Rekombinante Antikorperfragmente fur die. Zoonosediagnostik

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1 Rekombinante Antikorperfragmente fur die Zoonosediagnostik Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Universitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) - genehmigte - Dissertation von Torsten Meyer aus Muhlacker

2 Inhaltsverzeichnis Abbildungsvcrzeichnis VII Tabellenverzeichnis IX Abkiirzungsverzeichnis XI 1 Einleitung Antikorper und rekombinante Antikorperfragmente 1.2 Phagen-Display M13-Bakteriophage Antikorpergenbibliotheken Phagen-Display-Technologie Affinitatsreifung rekombinanter Antikorperfragmente Isolierung von Salmonella- und Campylobacter-spezifischer Antikorper Salmonellen und Campylobacter als Ausloser von Zoonosen Salmonella enterica Subspezies enterica Serotyp Typhimurium Pathogenitat und Virulenz von Salmonellen Diagnostik von Salmonellen Direkter Nachweis Indirekter Nachweis Outer membrane protein D (OmpD) Campylobacter coliwux Campylobacter jejuni Pathogenitat und Virulenz von Campylobacter spec Diagnostik von Campylobacter spec Major outer membrane protein von C. coli und C. jejuni Zielsetzung der Arbeit 19 2 Material und Methoden Material Verbrauchsmaterialien Gerate Chemikalien Puffer und Losungen Nahrmedien und Supplemente Bakterienstamme und Bakteriophagen Plasmide Peptide Oligonukleotide Enzyme Antikorper Kit-Systeme Computerprogramme und Datenbanken Sonstiges 30 III

3 2.2 Molekularbiologische Methoden Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR PCR zur Amplifikation von DNA-Fragmenten fur Klonierungen Error-prone-PCR Kolonie-PCR Aufreinigung von DNA mit Kit-Systemen Aufreinigung von DNA mittels Ethanol-Fallung Isolierung von DNA mit alkalischer Lyse Agarosegelelektrophorese Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration Enzymatische Restriktion von DNA DNA-Dephosphorylierung Ligation von DNA-Fragmenten DNA-Sequenzierung Mikrobiologische Methoden Herstellung chemisch kompetenter E. co/*-zellen Transformation mittels Hitzeschock Transformation elektrokompetenter E. co/i-zellen Herstellung von Bakterienzelllysat Anlegen von Glycerinstocks Selektion von Antikorperphagenbibliotheken Panning aufganzenzellen Panning auf rekombinantem Protein Affinitatspanning nach affinity maturation Infektion von E. coli und Produktion von Antikorperphagen TiterbestimmungvonM13K07-Phagen Produktion von scfv-fragmenten in Mikrotiterplatten Produktion von scfv-fragmenten in Schuttelkolben Produktion von GST-OmpD mit Eis-tag in inclusion bodies Produktion von CaiMjoy/o^ocfer-spezifischen Antigenen Biochemische Methoden Isolation der Periplasmatischen Fraktion von E. coli Ammoniumsulfatfallung von Produktionsiiberstanden Aufreinigung von scfv-fragmenten mittels IMAC SDS-PAGE Coomassiefarbung von Proteingelen Bestimmung der Proteinkonzentration Western-Blot Immunfarbung Indirekter Antigen-ELISA ELISA mit Kompetition '.'.'.' Epitopbestimmung der isolierten scfv-fragmente Biophysikalische Methoden GroGenausschluBchromatographie Oberflachenplasmonresonanz (SPR) 47

4 3 Ergebnisse Subtraktives Panning auf Salmonella Typhimurium Isolation von spezifischen scfv-fragmenten gegen OmpD Panning auf rekombinantem GST-OmpD Analyse von monoklonal, loslichen scfv-fragmenten Sequenzierung der isolierten scfv-fragmente Klonierung und Produktion von GST-OmpD-His Kreuzreaktionsassays mit aufgereinigtem GST-OmpD-His Produktion der isolierten scfv-fragmente im 300 ml-maflstab Test der Spezifitat mit Immunfarbung Epitopkartierung Oberflachenplasmonresonanzmessung mit dem scfv-fragment TM44-C Grofienausschlusschromatographie Etablierung eines Kompetitions-ELISA fur die Diagnostik Test der Inkubationsreihenfolge im ELISA Test verschiedener scfv-fragmente im kompetitiven ELISA Verbesserung der scfv-fragmente mittels error-prone-pck Erzeugung der mutierten Subbibliotheken Selektion der Subbibliotheken auf OmpD Isolation von Campylobacter-spQzifischen scfv-fragmenten Expression von Campylobacter-Antigenen Panning auf rekombinantem MompC und MompJ Analyse von monoklonalen, loslichen scfv-fragmenten Sequenzierung der isolierten scfv-klone des 1. Pannings Panning auf rekombinantem MompC und MompJ Analyse von monoklonal, loslichen scfv-fragmenten aus dem 2. Panning Sequenzierung der isolierten scfv-klone des 2. Pannings ELISA zur Analyse von Kreuzreaktionen mit verschiedenen Antigenen Produktion der isolierten scfv-fragmente Test der Spezifitat mit Immunfarbung Epitopkartierung GroBenausschlusschromatographie 82 4 Diskussion Isolierung von Mempranprotein-spezifischen scfv-fragmenten Ausblick 96 5 Zusammenfassung 97 6 Summary 99 7 Literatur Anhang Verwendete Vektoren 8.2 Membranen fur die Epitopbestimmung Epitope der OmpD-spezifischen scfv-fragmente Epitope der MompC-und MompJ-spezifischen scfv-fragmente

5 8.3 Produktion der Antigene OmpD, MompC und MompJ Immunfarbung von GST-OmpD-His Immunfarbung von MompC und MompJ 118 Danksagung 119

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