Rekombinante Antikörper

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1 Frank Breitling und Stefan Dübel 2008 AGI-Information Management Consultants May be used for personal purporses only or by libraries associated to dandelon.com network. Rekombinante Antikörper Technische Universität Darmstadt FACHBEREICH 10 BIOLOGIE Bibliothek Schnittspahnstraße 10 D Darmstadt lnv,nr. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin

2 Inhalt 1. Grundlagen Wie unser Körper Antikörper herstellt Die Antikörpervielfalt entsteht durch die zufällige Kombination von Peptidbausteinen Die Spezifität der Antigenbindung wird von den hypervariablen Domänen bestimmt Die konstanten Regionen stabilisieren den Zusammenhalt der variablen Domänen Die konstanten Regionen vermitteln die Effektorfunktionen Antikörper binden im Lauf der Immunantwort immer besser B-Lymphozyten werden durch klonale Selektion ausgewählt Gedächtniszellen, die besser bindende Antikörper codieren, überleben Das Immunsystem der höheren Wirbeltiere macht seit Millionen von Jahren Antikörper-Engineering Die Herstellung von Antikörpern: altbewährte und neue Wege Die Nutzung von Antikörpern in Forschung und Diagnose Antiseren enthalten polyklonale Antikörper Unsterbliche B-Lymphozyten produzieren monoklonale Antikörper Rekombinante Antikörper" sind gentechnologisch hergestellte Antikörperfragmente Fv-Fragmente sind die kleinste antigenbindehde Einheit Warum rekombinante Antikörper? 27 Literatur 30

3 Rekombinante Antikörper 2. Gewinnung spezifischer rekombinanter Antikörperfragmente Einleitung Rekombinante Antikörperfragmente können aus Bakterien gewonnen werden Die Antikörperbildung des humoralen Immunsystems kann in Bakterien imitiert werden Wie kommt man an Antikörpergene? Die Erzeugung der Antikörpervielfalt in unserem Körper Warum Antikörper-Genbibliotheken unterschiedlicher Komplexität? Die Kontrolle der Komplexität von Antikörper- Genbibliotheken Klonierung der Antikörpergene aus Hybridom-Zellinien Genbibliotheken immunisierter Spender Universelle" Genbibliotheken nichtimmunisierter Spender Genomische Genbibliotheken Hybrid- und semisynthetische Genbibliotheken Vollständig synthetische Genbibliotheken mit Zufallssequenzen in den CDRs Überwindung der Engstelle Transformation: In v/vo-rekombinationssysteme ermöglichen Superlibraries" Von der Vielfalt zur Spezifität: Die Selektion der rekombinanten Antikörper aus Genbibliotheken Rekombinante Antikörper können mit klassischen Expressionssystemen aufgefunden werden Die Kopplung von Gen und Genprodukt ermöglicht eine Selektion in Lösung Peptide können auf der Oberfläche von Bakteriophagen exprimiert werden Auch rekombinante Antikörper können auf der Oberfläche von filamentösen Phagen verankert werden Mit Hilfe von Oberflächenexpressionsvektoren können Milliarden verschiedener Antikörperklone auf Bindung untersucht werden 64

4 Inhalt Oberflächenexpressionsvektoren ermöglichen die Herstellung humaner rekombinanter Antikörperfragmente Die Antigen-spezifische Infektion von Bakterien Andere prokaryontische Oberflächenexpressionsvektoren Antikörper können auch auf der Oberfläche von eukaryontischen Viren verankert werden Antikörper-Engineering Warum Antikörper-Engineering? Maus-Mensch-Chimären Die Gerüstregionen der variablen Domänen von Maus-Antikörpern können humanisiert werden Die dreidimensionale Struktur von Antikörpern kann am Computer modelliert werden Effiziente Suchsysteme helfen bei der Humanisierung von Antikörpern durch chain shuffling Die Affinität der rekombinanten Antikörper kann durch Wiederholung von Mutation und Selektion erhöht werden Antikörpergene können durch Gensynthese oder mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion mutiert werden Die sexuelle" PCR kombiniert mehrere Mutationen Fv-Fragmente werden durch eine Peptidverbindung zwischen den variablen Domänen stabilisiert Fv-Fragmente können durch interne Disulfidbrücken stabilisiert werden Kamelantikörper enthalten nur eine variable Domäne Antikörper können die Funktion von Enzymen übernehmen Zusammenfassung 105 Literatur 106

5 8 Rekombinante Antikörper 3. Antikörper mit erweiterten Funktionen Warum bispezifische und bifunktionelle Antikörper? Neue Funktionen durch homologe Fusionspartner: Bispezifische Antikörper Bispezifische Antikörper vereinigen die Bindungseigenschaften von zwei unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern in einem Molekül Bispezifische Antikörper können rekombinant hergestellt werden Verknüpfung zu bispezifischen Antikörpern mit Hilfe von heterologen Bindungsdomänen Universelle bispezifische Antikörper Rekombinante bispezifische Antikörper sind deutlich kleiner als ein IgG Neue Funktionen durch heterologe Fusionspartner: Bifunktionelle Antikörper Was sind bifunktionelle Antikörper? Bifunktionelle Antikörper können als Immuntoxine eingesetzt werden Antikörper können zu Radioimmuntoxinen umgebaut werden Intrazelluläre Antikörper Rekombinante Antikörper können an der Oberfläche von Zellen verankert werden Zusammenfassung 151 Literatur Produktion und Reinigung rekombinanter Antikörperfragmente Eigenschaften rekombinanter Antikörper und Auswahl des Expressionssystems Strukturelle Charakterisierung eines Antikörpers: Die Definition der hypervariablen Regionen (CDRs) Biochemische Charakterisierung eines Antikörpers: Spezifität und Affinität Verschiedene Anwendungen von Antikörpern erfordern unterschiedliche Expressionssysteme Prokaryontische Expressionssysteme Produktion in E. coli 174

6 Inhalt Produktion in Gram-positiven Bakterien Eukaryontische Expressionssysteme für rekombinante Antikörper Expression im Cytoplasma Die Zellen des Immunsystems sind die natürlichen Produktionsstätten von Antikörpern Produktion in anderen Säugerzellen Produktion rekombinanter Antikörperfragmente in Insektenzellen (Baculovirus-System) Produktion rekombinanter Antikörperfragmente in Pflanzen Produktion rekombinanter Antikörperfragmente in Pilzen Produktion in zellfreien Systemen Reinigung rekombinanter Antikörper und Antikörperfragmente Physikalische Trennmethoden stehen am Anfang jeder Antikörperreinigung Affinitätschromatographie: Der Schlüssel zur effizienten Reinigung rekombinanter Proteine Affinitätschromatographische Reinigung mit Hilfe der Bindungseigenschaften des Antikörperanteils Affinitätschromatographische Reinigung mit Hilfe eines heterologen Fusionsanteils Spezialfall Humantherapeutika: Entfernung von bakteriellem Endotoxin Aufbewahrung von gereinigten rekombinanten Antikörpern Literatur Anhang Index

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