unterscheidbar. Die Handflächen-Domäne beherbergt z.b. die für die Katalyse essentiellen Carboxylatreste 125. Die Daumen- und die Finger-Subdomäne haben vorwiegend die Aufgabe, das Nukleinsäuresubstrat zu binden, bzw. sind an der dntp Selektion beteiligt. Das katalytische Zentrum der A, B und Y Polymerasefamilien scheint evolutionär gesehen ein konserviertes Strukturmotiv einer Proteinsuperfamilie darzustellen, da es auch in nahe verwandten Proteinen identifiziert werden konnte. Zu diesen verwandten Proteinen gehören die Reversen Transkriptasen, RNA-Replikasen, Terminale Transferasen und DNA-abhängige RNA-Polymerasen 119,123,126,127. Eine Ausnahme stellt die Polymerase β aus der Familie der X- DNA-Polymerasen dar. Abgesehen von den strukturellen Ähnlichkeiten besteht bei dieser Polymerase keine Homologie zu der zuvor beschriebenen Superfamilie 120,121,128. Die Handflächen-Subdomäne der DNA-Polymerasen der X Familie ist nicht homolog zu den Handflächen-Domänen anderer Polymerasefamilien 125. Aufgrund dieses Strukturunter-

29 Einleitung 17 schiedes werden diese Polymerasen im Gegensatz zu den klassischen Polymerasen als linkshändig bezeichnet Substratspezifität von DNA-Polymerasen Die intrinsische Fehlerrate von DNA-Polymerasen liegt üblicherweise in einem Bereich von 10-3 bis 10-5 für ein einzubauendes Nukleotid Die meisten eukaryontischen DNA- Polymerasen zeigen weitaus höhere Substratspezifitäten, während virale DNA-Polymerasen eher größere Fehlerraten bei der DNA-Replikation aufweisen. Erst kürzlich wurde eine neue Familie von DNA-Polymerasen entdeckt, deren Aufgabe eher die Reparatur defekter DNA als die Replikation umfasst. Diese sog. Y Familie der DNA-Polymerasen kann Fehlerraten von bis zu 1:22 je einzubauendes Nukleotid aufweisen 133. Obwohl das Wissen über DNA- Polymerasen in den letzten Jahren kontinuierlich gewachsen ist, konnten die mechanistischen Details für diese variierende Substratselektivität noch nicht vollständig geklärt werden Es ist allgemein anerkannt, dass die Watson-Crick Basenpaarung alleine nicht ausreicht, um die beobachtete Selektivität von sehr substratspezifischen DNA-Polymerasen zu erreichen. Es werden darüber hinaus einige andere Faktoren diskutiert, die an der Erkennung des korrekten Nukleotids beteiligt sein dürften 130, Dazu gehören unter anderem Basen-stapelung (engl. base stacking), Solvatation, Interaktionen mit der kleinen Furche der DNA, und sterische Hinderung in der Bindungstasche 140. Die größte Bedeutung für die Substratspezifität von DNA-Polymerasen wird jedoch dem bei Polymerasen häufig beobachteten Phänomens des sogenannten induced-fits beigemessen. Nach der Bindung des Nukleotids kommt es vor der eigentlichen chemischen Reaktion zu einer Konformationsänderung der Finger, die zu einer geschlosseneren Struktur des aktiven Zentrums führen. Der induced-fit verhilft der Polymerase somit zu einer höheren Selektivität bei der Wahl des richtigen Nukleotids und zudem zu einer korrekten geometrischen Orientierung des Substrats für die katalytische Reaktion. In diesem Zusammenhang wurde in den letzten Jahren das Konzept der active site tightness aufgestellt. Es beinhaltet die Hypothese, dass hochspezifische DNA-Polymerasen ihr Substrat sehr eng und rigide umschließen, während sehr unspezifische Polymerasen eine wesentlich höhere Flexibilität im aktiven Zentrum aufweisen und weniger Wechselwirkungen mit dem Substrat aufweisen. Es wird derzeit versucht, dieses Konzept über Studien mit modifizierten Nukleotiden auf seine Richtigkeit hin zu überprüfen.

30 18 Einleitung 2.1 Die HIV-1 Reverse Transkriptase Die HIV-1 RT ist essentiell für die Replikation des HI-Virus. Aufgrund dieser Tatsache wurde die Polymerase zu einem der bedeutendsten therapeutischen Angriffspunkte im Zuge der antiviralen Wirkstoffentwicklung. Sie weist sowohl eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, als auch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) sowie eine RNaseH- Aktivität auf. Bei der HIV-1 RT handelt es sich um ein heterodimeres Enzym, das aus zwei verwandten Untereinheiten besteht Die größere der beiden Untereinheiten wird aufgrund der molekularen Masse von 66 kda als p66 bezeichnet und beherbergt neben der Polymeraseaktivität auch die RNaseH-Domäne. Die kleinere 51 kda Untereinheit (p51) ist ein proteolytisches Spaltprodukt der p66 Untereinheit, der die RNaseH-Domäne fehlt Struktur der HIV-1 Reversen Transkriptase Abbildung I-8: Struktur des katalytischen Komplexes aus HIV-1 RT und DNA. Die p66 Untereinheit besteht aus Finger- (rot), Handflächen- (gelb) und Daumen-Domänen (orange), die das aktive Zentrum ausbilden, sowie der Verbindungs-Domäne (hellblau) und der RNaseH (dunkelblau). Die p51 Untereinheit ist in grau dargestellt. Das DNA p/t ist in grün dargestellt und das einzubauende Nukleotid in gold eingefärbt (Entnommen aus Huang et al. (1998) 85 ). Es existieren verschiedene Strukturen der HIV-1 RT, die durch Röntgenstrukturanalyse von Proteinkristallen erhalten wurden. Drei dieser Strukturen zeigen das Apoenzym ohne Substrate Weitere drei zeigen die HIV-1 RT im Komplex mit nicht nukleosidischen HIV-1 RT Inhibitoren 97, Vier Strukturen konnten im Komplex mit Nukleinsäure erhalten werden 85, In Abbildung I-8 ist die drei-dimensionale Struktur der HIV-1 RT im