Flüssigkeitschromatographie

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1 Flüssigkeitschromatographie Flüssigkeitschromatographie Einteilung nach Druck: LC MPLC: HPLC: Liquid chromatography Flüssigkeitschromatographie Medium performance (pressure) LC Mittelleistungs (druck) -LC High performance (pressure) LC Hochleistungs (druck) -LC Einteilung nach Säulendimension und Flussrate Innendurchmesser Flussrate Präparativ > 25 mm >15 ml/min Semipräparativ mm 5-15 ml/min Analytisch 3-6 mm 1-2 ml/min Nanobore 2 mm 0,5 ml/min Microbore 1 mm 100 :L/min Kapillar-LC :m :L/min Nano-LC :m nl/min

2 Bauteile einer LC-Apparatur Vorratsgefäß für mobile Phase mit Ansaugfritte mobile Phase (Eluent, Laufmittel): organisches Lösungsmittel (LM), LM-Mischung, Wasser, Puffer K rein, staubfrei, entgast Hochdruckpumpe konstanter, pulsationsarmer Fluss der mobilen Phase Flussrate: 2 :l/min bis 20 ml/min Druck: bis 350 bar Probenaufgabe Dosierventil: Sixport-Ventil mit auswechselbarer Dosierschleife ( :l) oder integriert (200 nl-2 :l) Säule Edelstahl-, Kunststoff- oder Glaskörper (je nach Druck) Länge: 5 bis 25 cm, Innendurchmesser 1 bis 4 mm Abschluss mit Stahlfritten K glatte Oberfläche K geringe Totvolumina Thermostat stationäre Phase druckstabile, feinkörnige, poröse und unporöse Teilchen meist aus SiO 2 (modifiziert oder unmodifiziert) oder organischen Polymeren Partikeldurchmesser (analytisch): 1 bis 10 :m Detektor UV/VIS-Detektor mit fester oder variabler Wellenlänge Photodiodenarray Brechungsindexdetektor Floureszenzdetektor Elektrochemischer Detektor Kopplung mit Massenspektrometrie

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7 Kugelventil (Check-Valve)

8 HPLC-Pumpen Membrankolbenpumpe

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11 Probenaufgabe Ziel Aufgabe eines sehr kleinen Probevolumens (Lösung) auf den Säulenanfang, ohne Luft in das System zu bringen 6-Wegeventil mit Dosierungsschleife (Loop) Bauteile Rotor mit Bohrungen 6 Anschlüsse auswechselbare Schleife ( :l) Funktionsweise 1. Füllen der Dosierschleife: Drucklos mittels HPLC-Spritze a) vollständige Füllung (ca. 5faches Injektionsvolumen) b) teilweise Füllung (50-80% des Schleifenvolumens) 2. Dosierung Rasches Drehen des Ventilkörpers um 60/ Ventil mit internem Loop Injektionsvolumen von 0,5-5 :l für Mikrosäulen Automatische Dosiervorrichtungen Elektrisch oder pneumatisch betriebene Dosierventile

12 Probeninjektion

13 Probeninjektion

14 Analytische Trennsäule

15 Säulenfüllung gebrochene (links) und sphärische Teilchen (rechts)

16 HPLC-Detektoren UV-bzw. UV-VIS-Detektoren Absorption von UV- und sichtbarem Licht durch Probekomponenten (chromophore Gruppen) Brechungsindex-Detektor (Refraktometer, RI-Detektor) Universaldetektor für alle Substanzen, die anderen Brechungsindex als mob. Phase aufweisen Fluorimeter (Fluoreszenz-Detektor) Selektive (empfindliche) Detektion von (derivatisierten Verbindungen, die Fluoreszenz zeigen Variation der Wellenlänge von Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung Elektrochemischer (amperometrischer) Detektor Spezifischer Nachweis leicht oxidierbarer oder reduzierbarer Verbindungen (elektrochemische Reaktionen an Elektrodenoberflächen) Leitfähigkeitsdetektor (Konduktometer) Detektion geladener Spezies durch Messung der elektrischen Leitfähigkeit Massenspektrometer

17 UV-VIS-Detektoren Absorption durch chromophore Gruppen im Molekül Lambert-Beersches Gesetz log I0 = E = ε λ c d I E Extinktion, Molarer Extinktionskoeffizient c Molare Analytkonzentration d Optische Weglänge Durchflusszelle Detektorvarianten Festwellenlängen-Photometer Hg-Niederdruckdampflampe, 254 nm, sehr empfindlich Variable Wellenlänge Kontinuumsstrahler (Deuteriumlampe) Monochromator (auswechselbare Filter) Programmierbare Wellenlänge Deuteriumlampe, Gitter, Messung im jeweiligen Absorptionsmaximum des Analyten Diodenarraydetektor (DAD) Simultane Extinktionsmessung bei mehreren verschiedenen Wellenlängen durch Photodiodenzeile L Gesamtes Spektrum in Millisekunden K Identifizierung L Verhältnis von Extinktionen K Reinheit

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19 Diodenarraydetektor (DAD) Prinzip Kontinuierliche Messung der Absorption über großen Wellenlängenbereich (Aufnahme kompletter Spektren in Millisekunden) Lichtquelle polychromatisches Licht Spektrale Zerlegung (holographisches Gitter) Erfassung des gesamten Spektralbereichs durch Photodiodenzeile große Anzahl eng nebeneinander angeordneter Photodioden Schnelle Verarbeitung und Speicherung der Daten: Hoher Datenfluss jede Photodiode liefert 100 Datenpunkte/s Kontinuierliche Speicherung der Absorption und Wellenlänge in Abhängigkeit von der Retentionszeit Mikroprozessoren, Festplatten

20 Diodenarraydetektor (DAD) Präsentation 1. Konturbild (Konturkarte) enthält alle Informationen x-achse: Retentionszeit t y-achse: Wellenlänge 8 Intensität: Farbskala 2. Höhenliniendarstellung (3D-Abbildungen) enthält alle Informationen x-achse: Retentionszeit t y-achse: Wellenlänge 8 z-achse: Absorptionsintensität farbige Höhenlinien, Iso-Absorptionslinien anschauliche, perspektivische Darstellung der aufeinander folgenden Spektren 3. Simultane Darstellung des Chromatogramms bei zwei oder mehreren Wellenlängen 4. Darstellung kompletter UV-Spektren bei beliebigen Retentionszeiten

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25 Leistungsmerkmale von HPLC-Detektoren LC-Detektor Nachweisgrenze (kommerzielle Detektoren) Nachweisgrenze (Stand der Technik) Extinktion, A 100 pg 1 ng 1 pg Fluoreszenz 1 10 pg 10 fg Elektrochemisch 10 pg 1 ng 100 fg Brechungsindex 100 ng 1 g 10 ng Leitfähigkeit 500 pg 1 ng 500 pg Massenspektrometrie 100 pg 1 ng 1 pg FT-IR 1 g 100 ng Lichtstreuung 10 g 500 ng

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. Nur wenn ε m (λ 1 ) = ε m (λ 2 ), dann ist E = ε m c d.

. Nur wenn ε m (λ 1 ) = ε m (λ 2 ), dann ist E = ε m c d. Das Lambert-Beersche Gesetz gilt nur für monochromatisches Licht: Wird eine Substanz mit dem molaren Extinktionskoeffizienten ε m (λ) bei der Wellenlänge λ 1 mit der Intensität I 1 und bei der Wellenlänge

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