Winterschool Obergurgl. Molekulare Typisierung CF-relevanter Erreger

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1 Winterschool Obergurgl Molekulare Typisierung CF-relevanter Erreger Barbara C. Kahl Institut für Medizinische Mikrobiologie Universitätsklinikum Münster

2 Warum Typisierung? Individueller Patient Persistierende Infektion Neuinfektion Epidemiologie Ausbruch verschiedene Klone - Ursprung Populationsstruktur Weltweite Vergleiche von Isolaten

3 Methoden Pulsfeldgel-Elektorphorese Dendrogram Indviduelle Klone Pat M Prävalenter Klon B M Kahl et al, J Clin Microbiol 2003

4 Die 6 weit verbreiteten S. aureus Klone Marker clone C clone G clone A clone D clone E clone B Marker B A E D G C Klon Patienten A 12 B 9 C 7 D 4 E 3 G 3 38

5 Sequenzbasierte Typisierungs-Methoden Vorteil Hohe Diskriminierung Sehr gute Reproduzierbarkeit Daten transportierbar, gute Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Laboratorien Epidemiologische und populationsbiologische Studien möglich High-through-put Analyse Nachteil Besonderes Equipment Pflege offener Datenbanken Kosten

6 Sequenzbasierte Typisierungsmethoden Single-locus sequencing Methoden spa-typisierung von S. aureus (VNTR) Multi-locus sequence typing (MLST) S. aureus, P. aeruginosa Whole-genome Sequencing P. aeruginosa

7 spa-typsierung: VNTR Region von Protein A von S. aureus Protein A Signal IgG binding VNTR LPXTG Region von Protein A mit einer unterschiedlichen Anzahl variabler tandem repeats (21 to 27 bp) variable number of tandem repeats Als Typisierungsmethode fürs. aureus Methode: Primer der flankierenden konservierten Region, um die repeat Region zu amplifizieren Amplicons werden sequenziert Software Programm zur Analyse (Ridom StaphType )

8 spa-repeats und -Typen spa Typen, abhängig von der Zusammensetzung und der Anzahl der repeats Repeat Code Sequence Repeat SpaType Repeat Succession r01 GAGGAAGACAACAACAAGCCTAGC t001 r26r30r17r34r17r20r17r12r17r16 r02 AAAGAAGACAACAAAAAACCTGGC t002 r26r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r03 GAGGAAGACAATAACAAACCTGGT t003 r26r17r20r17r12r17r17r16 r04 GAGGAAGACAATAACAAGCCTGGT t004 r09r02r16r13r13r17r34r16r34 r05 AAAGAAGACAACAAAAAGCCTGGC t005 r26r23r13r23r31r05r17r25r17r25r16r28 r06 AAAGAAGACGGCAAAAAACCTGGC t006 r26r23r13r23r31r05r17r17r25r16r28 r07 GAGGAAGACAACAACAAACCTGGT t007 r15r12r16r16r16r16r02r25r17 r08 GAGGAAGACAACAACAAGCCTGGT t008 r11r19r12r21r17r34r24r34r22r25

9 Sequenzierung von spa Typisierung von MRSA und MSSA Shopsin et al. JCM 1999, introduction of spa-typing Tang et al. JCM 2000, comparison of PFGE and spa-typing Oliveira et al. JCM 2001, comparison of PFGE, other molecular typing techniques and spa-typing Als Marker für Micro - und Macrovariation Koreen et al. JCM 2004 verglichen zur DNA Array Analyse

10 CF Isolate 155 konsekutive S. aureus Isolate von 10 Patienten Isogene Isolate eines jeden Patienten (6-25 Isolate) mediane S. aureus Persistenz: 56 Monate (Streuung 41 bis 75 Monate) PFGE Charakteristiken: -Isolate von 4 Patienten identisch -Isolate von 6 Patienten mit leichten Unterschieden im Bandenmuster Kahl B et al, J Clin Microbiol 2003

11 Identische PFGE Bandenmuster Patient 3 Spa types repeats 11/11/98 05/22/98 11/20/97 10/01/97 06/04/97 04/19/97 12/20/95 10/31/95 06/14/95 t072 r26r23r23r17r12r17r16. t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t072 r26r23r23r17r12r17r16 t072 r26r23r23r17r12r17r16 r34r17r20r17 an Pos 5 Del t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t002 r26r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r23 an Pos 3 Del t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 Die Isolate von 2 von 4 Patienten mit identischen PFGE Bandenmustern wiesen unterschiedliche spa Typen auf Kahl B et al, J Clin Microbiol 2003

12 Unterschiedliche PFGE Bandenmuster Date of isolation 01/15/99 01/15/99 01/15/99 01/15/99 08/05/98 07/28/98 08/21/97 02/27/97 06/19/96 01/18/95 Patient 9 Spa types repeats t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 r11r12r21r17r34r24r34r22r24r34r22r33r25 Die Isolate von 2 von 6 Patienten mit unterschiedlichen PFGE Bandenmustern hatten denselben spa Typen Kahl B et al, J Clin Microbiol 2003

13 Ergebnisse der spa Typisierung 142 Isolate von 10 Patienten: 16 unterschiedliche spa Typen Isolate von 5 Patienten identische spa Typen Isolate von 5 Patienten variierende spa Typen Deletionen (9 Isolate von 4 Patienten) Duplikationen (2 Isolate von 2 Patienten) Punktmutationen (4 Isolate von 2 Patienten) zum ersten Mal überzeugender Nachweis von Evolution der VNTR während Langzeitpersistenz wichtige Bedeutung für spa Typisierung

14 Multi-locus sequence typing (MLST) 7 Haushaltsgene Länge der Amplikons ca bp jedes neue Allel erhält eine neue Nummer die Kombination der verschiedenen Allele ergibt den Sequenztypen (ST) Jeder neue Sequenztyp erhält eine neue Nummer Curran et al J Clin Microbiol 2004

15 MLST Ergebnisse Pseudomonas aeruginosa 143 Isolate, klinische und Umwelt-Isolate 139 verschiedene Sequenztypen 10 Linien oder clonal complexes Identische STs, oder STs, die an einem (single-, SLV) oder zwei (double-locus variants, DLV) loci variierten Zu jedem CC gibt es ein founder Isolat (Ursprungs.) Umweltisolate nicht verwandt, ordnen sich zu den Gruppen der klinischen Isolate Curran et al J Clin Microbiol 2004

16 Clonal complexes - 61 Isolate ernster ambulant erworbener S. aureus Infektionen Isolate gesunder nasaler Träger - 94 Isolate nosokomialer Isolate - Oxford und Umgebung, Day et al, Science 2001

17 MLST Analyse eburst Algorythmus, der große MLST Datensets in nichtüberlappende oder verwandte STs und CC unterteilt Diversifizierung von Klonen Entstehung epidemischer Klone P. aeruginosa hat keine klonale epidemiologische Populationsstruktur Auswirkungen für die Auswahl der besten Typisierungsmethode Bedeutung für Vakzinierungsstrategien Populationsstruktur Streptococcus pneumoniae (1638 Isolate)

18 MLST Ergebnisse von P. aeruginosa Isolaten Curran et al J Clin Microbiol 2004

19 Whole genome sequencing

20 Whole genome sequencing von CF-Isolaten P. aeruginosa, frühes Isolat P. aeruginosa, isogenes Isolat 7,5 Jahre später shot gun sequencing, 97 % des Genoms sequenziert viele loss-of function Mutationen Smith EE et al., PNAS 2006

21 Mutationen im Spät-Isolat Funktionen Anzahl mutierter Gene Virulenzfaktoren, Virulenzregulatoren 13 Transporter, Resistenzfaktoren 12 Eisenaufnahme 5 DNA-Replikation, Zellteilung, Transkription Translation 5 Quorum sensing 3 Fettstoffwechsel 3 DNA-mismatch Reparatursysteme 1 Anaerober Metabolismus 1 Smith et al., PNAS 2006

22 Mutationen in weiteren CF-Isolaten 29 weitere Paare von CF-Patienten untersucht Mindestens 2 isogene Isolate Mindestens 5 Jahre Zeitunterschied 24 Gene, die im ersten Patienten mutiert waren, sequenziert Die meisten Gene sind nicht mutiert Jedoch finden sich einige der Mutationen bei vielen Spät- Isolaten

23 Häufige Mutationen Positive Selektion überwiegt: Nicht-synonyme Mutationen (n=103) überwiegen die synonymen Mutationen (n=5) Häufigste Mutationen betreffen multi-drug-efflux Pumpen Mutationen von Virulenzregulatoren, insbes. lasr Vfr, ein Regulator, der lasr reguliert exsa, TypIII-Sekretionssystem

24 Ergebnisse Konzept der Virulenz Virulenzgene für akute und chronische Infektion Invasive Faktoren und Faktoren, die für die Persistenz bedeutend sind immune evasion oder immune escape Virulenzgene der chronischen Infektion als zukünftige Targets der Behandlung chronischer Infektionen