Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 1/54. Schlussbericht

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1 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 1/54 Schlussbericht Zuwendungsempfänger: Ludwig-Maximilians Universität München, Institut für Med. Mikrobiologie, Infektionsund Seuchenmedizin der Tierärztlichen Fakultät, Dr. Georg Wolf, Veterinärstraße 13, D München Berichterstattung: Robert Fux, Ilona Moßbrugger, Georg Wolf Forschungsprojekt Nr.: 04HS040 Thema: Entwicklung und Prüfung einer Analytik zum Nachweis BVDV-infizierter Kälber mittels Ohrstanzproben, die im Rahmen der Tiermarkierung gewonnen werden. Laufzeit: Berichtszeitraum: gesamte Laufzeit Zusammenarbeit mit anderen Stellen: keine (Bezug von diagnostischen Reagenzien FLI - Riems Referenzlabor BVDV)

2 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 2/54 Inhalt 1 Ziele und Aufgabenstellung Planung und Ablauf Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde Material und Methoden Spender für Gewebe- und Blutproben BVDV-PI Tiere ohne nachweisbare BVDV-Antikörper Nicht BVDV-PI Rinder BVDV-PI Tiere mit nachweisbaren kolostralen BVDV-Antikörpern Herstellung von Proben mit definierter Belastung Lagerung von Proben bei unterschiedlichen Temperaturen Artifizielle Kontamination von Proben mit verschiedenen Bakterien Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Detergentien für Probenaufbereitungsverfahren ELISA-Kits für die BVDV-Antigen- und Antikörperdetektion Überprüfung der Kompatibilität der ausgewählten Detergentien mit verschiedenen ELISAs Solubilisierung der Antigene aus getrocknetem Ohrgewebe Optimierung der Detergentien für p80/ns3 ELISAs Material zur Überprüfung der Varianz der Antigenmengen in Ohrstanzen verschiedener Tiere Überprüfung des Antikörpereinflusses auf die Nachweisbarkeit der Analyten E rns und NS2/ Herstellung von BVDV-antikörperhaltigen Ohrstanzen zur Simulation der kolostralen Phase Probenwäsche zur Abtrennung von intrinsischen Antikörpern Real Time RT-Polymerase Chain Reaction (Real Time RT-PCR) Freisetzung der BVDV-RNA mit Hilfe von Proteinase K Mechanische Freisetzung der BVDV-RNA mit Hilfe eines Tissue Lysers (Fa. Qiagen) RNA Aufreinigung aus Probenlysaten Real Time RT-PCR (Protokoll Gaede LAV Stendal) Real Time RT-PCR (Protokoll Hoffmann/Beer; FLI) Proben für den Vergleich der beiden Real Time RT-PCRs Proben für die Messung des Einflusses von Molekularsieb-Rückständen auf die Nachweisbarkeit von RNA Poolung der Ohrgewebe-Lysate Ergebnisse Real time RT-PCR RNA-Isolierung aus Ohrstanzproben Einfluss unterschiedlicher Lagerungstemperaturen auf den RNA-Nachweis Einfluss bakterieller Probenkontaminationen auf den RNA-Nachweis BVDV-RNA Nachweis bei Kälbern in der kolostralen Phase Einfluss von Trockenmittel auf die RNA-Aufbereitung Untersuchung von Poolproben mittels RT-PCR Ergebnisse ELISA Solubilisierung der Antigene Störeinflüsse für die Antigendetektion Einfluss unterschiedlicher Lagerungstemperaturen auf den BVDV- Antigennachweis...35

3 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 3/ Einfluss bakterieller Probenkontaminationen auf den BVDV- Antigennachweis Einfluss BVDV-spezifischer Antikörper auf den BVDV-Antigennachweis39 4 Voraussichtlicher Nutzen und Verwertbarkeit der Ergebnisse Umsetzung der PCR-Ergebnisse Umsetzung der ELISA-Ergebnisse Zusammenfassung Gegenüberstellung ursprünglich geplanter und tatsächlich erreichter Ziele / weiterführende Fragestellungen Geplante und erreichte Ziele Weiterführende Fragestellungen BVDV-Stammvariabilitäten Effekte von Produkt-Chargen und Materialien Durchführung eines diagnostischen Verfahrens im Feld mit Prüfung der Erfolgskontrolle Nachweis der diagnostischen Sensitivität durch Überprüfung der Ergebnisse mittels Goldstandard Nachweis der Tauglichkeit des Verfahrens über serologische Stichprobenuntersuchungen Literaturverzeichnis...53

4 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 4/54 Tabellen BVDV-PI Tiere zur Probengewinnung (ohne kolostrale Antikörper)... 9 BVDV-PI Kälber in der kolostralen Phase Bakterienspezies für die Kontaminationsversuche Übersicht über die verwendeten Detergentien Verwendete BVDV-Antigen und Antikörper ELISAs Detergentien, die für NS2/3 ELISAs optimiert werden sollten, Konzentration und Zusätze Kits für die RNA Aufreinigung und verwendete Lysispuffer Vergleich zweier PCR-Protokolle (FLI und LAV) Effizienz der RNA-Freisetzung mittels Proteinase K-Verdau Vergleich von verschiedenen RNA-Aufreinigungskits RNA-Freisetzung mittels Tissue Lyser :Vergleich zweier PCR-Protokolle Einfluss verschiedener Lagerungstemperaturen auf die Menge an BVDV-spezifischer RNA, nachgewiesen mittels real time RT-PCR Einfluss von Arcanobacterium pyogenes und fäkaler Mischflora auf den BVDV-RNA Nachweis in Ohrstanzproben Effekt von Kotbeimengungen auf RNA-Extraktion und real time RT PCR-Effizienz Proben von vier PI-Tieren in der Diagnostischen Lücke, untersucht mittels real time RT-PCR Einfluss von Molekularsieb auf die messbare RNA-Menge Lagerbarkeit von Gewebehomogenisaten für wiederholte PCR Untersuchungen Einfluss einer Poolbildung auf PCR-Ergebnisse AG-Solubilisierung durch verschiedene Detergentien aus Ohrstanzproben Varianzen in NS2/3-ELISAs bei verschiedenen PI-Tieren und Detergentien (Titerangaben) Varianzen in Erns- und polyklonalen bzw. Mix -ELISAs bei verschiedenen PI-Tieren und Detergentien (Titerangaben) Einfluss von Lagerungstemperaturen auf die in ELISAs nachweisbare Antigenmenge (Titerangaben) Einfluss von Bakterien auf die Probenqualität, gemessen in Antigen ELISAs (Titerangaben) Einfluss von BVDV-Antikörpern auf die Antigendetektion im ELISA (Titerangaben) Einfluss von AK-haltigem Serum auf die Antigendetektion Proben von vier PI-Tieren in der Diagnostischen Lücke, untersucht mittels ELISA, Titerangaben Gegenüberstellung geplanter und erreichter Ziele Abbildungen BVDV-Eradikation mittels Erfassung des BVDV-Status bei neugeborenen Kälbern... 6 Flussdiagramm Planung und Ablauf des Projektes... 7 Verträglichkeit von Detergentien für BVDV-NS2/3 Antigennachweise Verträglichkeit von Detergentien für BVDV-Erns bzw. Mix Antigennachweise Temperatureinfluss auf BVDV-NS2/3; Messung mittels ELISA, Mittelwerte von je 8 Proben Temperatureinflüsse auf BVDV- Erns; gemessen mit Mix -ELISA, Mittelwerte von je 8 Proben Einfluss von Bakterien auf BVDV-Antigene im AG-Mix-ELISA. Darstellung der OD-Mittelwerte von je 6 Proben Abtrennung probenintrinsischer Antikörper ohne Detergens Abtrennung probenintrinsischer Antikörper mit Detergens BVDV-Erns Nachweis in Lysaten von Proben, die mit AK-haltigem Serum versetzt waren Antikörpernachweis in Lysaten von Proben, die mit AK-haltigem Serum versetzt waren Nachweis von NS2/3-Antikörpern in Probenlysaten von PI-Kälbern in der Diagnostischen Lücke... 45

5 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 5/54 1 Ziele und Aufgabenstellung Rinder mit einer persistenten Infektion (PI) verbreiten das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe/ Mucosal Disease (BVDV/MD) höchst wirkungsvoll. Für eine Tilgung der Infektion in einer Rinderpopulation ist deshalb das Verbringen von PI-Tieren außer zur Schlachtung oder unschädlichen Beseitigung zu unterbinden. Bei derzeit praktizierten Eradikationsprogrammen nach dem skandinavischen Modell (Bitsch & Ronsholt, 1995) werden in allen Rinderherden regelmäßige serologische Stichprobenuntersuchungen durchgeführt. Der Nachweis BVDVspezifischer Antikörper in der Stichprobe löst eine Einzeltieruntersuchung zur Findung und Abschaffung persistent infizierter Rinder aus. Zum Schutz vor Neueinschleppung sind Hygienemaßnahmen vorgegeben. Eine Schutzimpfung ist dabei nicht vorgesehen, da diese die Stichprobendiagnostik beeinträchtigen würde. Eine indirekte Bestimmung des Herdenstatus BVDV-frei oder BVDV-unverdächtig über serologische Untersuchungen von Stichproben ist für epidemiologische Untersuchungen gut geeignet (Houe, 1992). Auch nach der Eradikation ist eine Überwachung der Virusfreiheit in einer Region mittels regelmäßiger serologischer Untersuchungen gut denkbar. Als Grundlage für den Tierhandel während der Tilgungsphase sind die oben genannten Herdenstatus nicht geeignet. Sie beinhalten erhebliche Risiken beim Handel mit Kälbern, da gerade freie Herden bei einer neuen Durchseuchung PI- Kälber erwarten lassen. Diese werden aber nicht zeitgerecht durch die Stichprobenuntersuchungen wahrgenommen, da diese eine diagnostische Trägheit, die sich aus folgenden drei Zeiträumen zusammensetzt, beinhalten: Eine Serokonversion im infizierten Rind ist frühestens zwei bis drei Wochen nach der Infektion mittels ELISA nachweisbar. Die Zeit bis zum Ansprechen einer Stichprobe ist je nach Stichprobenverfahren (Antikörper der Tankmilch, Blutproben von Jungrindern, Milch erstlaktierender Rinder) und Aufstallungsart sehr variabel. Die singuläre Infektion eines einzelnen frühgraviden Rindes mit der Folge einer PI- Frucht wird möglicherweise erst einige Zeit nach der Geburt erkannt. Das Stichprobenintervall trägt ebenfalls zur diagnostischen Trägheit bei. Der Status nicht-bvdv-persistent infiziert (NPI) ist folglich für alle Rinder (einschließlich Feten bei Zukauf gravider Tiere) vor der Aufnahme in einen Betrieb, unabhängig vom serologisch bestimmten Status des Herkunftsbetriebes, zu bestimmen. Dies zeigen auch langjährige Erfahrungen bei der Anwendung des skandinavischen Modells (Bitsch, Hansen et al., 2000). Zur Definition eines NPI ist die Untersuchung von Blutproben nicht unproblematisch. Erstens ist die Probenentnahme, die in der Regel der Tierarzt leistet, teuer und mit aufwändiger Identitätssicherung verbunden. Zweitens ist die Diagnose von jungen BVDV PI-Tieren nach der Aufnahme kolostraler Antikörper nur noch eingeschränkt möglich, da BVDV-Antikörper lösliches Antigen im Serum binden und auch die Infektion von Blutleukozyten verhindern (Zimmer, van Maanen et al., 2004;Wolf, 2005). In den ersten Lebenswochen sind daher Antigen-Teste für Blutuntersuchungen sehr unzuverlässig. Den größten Anteil am Viehverkehr stellen aber junge Kälber, ab dem Alter von zwei bzw. sechs Wochen je nach Rasse, dar. Nach derzeitigem Stand der Technik müssten bei diesen Kälbern Blutproben einzeln mit teuren PCRs untersucht werden, um eine persistente Infektion hinreichend ausschließen zu können. Vermutlich ist unter anderem der Handel mit unerkannten jungen PI-Kälbern ursächlich für die unvorhergesehen lange Dauer der Eradikationsphase bei der Anwendung des skandinavischen Modells. Auch nach zehn Jahren verpflichtender, flächendeckender Eradikation ist beispielsweise Dänemark bisher nicht BVDV-frei (Uttenthal, Stadejek et al., 2005). Auch in Schweden sind bei fast flächendeckender Programmdurchführung seit zehn Jahren in den Jahren innerhalb von 18 Monaten 329 BVDV- infizierte Rinder in 112 Herden gefunden worden (Stahl, Kampa et al., 2005).

6 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 6/54 Ein zum skandinavischen Modell alternatives Konzept stellt die flächendeckende Bestimmung des individuellen BVDV- Status aller Rinder verbunden mit einem Verbringungsverbot (außer zur Schlachtung oder unschädlichen Beseitigung über kontrollierten Transport) von PI- Tieren dar. Dieses Konzept könnte mit Hilfe der sukzessiven BVDV- Diagnose aller neugeborenen Kälber verwirklicht werden, sofern geeignete Methoden zur Verfügung stehen. Bei diagnostisch definierten NPI- Kälbern ist indirekt auch die Mutter als NPI definierbar. Ein ideales Instrument für die Diagnose des neugeborenen Kalbes könnte die bei der pflichtgemäßen Tiermarkierung entnommene Gewebeprobe sein. Hierzu existieren bereits Probenentnahme- Ohrmarken, die für DNS-Analysen entwickelt wurden. Bei flächendeckender Anwendung könnte das in der Abbildung dargestellte Vorgehen zur Freiheit von BVDV-PI-Tieren in maximal 30 Monaten führen. Prinzipiell wären in der Tilgungsphase keine weiteren Untersuchungen erforderlich. Nach der Tilgungsphase wären serologische Stichprobenuntersuchungen zur Überwachung der BVDV-Freiheit (z.b. Tankmilchuntersuchung), analog zu anderen Infektionskrankheiten, denkbar. BVDV- Impfungen würden die Diagnostik während des Tilgungsverfahrens nicht stören. Abbildung 1.1: BVDV-Eradikation mittels Erfassung des BVDV-Status bei neugeborenen Kälbern RINDERHALTER HI-TIER Probensammelstellen (Milchwerke) AMTS- TIERARZT LKV BAY D E III l I I II III II LABOR negativer Antigen-ELISA- bzw. PCR-Befund: Kalb und Mutter sind lebenslang nicht persistent BVDV-infiziert. Handelszertifikat über HI- Tier positiver Antigen-ELISA- bzw. PCR-Befund: Das Kalb ist vorläufig als persistent infiziert (PI) zu betrachten. Verbringungsregelung; Euthanasie kranker Tiere PI-Bestätigung zu gegebener Zeit, Schlachtung als Mastkalb Untersuchung der Mutter Georg Wolf; Tierärztliche Fakultät der LMU München Aufgabenstellung und Ziel des Forschungsprojektes waren es, Methoden für möglichst zuverlässige Teste für die Untersuchung von Ohrgewebsproben zu etablieren und hinsichtlich analytischer Sensitivität und Störanfälligkeit zu überprüfen. Daraus sollten Empfehlungen für die Anwendung von Verfahren zur Prüfung im Feld abgeleitet werden, die dann die Prüfung der diagnostischen Sensitivität ermöglichen sollten.

7 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 7/ Planung und Ablauf Planung und Ablauf des Projekts sind in der Projektbeschreibung vom bei der Beantragung bereits dargelegt (siehe Anlage Auszug aus der Projektbeschreibung ). In Abbildung 1.2 wird die grundsätzliche Planung wiedergegeben. Abbildung 1.2: Flussdiagramm Planung und Ablauf des Projektes Erprobung und Optimierung der Gewebelyse für BVDV-Erns, NS2/3 und RNA; Erstellung von Standardprotokollen jeweils für PCR und Antigen Start gegebenenfalls Ausschluss ungeeigneter Analyten oder Testprodukte bei zu geringer Sensitivität Berichterstattung ca. 3 Monate Messung von Lagerungseinflüssen bei relevanten Temperaturen Vergl. Untersuchungen mit unterschiedlichen BVDV-Stämmen, nach Mögl. auch BVDV Typ II ca. 1 Monat Prüfung des Effektes probenintrinsischer Antikörper gegen BVDV-Erns und BVDV-NS2/3 Falls Antikörper kritisch: Testen von BVDV-Antikörpernachweisen als Qualitätskontrolle für das Probenmaterial ca. 1-2 Monate Untersuchung definierter Kontaminationen mit z.b. Enterobakterien, Pseudomonaden und Rinderkot. Untersuchung der Analyten nach unterschiedlichen Inkubations- bzw. Lagerbedingungen ca. 1-2 Monate Abschlussbericht an Auftraggeber; Informationsverteilung über AVID; Publikation positiv Projektende Start von Pilot-BVDV-Eradikationsprojekt(en) im Feld mit stringenter Erfolgskontrolle

8 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 8/ Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde Wir und auf unsere Initiative auch einige Firmen haben bereits mit Mikroohrgewebeproben RT-PCRs und verschiedene Antigennachweise durchgeführt und dabei zeigen können, dass BVDV-spezifische Reaktionen in der Mikroohrstanze nachweisbar sind. Beim Vergleich von Antigen-ELISA Resultaten von Blutproben und Ohrgeweben von 11 jungen PI-Kälbern in einer Studie in unserem Institut war die Ohrgewebediagnostik deutlich sensitiver. In der diagnostischen Lücke der Blutteste wurde bei jedem Kalb mittels Ohrgewebetest BVDV- Antigen detektiert (Kuhne, Schroeder et al., 2005). Die Menge an BVDV-Antigen in der Ohrstanze wird, im Gegensatz zum Blut, vermutlich nicht oder nur unerheblich durch die neutralisierende Aktivität kolostraler Antikörper beeinflusst, da es sich hier überwiegend um BVDV-Antigen in langlebigen Zellen handelt. Dies zeigen auch immunhistologische Untersuchungen von Hautgeweben (Thur, Zlinszky et al., 1996a; Thur, Hilbe et al., 1997). In verschiedenen Ländern wie USA, Schweiz und Spanien wird Hautgewebe bereits für die Diagnostik von BVDV genutzt. Allerdings werden hier häufig immunhistochemische Methoden angewandt, die labortechnisch sehr aufwendig und mit entsprechenden Kosten verbunden sind (Grooms & Keilen, 2002; Thur, Zlinszky et al., 1996b; Saliki & Dubovi, 2004; Brodersen, 2004; Ridpath, Hietala et al., 2002; Njaa, Clark et al., 2000). Der BVDV-Nachweis aus Hautmaterial wird in den USA von verschiedenen Labors mit Hilfe von ELISAs durchgeführt und als kostengünstige Methode empfohlen, wie aus Internetseiten hervorgeht (z.b. Auch sind BVDV-Isolierungen und BVDV-RT-PCRs aus Blutleukozyten vergleichend mit Antigenuntersuchungen in Makroohrstanzen von Kälbern (Feldproben) durchgeführt worden. Bei allen 59 BVDV-PI Kälbern im Alter von 1-5 Monaten war die Ohrgewebsuntersuchung positiv. Die persistierende Infektion wurde durch mehrere Folgeuntersuchungen über einen Zeitraum von drei Monaten bestätigt (Cornish, van Olphen et al., 2005). Die Antigenuntersuchung von Makroohrstanzen wurde vom Academy of Veterinary Consultants (AVC) ad hoc BVD committee in die empfohlene Diagnostikliste aufgenommen (Larson, Brodersen et al., 2005). Für die Verwendung getrockneter Mikroohrstanzen gibt es bisher keine ausreichenden Studien. Auch ist der Einfluss von kolostralen Antikörpern in den ersten Lebenswochen für Untersuchungen mit der Matrix Hautbiopsie bisher nicht ausreichend untersucht. Daher ist die Bestimmung der analytischen Sensitivität und der Störanfälligkeit im Umfang des vorliegenden Projektes notwendig, um die Voraussetzung für die Prüfung der Sensitivität und Spezifität eines Testverfahrens im Feld zu schaffen.

9 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 9/54 2 Material und Methoden 2.1 Spender für Gewebe- und Blutproben BVDV-PI Tiere ohne nachweisbare BVDV-Antikörper Als Spender für Blutproben und Gewebeproben wurden institutseigene persistent BVDVinfizierte Tiere eingesetzt (Tabelle 2.1). Diese stammten aus einem vorausgehenden Projekt (unterstützt von der Bayerischen Tierseuchenkasse) zur Untersuchung der diagnostischen Möglichkeiten in der kolostralen Phase (Wolf, 2005). Die BVDV-Infektion der Rinder erfolgte durch einen unbeabsichtigten Weidekontakt ihrer BVDV- naiven Mütter in der frühen Gravidität mit einem BVDV-PI-Rind (BVDV1-CR4043, München 2003). Die Haltung der Rinder erfolgte in den Stallungen des Institutes am Oberwiesenfeld. Zum Zeitpunkt der Probennahme waren keine kolostralen Antikörper mehr nachweisbar. Blutentnahmen erfolgten an der Jugularvene mittels 9 ml EDTA-Monovetten (Fa. Sarstedt). Nach der Tötung der Tiere wurden die Ohren und Hautstücke gewonnen. Mit dem Skalpell wurden ca. 2x2 mm (Gewicht ca. 16 mg Mittelwert, N=29) große Ohrgewebs- bzw. Hautstücke gewonnen und in TypiFix Probenbehältnissen (Fa. Agrobiogen) verschlossen. Ein Teil der Proben wurde analog zu den Stanzgefäßen mit 15 Molekularsiebkügelchen in 2 ml Polypropylen Gefäße mit abgedichtetem Schraubverschluss (Fa. Sarstedt) verbracht. Die fertigen Proben wurden bis zur Weiterbearbeitung bei 4 C gelagert. Tabelle 2.1: BVDV-PI Tiere zur Probengewinnung (ohne kolostrale Antikörper) Rind Benni Chrissi Dany Edi Ikarus Karl Erna fetales Alter bei PI- Kontakt (Tage) Alter bei der Tötung (Tage) aus PI-Rind 0 (Totgeb.) Nicht BVDV-PI Rinder Zur Untersuchung von Proben von nicht persistent BVDV-infizierten Rindern im Rahmen der Poolbildung wurden Materialien aus dem Münchner Schlachthof verwendet. Dabei wurde Schlachtblut zur Bestimmung des Infektionsstatus der Probanden aufgefangen und jeweils ein Ohr abgetrennt und einzeln in Plastikbeutel verpackt. Die Herstellung der Trockenproben erfolgte, wie oben beschrieben, aus frischem Gewebe.

10 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 10/ BVDV-PI Tiere mit nachweisbaren kolostralen BVDV- Antikörpern Im Versuchszeitraum standen keine neugeborenen BVDV-PI Kälber für eine Probengewinnung in der kolostralen Phase zur Verfügung. Hilfsweise wurden deshalb Proben aus gefriergelagerten Ohren von fünf PI Kälbern hergestellt. Diese Tiere stammen aus einem eigenem BVDV-Impfversuch im Jahr 2001 zur Bestimmung der fetalen Protektion. Als Infektionsstamm wurde am Tag 72 post inseminationem BVDV1-PT810 verwendet. Die PI-Tiere wurden nach präkolostraler Diagnostik im Alter von 1-2 Wochen euthanasiert. Die Ohren wurden abgetrennt, ca. einen Tag kühl gelagert und dann bei -80 C eingefroren. Nach dem Auftauen wurden Trockenproben wie oben beschrieben hergestellt. Zur Definition der kolostralen Phase sind die in Tabelle 2.2 angegebenen Daten verfügbar. Vier Kälber waren, gemäß der Ergebnisse der Antigen- und Antikörpernachweise, in der kolostralen Lücke. Ein Kalb (5) aus dieser Studie wies am Tag der Euthanasie einen Serumneutralisationstest-Titer < 1:10 auf und zeigte keine Reduktion der Zahl infizierter Leukozyten. Diese Befunde sprechen für keine oder eine nur sehr geringe Aufnahme kolostraler Antikörper. Tabelle 2.2: BVDV-PI Kälber in der kolostralen Phase Kalb Euthanasie Tag Blutprobe bei Euthanasie BVDV-NS2/3 positive SNT- Titer präkolostrale Blutprobe BVDV-NS2/3 positive SNT- Lymphozyten Granulo-/ Titer Monozyten Lymphozyten Granulo-/ Monozyten 1=K21 53% 47% 2 8 1,3% 1,5% >=2900 2=K18 50% 58% ,6% 0,1% >=2900 3=K8 56% 46% ,3% 0,4% >=2900 4=K19 42% 43% ,8% 8,3% >=2900 5=K9 49% 42% ,0% 66,5% <10

11 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 11/ Herstellung von Proben mit definierter Belastung Unter Feldbedingungen ist eine Belastung von Probenmaterialien durch unterschiedliche Temperaturen beim Transport und bei der Lagerung zu erwarten. Auch sind Verunreinigungen der Stanzbiopsien bei der Entnahme nicht auszuschließen. Deshalb wurden experimentell unterschiedliche Belastungsfaktoren, die in Extremfällen auftreten könnten, simuliert Lagerung von Proben bei unterschiedlichen Temperaturen Zum Nachweis von Temperatureinflüssen auf die Stabilität der Analyten wurden Grenzbedingungen gewählt, die in praxi nicht überschritten werden dürften. Hierfür wurden frische BVDV-PI-Ohrstanzen angefertigt und in TypiFix Probenbehältern (Fa. Agrobiogen) zunächst 16h bei Raumtemperatur gelagert. Folgende Belastungstemperaturen wurden angewandt: 50 C für 9 Stunden 37 C für 5 Tage Raumtemperatur 5 Tage und -20 C für 5 Tage Die Proben wurden nach der Temperaturbelastung bis zur ELISA-Durchführung für ca. 14 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Die Aufbereitung erfolgte in 600µl Triton X100 (1%ig) für 4h bei Raumtemperatur. Danach wurde eine log4 Verdünnung (unverdünnt - 1:64) für die verschiedenen ELISAs hergestellt. Für die Untersuchung des Einflusses der Lagerungstemperatur auf die Nachweisbarkeit der RNA wurden analog belastete Proben in einer zweiten Serie hergestellt und bis zur Gewebelyse und RNA-Freisetzung bei 4 C gelagert Artifizielle Kontamination von Proben mit verschiedenen Bakterien Die Auswahl der Bakterien für Kontaminationsversuche erfolgte nach einem Vorversuch, bei dem die Flora schnell wachsender Bakterien auf einer Ohrstanzprobe bestimmt wurde. Nach Einlegen einer frischen Ohrstanze in 1 ml NaCl Lösung und kurzem Schütteln wurden aus 100 µl der NaCl Lösung - α-hämolysierende Streptokokken - Staphylokokken - Mikrokokken und - aerobe Sporenbildner isoliert. Es wurden Bakterienspezies verwendet, die prinzipiell im Milieu Kuhstall vorkommen und Proteasen und RNasen produzieren können. Die Stämme wurden aus der Routinediagnostik des eigenen Instituts entnommen, die fäkale Mischflora wurde aus frischem Kot eines BVD- Virus freien Rindes gewonnen. Von jeder Spezies wurde eine Suspension hergestellt (McFarland 0,5). Für die Gebrauchsverdünnung wurde eine 1:10 und eine 1:1000 Verdünnung hergestellt. Jeweils 10 µl der beiden Verdünnungen wurden auf eine Stanze gegeben. Insgesamt wurden je Keim und Verdünnung 12 Stanzen hergestellt. Die Proben wurden nach Zugabe der Bakterienverdünnung für 4h bei 37 C inkubiert. Anschließend erfolgte die Verbringung der Stanzen in TypiFix Probenbehältnisse (Fa. Agrobiogen). Die kontaminierten Stanzen wurden bis zur Durchführung der ELISAs 35 Tage bei 21 C gelagert. Nicht kontaminierte Stanzen dienten in diesem Versuch zur Kontrolle (Lagerung bei 4 C). Nach Anfertigung der Stan-

12 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 12/54 zen erfolgte eine Keimzahlbestimmung mittels Oberflächenverfahren auf Blutagarplatten. Die Art und die Menge der zu den Stanzen gegebenen Kontaminanten sind in Tabelle 2.3 gelistet. Tabelle 2.3: Bakterienspezies für die Kontaminationsversuche Spezies Staphylococcus aureus Escherichia coli Arcanobacterium pyogenes Isolat 1 Arcanobacterium pyogenes Isolat 2* PCR 2,4*10 4 Arcanobacterium pyogenes Isolat 3* PCR 6,3*10 5 Pseudomonas aeruginosa CFU pro Stanze 5,9*10 5 / 5,9*10 3 3,1*10 5 / 3,1*10 3 6,8*10 5 / 6,8*10 3 3,9*10 5 / 3,9*10 3 fäkale Mischflora mit α-hämolysierenden und anhäm. Streptokokken, Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Bacillus 1,4*10 5 / 1,4*10 3 sp., E.coli fäkale Mischflora* PCR 3,75*10 2 * PCR : Proben wurden nur mittels PCR untersucht Zur Überprüfung des Einflusses von Kot auf die RNA Extraktion und auf die Effizienz der RT-PCR wurden auch Kontaminationen nach der Gewebelyse durchgeführt. Für diesen Versuch wurden 300 mg Kot eines erwachsenen BVDV-NPI- Rindes mit 15 Molekularsiebkügelchen getrocknet und dann in 300 µl RLT Puffer aufgenommen und homogenisiert. Vier Ohrstanzen des Tieres Erna, die 3 Monate lang bei 4 C gelagert waren, wurden in 600µl RLT-Puffer mit Hilfe des Tissue Lysers bearbeitet. Je 100µl Gewebelysat einer jeden Probe wurden mit 150µl, 75µl und 35 µl Kot-Homogenisat versetzt. Lysat ohne Kotzusatz diente als Kontrolle. Die RNA wurde mit dem RNeasy Fibrous Tissue Kit (Fa. Qiagen) aufgereinigt. Zur Bewertung der Inhibition beim RNA-Aufreinigungsschritt bzw. bei der anschließenden PCR wurden zwei RNA-Eluate (Ansätze mit 150 µl und 75 µl Kot-Homogenisat) vor Durchführung der real time RT-PCR (Protokoll FLI) zusätzlich 1:10 verdünnt.

13 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 13/ Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Detergentien für Probenaufbereitungsverfahren Für die Solubilisierung der BVDV-Antigene aus dem Ohrgewebe wurden verschiedene Detergentien anhand ihrer chemischen Struktur und der damit einhergehenden chemischen Eigenschaften ausgewählt. Tabelle 2.4: Übersicht über die verwendeten Detergentien Detergens hydrophile Gruppe* hydrophober Teil** SDS (sodium dodecyl sulfate, Laurylsulfat) Deoxycholat Empigen BB (n-dodecyl-n,n- Dimethylglycin) CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl) dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat) Triton X100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenyl-polyethylenglykol) Nonidet P-40 (Octylphenyl- Polyethylenglykol) Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan- Monolaurat) Tween 80 (Polyoxyethylen-Sorbitan- Monooleat) OGP (Octyl-ß-D-Glukopyranosid) Digitonin ionisch zwitterionisch nichtionisch (Polyethylenoxid) nichtionisch (Zucker) aliphatische Kette Steroidgerüst aliphatische Kette Steroidgerüst Phenylderivat aliphatische Kette aliphatische Kette Steroidgerüst * Aufgrund der hydrophilen Gruppe der Ampholyten wurden ionische, zwitterionische und nichtionische Seifen unterschieden. ** Beim hydrophoben Anteil wurden zwischen Phenylderivaten, aliphatischen Ketten und Steroidgerüsten differenziert.

14 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 14/ ELISA-Kits für die BVDV-Antigen- und Antikörperdetektion Die Durchführung der ELISAs erfolgte nach den Anleitungen der Hersteller. Verdünnngsreihen von Probenlysaten und Seren wurden mit PBS ohne Ca ++ /Mg ++ angefertigt. Grenzverdünnungen wurden jeweils für den Schnittpunkt der Titrationskurven mit dem cut off-wert errechnet. Bei schwachen Reaktionen mit Ergebnissen von unverdünnten Proben unterhalb des cut off-wertes wurde durch Extrapolation der Titer kleiner 1 errechnet, sofern eine relevante Testreaktion nach Höhe der OD und Kurvenverlauf zu ersehen war. Andernfalls wurde der Titer mit 0 angegeben. Neben, Maximum und arithmetischem Mittelwert x werden jeweils als Kennziffern der Streuung die Standardabweichung s und der Variationskoeffizient (relative Standardabweichung) (=s/x) angegeben. Tabelle 2.5. Verwendete BVDV-Antigen und Antikörper ELISAs ELISA (Batch) Analyt Probenmaterial Hersteller CHEKIT BVD- Glykoprotein Erns Blutserum, -plasma VIRUS-III (161- (=E0, =gp48) oder Vollblut 852) SERELISA BVD P80 AG MONO INDI- RECT (SBVD6 89 u. 90) CEDITEST BVDV-AG (05K020) CEDITEST BVDV- Antikörper (05K017) HERDCHEK BVDV AG / LEUKOZYTEN ( ; ) HERDCHEK BVDV AG / SERUM PLUS ( , , ) ELISA BVD/MD P80 ANTIGEN (337, 343, 553) ELISA BVD/MD ANTIGEN MIX (501) Nichtstrukturprotein 3 (NS3 und NS2/3 = p80/125) NS3 und NS2/3 Antikörper gegen NS3 und NS2/3 polyklonaler Antigentest Erns NS3 und NS2/3 NS3 und NS2/3; Erns Leukozyten, Gewebeextrakte und Ohrgewebeproben Leukozyten Blutserum oder Blutplasma Leukozytenfraktionen, Organe, Zellkulturen und Nasentupfer Serum, Plasma, Vollblut und Ohrgewebeproben Leukozyten Serum, Plasma, Vollblut, Leukozytenfraktionen und Blutgerinnsel Bommeli /IDEXX Laboratories, Ludwigsburg Synbiotics Corporation F-Lyon Cedi-Diagnostics B.V.; NL- Lelystad IDEXX Laboratories Ludwigsburg Institut Pourquier; F- Montpellier

15 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 15/ Überprüfung der Kompatibilität der ausgewählten Detergentien mit verschiedenen ELISAs Zunächst wurde untersucht, ob einzelne Detergentien die Antigendetektion der verfügbaren ELISAs stören bzw. negative Einflüsse auf die Antigene selbst haben. Im ersten Schritt wurden hierfür BVDV-antigenhaltige Blutleukozyten eines BVDV-PI Tieres verwendet. Im EDTA-Blut wurde erst die Leukozytenzahl (Cell DYN 3500 Analyse) bestimmt, anschließend wurde eine Ammoniumchloridlyse durchgeführt. Zu einem Teil Blut wurden drei Teile Lysispuffer (8,29 g/l NH 4 CL; 1,0 g/l KHCO 3 und 1 mm EDTA in A. demin) gegeben und für 10 min auf Eis inkubiert. Es erfolgten drei Waschschritte mit PBS ohne Ca ++ /Mg ++, anschließend wurden Leukozytenpellets mit je 2x10 7 Zellen durch Zentrifugation (1500 rpm, 10 min) hergestellt. Der Anteil BVDV-Antigen-haltiger Leukozyten wurde durch eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung (monoklonale Antikörper WB103/104) mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Die Standardpellets enthielten 25,6% Lymphozyten und 31,5% Granulozyten/Monozyten mit spezifischer IF für BVDV-NS2/3. Die Pellets wurden mit den verschiedenen Detergentien (500 μl) in Konzentrationen von 0,5% und 2% in PBS ohne Ca ++ /Mg ++ und mit den für jeden Test spezifischen Herstellerpuffern für 4 Stunden bei 21 C inkubiert. Mit dem Überstand wurden anschließend alle Antigen-ELISAs nach Herstellerangabe durchgeführt. Die Proben wurden unverdünnt und 1:2, 1:4 und 1:16 in PBS ohne Ca ++ /Mg ++ verdünnt auf die ELISA-Platten aufgetragen Solubilisierung der Antigene aus getrocknetem Ohrgewebe Die Solubilisierung der Antigene aus Ohrgewebsproben wurde für BVDV NS2/3 (p80) nicht mit allen Detergentien durchgeführt, da nach Durchführung der Kompatibilitätsprüfung mit Leukozytenpellets (Ergebnisse 3.2.1) gezeigt werden konnte, dass manche Detergentien stören (SDS, Empigen ). Die vom Hersteller mitgelieferten adäquaten Lysepuffer wurden ebenfalls getestet. Bearbeitet wurden Ohrgewebsproben eines BVDV-PI Tieres (C), die bereits 6-10 Monate bei 4 C in TypiFix Probenbehältern (Fa. Agrobiogen) gelagert waren. Zu den Ohrgewebeproben (2x2mm groß) wurden 500 µl des entsprechenden Detergens hinzugefügt. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 4h bei 21 C. Es wurde eine Verdünnung des Überstandes angefertigt (uv, 1:2, 1:4, 1:16). Alle ELISAs wurden nach Herstellerangaben durchgeführt. Ein Test (CHEKIT BVD-VIRUS-III; Fa. Bommeli/Idexx) wurde aufgrund geringer Sensitivität von der weiteren Untersuchung ausgeschlossen Optimierung der Detergentien für p80/ns3 ELISAs Da sich gezeigt hatte, dass die Auswahl der Detergentien für den Analyten E rns nur zweitrangig ist, wurde versucht, die Puffer für die p80/ns3- Tests zu optimieren. In Tabelle 2.6 sind die verschiedenen Detergentien, ihre Konzentration und die verschiedenen Zusätze aufgeführt.

16 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 16/54 Tabelle 2.6: Detergentien, die für NS2/3 ELISAs optimiert werden sollten, Konzentration und Zusätze Detergens Konzentrationen Puffer Deoxycholat 1%; 0,5% 0,25%; 0,125% Deoxycholat CHAPS 3%; 2%; 1%; CHAPS 0,5%; 0,25% Triton X100 2%; 1%; 0,5%; 0,25% Triton X100 PBS ohne Ca ++ /Mg ++ PBS ohne Ca ++ /Mg ++, ph 8 (mit Na- OH), Na + 0,5 M (mit NaCl) PBS ohne Ca ++ /Mg ++ PBS ohne Ca ++ /Mg ++ (ph 8; 0,5 M Na + ) PBS ohne Ca ++ /Mg ++ PBS ohne Ca ++ /Mg ++ und EDTA Mix* NP40 NP40 2%; 1%; 0,5%; 0,25% PBS ohne Ca ++ /Mg ++ PBS ohne Ca ++ /Mg ++ und EDTA Mix* OGP 2%, 1%, 0,5%; 0,25% PBS ohne Ca ++ /Mg ++ 2%; 1%; 0,5%; 0,25%; Digitonin PBS ohne Ca ++ /Mg ++ 0,125% * EDTA-Mix: 10 mm EDTA (Ethylendiamintetraacetat; Sigma; Lot: 107H093915); 1mM Dithiothreitol (Fluka; Lot: ); 1 mm PMSF (Phenylmethansulfonylfluoride; Fluka; Lot: ) Material zur Überprüfung der Varianz der Antigenmengen in Ohrstanzen verschiedener Tiere Für diesen Versuch wurden Ohrstanzen von drei BVDV- PI- Tieren verwendet. Die Stanzen sind vor Projektbeginn hergestellt und mehrere Monate bei 4 C gelagert worden. Bei Durchführung der ELISAs waren die Proben von Tier B zwölf, C zehn und K acht Monate alt. Die Solubilisierung wurde mit 600µl Triton X100 (1%ig) für 4 Stunden durchgeführt. Aus den Überständen wurde eine log4 Verdünnung (uv -1:64) hergestellt und diese im Test eingesetzt. Ein weiterer Versuch zur Überprüfung der Varianz wurde mit 5 bzw. 7 Tage alten Stanzen des Tieres I durchgeführt. Hierbei wurden die Detergentien CHAPS (1%) und Digitonin (1%) zusätzlich getestet. Mit 600µl/Stanze Triton X100 wurden insgesamt 8 Stanzen, mit CHAPS und Digitonin (600µl/Stanze) jeweils 7 Stanzen inkubiert. Aus den Überständen wurde eine log4 Verdünnung (s. oben) hergestellt.

17 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 17/ Überprüfung des Antikörpereinflusses auf die Nachweisbarkeit der Analyten E rns und NS2/ Herstellung von BVDV-antikörperhaltigen Ohrstanzen zur Simulation der kolostralen Phase Um den Antikörpereinfluss im Ohrgewebe auf die Nachweisbarkeit der Analyten zu überprüfen, wurde den Ohrstanzen BVDV-antikörperhaltiges Serum zugesetzt. Probenserie 1: 100 frische Ohrgewebsproben wurden in einem 15 ml Polypropylenröhrchen mit 4 ml antikörperhaltigem Serum (Tier E; Tag 3 und 4 nach der Geburt, 1:2 Mischung beider Seren, SNT-Titer: 1:32000 gegen homologes BVDV CR4043) versetzt und 2 h bei 25 C inkubiert. Die Gewebeproben wurden nach der Inkubation auf Zellstoff ausgelegt und anschließend in TypiFix Probenbehältnisse (Fa. Agrobiogen) verbracht. Probenserie 2: 50 Ohrstanzen (Gesamtgewicht: 1,792 g entspricht 35,8mg/Stanze) wurden für 2h im Serum inkubiert, danach auf Zellstoff ausgelegt und nochmals gewogen (Endgewicht: 1,973 g). Rechnerisch ergibt sich eine aufgenommene Serummenge von 181 mg. Pro Stanze wurden somit ca. 3,62 mg Serum aufgenommen, das entspricht 10% des Gewichts. Probenserie 3: Ohrgewebsproben des Tieres I (Stanzen 109 Tage im TypiFix -System bei 4 C gelagert) wurden mit EDTA-Blutplasma von Tier E (3. Lebenstag, SNT-Titer: 1:45255) in verschiedenen Mengen inkubiert. Hierzu wurde das Plasma in PBS ohne Ca ++ /Mg ++ verdünnt, so dass eine Zugabe von mindestens 4µl gewährleistet war. Die Inkubation erfolgte bei 4 C über Nacht. Folgende Plasmamengen pro Stanze wurden bei zwei unabhängigen Versuchen zugegeben: 8µl - 2µl 0,5µl 125nl Probe ohne Serumzugabe 2µl - 1µl 0,5µl 250nl - Probe ohne Serumzugabe Kontrollen ohne BVDV-spezifische Antikörper: Bei allen Probenserien wurden Parallelansätze mit dem Serum eines naiven Rindes hergestellt Probenwäsche zur Abtrennung von intrinsischen Antikörpern Versuch 1: Waschschritte mit PBS ohne Ca ++ /Mg ++ Um nicht gebundene Antikörper auszuwaschen wurden die Gewebeproben dreimal mit 1 ml PBS ohne Ca 2+ /Mg 2+ gewaschen (Inkubation 10 min auf einem Thermomixer). Anschließend erfolgte die Behandlung mit Detergens (600µl Triton X100; 4h). Zur Überprüfung der Wascheffizienz wurden der Überstand jedes Waschschrittes, das Serum (Tier E; Tag 3 und 4 nach der Geburt 1:2 gemischt), BVDV-Antikörper negatives Serum und der Überstand nach Inkubation mit Triton X100 mit Hilfe eines NS3 Antikörper-ELISAs untersucht. Die Überstände wurden nach Inkubation für 4 h mit 600 µl Triton X100 (1%ig) unverdünnt und in den Verdünnungen 1:4, 1:16 und 1:64 in den verschiedenen BVDV-Antigen ELISAs eingesetzt. Versuch 2: Waschschritte mit Triton X100 (1%ig) Die Stanzen wurden viermal mit 600µl Triton X100 (1%ig) behandelt (1h Inkubation bei 20 C auf Thermomixer). Die jeweiligen Überstände wurden in einem NS3 Antikörper-ELISA getestet. Der 4. Überstand wurde mittels Antigen-ELISAs getestet. Alternativ wurden Gewebestücke einmal für 30min bei 20 C mit Triton X100 (1%ig) gewaschen und anschließend für 3,5h mit Triton X100 (1%ig) zur Solubilisierung der Antigene inkubiert. Die Testdurchführung erfolgte wie beschrieben.

18 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 18/ Real Time RT-Polymerase Chain Reaction (Real Time RT-PCR) Als Analyt für die durchgeführte one step-bvdv-real time RT-PCR diente die Ribonukleinsäure aus dem Ohrgewebe von definiert persistent infizierten Rindern. Die nachgewiesene Sequenz liegt in einer genetisch stark konservierten Region des BVD-Virusgenoms (5 UTR). Zwei unterschiedliche Standardprotokolle wurden angewendet (Methodentransfer mit dem FLI und Veterinäruntersuchungsamt Stendal [Dr. Gaede]). Als Messgerät wurde ein TaqMan der Fa. Applied Biosystems (GeneAmp 5700 Sequence Detection System) verwendet. Die Ergebnisse der real time RT-PCR werden als treshold cycle (Ct-Werte) angegeben. Der Ct-Wert ist jener PCR-Zyklus, bei dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt. Messreihen werden jeweils durch arithmetische Mittel, Minima, Maxima, Spanne (=Max.- Min.) und Standardabweichungen charakterisiert Freisetzung der BVDV-RNA mit Hilfe von Proteinase K Zunächst wurde versucht die virale RNA mit Hilfe eines Proteinase K Verdaus aus dem Ohrgewebe freizusetzen. Hierfür wurde eine gebrauchsfertige Proteinase K Lösung hergestellt (9 ml 0,25 M EDTA [ph 7]; 1 ml 10 % SDS und 2 mg/10 ml Proteinase K). Die Ohgewebeproben wurden zusammen mit 400 µl Proteinase K Lösung für 1h bei 56 C inkubiert. Der Überstand wurde dann für die RNA Aufreinigung mit Hilfe eines RNA Isolierungs Kits der Fa. Roche (High Pure Viral RNA-Kit) verwendet Mechanische Freisetzung der BVDV-RNA mit Hilfe eines Tissue Lysers (Fa. Qiagen) Eine weitere Methode, die für die Freisetzung von RNA aus Ohrgewebe getestet wurde, war die mechanische Zerkleinerung des Gewebes mit Hilfe eines Tissue Lysers der Fa. Qiagen. Die getrockneten Ohrgewebsproben wurden zusammen mit einer Stahlkugel in 2 ml Polypropylengefäße überführt und dann mit Lysispuffer versetzt (Menge richtete sich nach der Angabe der Hersteller für den ersten Schritt der RNA-Isolierung). Zunächst wurde versucht die optimale Kombination zwischen Homogenisierungsschritt, Lysepuffer und RNA- Isolierungskit (Tabelle 2.7) zu finden. Der Homogenisierungsschritt wurde modifiziert, indem die Frequenz (Hz) und die Zeit verändert wurden. Da die Kombination von mechanischer Homogenisierung (300µl RLT-Puffer; 2,5min bei 25Hz) und dem RNeasy Fibrous Tissue Kit (Fa. Qiagen) die beste RNA Ausbeute erzielte, wurde sie in den weiteren Versuchen als Standard verwendet. Allerdings wurde der vom Hersteller vorgeschriebene Proteinase K-Schritt abhängig von der Probenmenge modifiziert. Bei Volumina unter 200μl wurden 300μl (295μl H 2 O + 5μl Proteinase K), sonst 600μl (590μl + 10μl) zugefügt.

19 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 19/ RNA Aufreinigung aus Probenlysaten Für die RNA-Aufreinigung wurden Testkits verschiedener Firmen ausgewählt und verglichen (Tabelle 2.7). Als Lysepuffer für die Homogenisierung wurde der jeweilige Herstellerpuffer verwendet. Tabelle 2.7 Kits für die RNA Aufreinigung und verwendete Lysispuffer RNA-Isolierungskit Hersteller Lysepuffer/ Menge High Pure RNA Isolation Kit Lysis/Binding Buffer; 400 µl Roche High Pure Viral RNA Kit Binding Buffer, 400 µl Pure RNA Tissue Kit Binding Buffer, 400 µl RNeasy Mini Kit RLT, 500 µl RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit RNeasy Lipid Tissue Kit Qiagen RLT, 300 µl QIAzol, 1 ml Real Time RT-PCR (Protokoll Gaede; LAV Stendal) Für diese PCR wurden die Primer Pesti3 und Pesti4 verwendet. Als TaqMan -Probe diente die TQ-Pesti-Sonde. Das Protokoll für die Durchführung wurde freundlicherweise vom Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt Stendal (LAV)(Gaede, 2005 und persönliche Mitteilung) zur Verfügung gestellt Real Time RT-PCR (Protokoll Hoffmann/Beer; FLI) Für diese PCR wurden vom Friedrich Löffler Institut/Riems (FLI) freundlicherweise Primer, Sonden und das Protokoll für die Durchführung zu Verfügung gestellt (Dr. Bernd Hoffmann/Prof. Martin Beer) Proben für den Vergleich der beiden Real Time RT-PCRs Um die beiden real time PCR Protokolle (FLI und LAV) vergleichen zu können, wurden jeweils vier Ohrstanzen der PI-Tiere B, C, D, E, I, K und vier Gewebeproben aus der Haut von Tier B mit 300μl RLT-Puffer versetzt und bei einer Tissue Lyser- Einstellung von 25 Hz für 2,5min zerkleinert. Die RNA wurde mit Hilfe des RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (Fa. Qiagen) aufgereinigt und 5 µl des Eluates als Template in der jeweiligen real time RT-PCR eingesetzt Proben für die Messung des Einflusses von Molekularsieb- Rückständen auf die Nachweisbarkeit von RNA Der Versuch wurde vorgenommen, um inhibierende Effekte des Molekularsiebes, das zur Trocknung der Ohrgewebe verwendet wird, auf die Sensitivität der PCR zu untersuchen.

20 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 20/54 Hierfür wurden Hautgewebestücken des PI-Rindes Erna in 2 ml Polypropylengefäßen (mit Stahlkugel und 300 µl RLT Puffer) 7 Molekularsieb- Kügelchen zugesetzt. Anschließend erfolgte die Homogenisierung mit Hilfe des Tissue Lysers für 2,5min bei 25Hz. Die RNA wurde mit dem RNeasy Fibrous Tissue Kit (Fa. Qiagen) aufgereinigt Poolung der Ohrgewebe-Lysate Zur Einsparung von Reagenzienkosten für die Routinediagnostik wurden Versuche zur Poolung der Proben vorgenommen. Als Ausgangsmaterialien für Pools wurden Tissue Lyser Homogenisate verwendet. Der Poolungsversuch wurde zunächst mit einem 100 µl Aliquot der Homogenisate der PI- Tiere B, C, D, E, I, K sowie der Kälber K18 und K19 in der kolostralen Phase durchgeführt. Für die Bildung eines 10-er Pools wurden 100 µl des jeweiligen Homogenisates mit je 900 µl eines Homogenisates aus BVDV-negativen Ohrstanzen gemischt und anschließend nach Standardprotokoll aufgereinigt und in der real time PCR eingesetzt. Zum Vergleich wurde jedes Homogenisat (100 µl Aliquot) ungepoolt mitgetestet. Die Stabilität der RNA bei Lagerung der Homogenisate bei 4 C für 24 h wurde überprüft.

21 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 21/54 3 Ergebnisse Unter 3.1 werden die relevanten PCR-Ergebnisse dargestellt, unter 3.2 die Ergebnisse der Antigennachweise mittels ELISA. 3.1 Real time RT-PCR Erstes Ziel war es, eine möglichst einfache und schonende Methodik für die Freisetzung der BVDV-RNA aus den Ohrstanzproben zu finden. Im zweiten Projektabschnitt sollten Einflüsse untersucht werden, die den Analyten schädigen oder dessen Detektion stören RNA-Isolierung aus Ohrstanzproben Zunächst war ein technisch einfacher Gewebeverdau mittels Proteinase K-Lösung (siehe 2.4.1) vorgesehen. Anschließend wurde die RNA mit dem High Pure Viral RNA Kit (Roche) aufgereinigt. Zwölf Stanzproben des PI-Tieres I wurden auf diese Weise verdaut und mit zwei verschiedenen real time RT-PCR-Systemen (siehe und 2.4.5) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.1 aufgeführt. Auffällig sind bei beiden PCR-Protokollen die relativ hohen mittleren Ct-Werte und die weite Spanne der Ergebnisse. Bei der weniger sensitiven LAV-PCR wurden zwei Proben als negativ bewertet. Tabelle 3.1: Vergleich zweier PCR-Protokolle (FLI und LAV) Paarweiser Vergleich anhand von 12 Ohrgewebsproben des PI-Tieres I, RNA-Freisetzung mittels Proteinase K-Verdau. PCR-Protokoll: FLI LAV Ct-Werte: > >42 Mittelwert (33.26) Standardabweichung () 4.11 (5.09) Maximum >42 Spanne (14.17)

22 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 22/54 Mit der sensitiveren FLI-PCR wurden jeweils acht Proben von fünf verschiedenen PI-Tieren getestet. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3.2 ersichtlich. Die mittleren Ct-Werte für die Tiere liegen zwischen 30,3 und 36,3. Auch hier wurde eine Probe eines Tieres als negativ eingestuft. Daraus lässt sich ableiten, dass der Proteinase K-Verdau in der gewählten Form kein geeignetes Mittel zur RNA-Freisetzung darstellt. Als Ursachen kommen ein unzureichender Gewebeaufschluss oder eine RNase-Aktivität während des Verdaus in Betracht. Tabelle 3.2: Effizienz der RNA-Freisetzung mittels Proteinase K-Verdau. Vergleich der Ergebnisse von jeweils acht Proben von fünf PI-Tieren mittels FLI-PCR PI-Tier B C D E K Ct-Werte > Mittelwert (36.31) (3.21) Maximum > Spanne (9.57) 3.86 Um eine stabilere RNA-Gewinnung zu ermöglichen wurde im nächsten Schritt eine mechanische Gewebebearbeitung vor der RNA-Isolierung durchgeführt. Diese erfolgte mit Hilfe des Tissue Lysers (TL) (QIAGEN) (siehe 2.4.2). Um die optimale Kombination von Puffer, RNA-Isolierungskit und Tissue Lyser-Einstellung zu finden, wurden mehrere Proben des PI-Tieres C unter der Verwendung verschiedener Aufreinigungskits getestet. Die verwendeten Kits mit den zugehörigen Puffern, die TL- Einstellung und die Ergebnisse sind in Tabelle 3.3 dargestellt. Puffer mit Detergentien scheinen für die TL-Bearbeitung ungünstig zu sein, da sie aufschäumen und die Zerkleinerung des Gewebes beeinträchtigen. Von den getesteten Kits wurden die besten Ergebnisse mit dem RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit und dem RNeasy Lipid Tissue Kit (beide QIAGEN) erzielt. Die mittleren Ct-Werte lagen bei 23,4 und 25,1 bei einer geringen Streuung. Das RNeasy Lipid Tissue Kit arbeitet mit phenol- und chloroformhaltigen Reagenzien und ist arbeitsaufwändiger als das RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit. Der Vorteil des RNeasy Lipid Tissue Kits liegt in der Möglichkeit einer Automatisierung der RNA-Aufreinigung, da hierfür bereits fertige Protokolle und Automaten verfügbar sind.

23 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 23/54 Tabelle 3.3: Vergleich von verschiedenen RNA-Aufreinigungskits RNA-Freisetzung mittels Tissue Lyser, alle Proben stammen von PI-Tier C Hersteller Roche Roche Roche Qiagen Qiagen Qiagen Testkit RNeasy High Pure High Pure Viral RNA Tis- Lipid Pure RNeasy RNeasy Fibrous RNA Mini Tissue Isolation RNA sue Tissue Mini lysis/binding binding binding RLT, RLT, QIAzol, Puffer buffer, buffer, buffer, 400μl 400μl 400μl 500μl 300μl 1,0ml TL- 5 min 5 min 2 min 5 min 5 min 2,5 min Einstellung 25Hz 25Hz 30Hz 25Hz 25Hz 25Hz Ct-Werte Mittelwert Spanne Für die weiteren Projektarbeiten wurde der RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit verwendet. Dessen RLT-Puffer enthält Guanidiniumthiocyanat, ein chaotropes Salz zur RNA- Stabilisierung. Die optimale Anwendung dieses Puffers mit dem TL bezüglich Zeit, Frequenz und Menge wurde in weiteren Versuchen ausgetestet (Daten nicht dargestellt). Bei einer Zugabe von 300μl RLT-Puffer zu den Proben und einer TL-Einstellung von 2,5min bei 25Hz wurden die besten Resultate erzielt. Diese Parameter wurden im Folgenden als Standardprotokoll verwendet. Mit diesem Protokoll zur RNA-Freisetzung wurden jeweils vier Proben verschiedener PI- Tiere bearbeitet und mit den zwei real time RT-PCR-Systemen (vgl. oben) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.4 gelistet. Die mittleren Ct-Werte liegen bei der FLI-PCR zwischen 22,3 und 27,8, bei der LAV-PCR zwischen 25,5 und 29,4. Die größte Spanne zwischen minimalem und maximalem Ct-Wert bei einem Tier (D) beträgt 4,9. Die mittlere Spanne aller Tiere beträgt 2,6. Die RNA-Freisetzung mittels TL in Kombination mit der RNA-Isolierung durch das RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit erzielte eine hohe Ausbeute an RNA bei geringer Varianz.

24 Projekt BVDV-Diagnostik LMU-München, Projektnummer BLE 04HS040 24/54 Tabelle 3.4: RNA-Freisetzung mittels Tissue Lyser :Vergleich zweier PCR- Protokolle PI-Tier B C D E I K PCR FLI Ct-Werte Mittelwert Maximum Spanne Ct-Werte PCR LAV * Mittelwert Maximum Spanne * atypischer Verlauf der Amplifikationskurve Der Vergleich der beiden PCR-Protokolle zeigt auch bei diesem Versuch deutlich, dass das FLI-Protokoll sensitiver ist als die PCR aus dem LAV (im Mittel um 2,02 höhere Ct-Werte). Deshalb wurde im weiteren die Kombination Tissue Lyser (2,5min bei 25Hz, 300μl RLT- Puffer), RNeasy Fibrous Tissue Kit und PCR nach FLI-Protokoll als Standardprozedur eingesetzt.