WASSERHYGIENE PRAKTIKUMSSKRIPT Dresden, Studiengang Biologie Master / Diplom

Transkript

1 Institut für Mikrobiologie Lehrstuhl Lehrstuhl für Angewandte für Angewandte Mikrobiologie iologie Studiengang Biologie Master / Diplom WASSERHYGIENE PRAKTIKUMSSKRIPT Dresden, 2010 Bearbeiter: Dr. Sandro Wolf Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie sandro.wolf@tu-dresden.de

2 KURSPROGRAMM 1. WOCHE Institut für Mikrobiologie Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie Testbezeichnung Montag Dienstag Koloniezahl Gußplatte anlegen (TW) Plattenkontrolle, ggf. ablesen Mittwoch (13 Uhr Exkursion Kläranlage Kaditz) KBE bestimmen Donnerstag Himmelfahrt Freitag Referenz Kap. 3.1 Anlegen von Spatelplatten (Oberflächenwasser Plattenkontrolle, ggf. ablesen KBE bestimmen Coli/Coliforme Flüssiganreicherung MPN-Bestimmung Colilert Differenzierung MPN-Ansatz in MUG Laurylsulfat- Bouillon Ansetzen Colilert Quanti Tray Zwischenablesung ggf. Subkulturen anlegen Ablesen / MPN- Bestimmung Endablesung; ggf. Subkulturen anlegen Versuchsauswertung Reinkulturen differenzieren - Bunte Reihe ansetzen ggf. API20-E ansetzen Versuchsauswertung Differenzierung Reinkulturen ggf. API20-E auswerten Kap. 3.2 Fäkalstreptokokken Flüssigkeitsanreicherung MPN-Ansatz in Azid- Glucose-Bouillon Zwischenablesung, ggf. Subkulturen anlegen Endablesung, ggf. Subkulturen anlegen Auswertung Bestätigungstests; Titer-, MPN- Bestimmung Kap. 3.3 MPN-Bestimmung Enterolert Ansetzen Enterolert Quanti Tray Ablesen / MPN- Bestimmung Versuchsauswertung Aufkeimungspotential Versuch ansetzen 1. KbE-Ansatz 1. Zwischenablesung 1. KbE-Bestimmung 2. KbE-Ansatz 2. KbE-Bestimmung Kap Kap. 3.1 BSB- Ansatz Ansetzen Ablesen Ablesen Ablesen Kap. 3.9 Probe 15 min erhitzen Kap. 3.7 Clostridien (Filtration) (60 C), Verdünnungen herstellen, Filtration, Inkubation auf TSC Agar Untersuchung CARD-FISH Kap Sedimentproben (CARD- Hybridisierung FISH)

3 KURSPROGRAMM 2. WOCHE Testbezeichnung Clostridien Montag (ab 9 Uhr Exkursion Wasserwerk) Ablesen TSC-Platten; pos. Einzelkolonien in Schädler-Bouillon impfen Dienstag (13-14 Uhr Vortrag Dr. Lück) Kontrolle obligat aneroben Wachstums Mittwoch Donnerstag Reverse CAMP-Test für Titerbestimmung/MPN- Nachweis von Bestimmung Clostridium perfringens Freitag Referenz Phagen Ansetzen Untersuchung Sedimentproben (CARD- FISH) Pseudomonas Flüssiganreicherung Aeromonas Flüssiganreicherung PFU bestimmen; Versuchsauswertung Kap. 3.8 Mikroskopische Auswertung Kap Flüssiganreicherung in Malachitgrün-Pepton- Bouillon bei positiver Reaktion auf Cetrimid-Agar Bei positivem Befund Flüssiganreicherung in auf Ampicillin-Dextrin- Ampicillin-Dextrin-MediumAgar und ENDO-Agar überimpfen BSB-Ansatz Ablesen Ablesen Ablesen Aufkeimungspotential Membranfilterverfahren (Nährkartonscheiben - NKS) Oxidase-Test und Gram- Verhalten Chloroformausschüttung ggf. weitere Titer- und MPN Bestimmung Differenzierung Cytochromoxidase-Test (api 20-NE-Streifen) Auswertung api 20-NE Bestätigungsreaktionen (OF, VP-Methylrot u.a.) ansetzen api-20-ne 3. KbE-Ansatz 3. Zwischenablesung 3. KbE-Bestimmung Verschiedene NKS animpfen Auswertung ENDO-NKS, Tergitol-TTC-NKS api-20-ne Bestätigungsreaktionen auswerten; Titer- u. MPN-Bestimmung Ablesen; Versuchsauswertung Versuchsauswertung Auswertung restliche NKS; Versuchsauswertung Vormittags selbstständige Versuchsauswertung; Vorbereitung der Präsentation Ab 13:00Uhr Gemeinsame Auswertung und Testat Im Seminarraum E 33 Kap.: 3.4 Kap.:3.6 Kap.: 3.9 Kap Kap.: 3.1 Kap.:

4 Inhaltsverzeichnis Institut für Mikrobiologie Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie KURSPROGRAMM 1. WOCHE KURSPROGRAMM 2. WOCHE METHODISCHE GRUNDLAGEN PROBENAHME UND PROBENTRANSPORT T ÜBERSICHT ÜBER PRINZIPIELLE VERFAHREN AUSWAHL DER METHODE IN ABHÄNGIGKEIT WASSERART ABLAUFPLAN DES PRAKTIKUMS ÜBERSICHT DER ZU UNTERSUCHENDEN WASSERPROBEN ABLAUFSCHEMA DURCHFÜHRUNG DER BAKTERIOLOGISCHEN WASSERUNTERSUCHUNGEN BESTIMMUNG DER GESAMTKEIMZAHL/KOLONIEZAHL NACHWEIS VON COLI/COLIFORMEN QUANTIFIZIERUNG VON E. COLI NACH DEM MPN-VERFAHREN BESTIMMUNG DES COLI-TITERS DURCH FLÜSSIGANREICHERUNG ANLEGEN VON SUBKULTUREN BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG BUNTE REIHE NACHWEIS VON FÄKALSTREPTOKOKKEN QUANTIFIZIERUNG VON FÄKALSTREPTOKOKKEN NACH DEM MPN-VERFAHREN NACHWEIS DER FÄKALSTREPTOKOKKEN MITTELS FLÜSSIGKEITSANREICHERUNGSVERFAHREN UND BESTÄTIGUNGSREAKTIONEN NACHWEIS VON PSEUDOMONAS AERUGINOSA NACHWEIS UND DIFFERENZIERUNGSGANG MITTELS MEMBRANFILTERVERFAHREN (EINSATZ VON NÄHRKARTONSCHEIBEN) NACHWEIS VON AEROMONADEN NACHWEIS VON CLOSTRIDIEN NACHWEIS VON BAKTERIOPHAGEN AM BEISPIEL SOMATISCHER COLIPHAGEN DIE BESTIMMUNG DES BIOLOGISCHEN SAUERSTOFFBEDARFES (BSB) DAS AUFKEIMUNGSVERHALTEN (KOLONIEZAHLENTWICKLUNG) VON WÄSSERN IN ABHÄNGIGKEIT VON DER STANDZEIT UND WIRKUNG VON DESINFEKTIONSMITTELN IDENTIFIZIERUNG VON BAKTERIEN MITTELS CARD-FISH (CATALYZED REPORTER DEPOSITION - FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION)... 31

5 1 METHODISCHE GRUNDLAGEN Institut für Mikrobiologie Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie 1.1 PROBENAHME UND PROBENTRANSPORT Grundvoraussetzung jeder Wasserentnahme ist, dass eine sekundäre Verunreinigung der Probe verhindert wird. Neben der Verwendung eines sterilen Probengefäßes ist daher auf die Einhaltung von Probenahmebedingungen zu achten, die eine sekundäre Kontamination der Wasserprobe ausschließen. Falls vorhanden, ist eine sterilisierte Entnahmestelle zu nutzen. Entnahme von Trinkwasser Zur Entnahme von Trinkwasser sind Zapfhähne aus Metall (ohne Schläuche) geeignet, die sterilisierbar sind. Mehrmaliges Öffnen und Schließen des Zapfhahnes bewirkt das Herausspülen von Ablagerungen. Zur Sterilisation des Zapfhahnes wird dieser ca. 2-3 min gründlich abgeflammt, insbesondere die Mündung, aber auch die Strecke bis zum Öffnungsventil. Wasser bis zur Temperaturkonstanz ca. 5 min ablaufen lassen. Sterile Flaschen zu etwa 5/6 füllen und kennzeichnen. Entnahme von Oberflächenwasser Die Probe soll repräsentativ für das Gewässer sein. Schöpfprobe aus etwa 30 cm Tiefe bei einer Gesamttiefe von 75 bis 100 cm entnehmen. Bei Fließgewässer ist gegen die Strömung zu schöpfen. Entnahme von Abwasserproben Abwasserproben oder sonstige stark kontaminierte oder viele Schwebstoffe enthaltende Proben werden mit einem abflammbaren Metallschöpfer entnommen und in sterile Flasche gefüllt. Probentransport Alle Wasserproben müssen gekennzeichnet, lichtgeschützt und gekühlt transportiert werden. Die Aufbewahrung erfolgt im Kühlschrank. Spätestens 24 Stunden nach der Probenahme müssen die Proben bearbeitet werden. 1.2 ÜBERSICHT ÜBER PRINZIPIELLE VERFAHREN Flüssigkeitsanreicherung Diese Methode kann sowohl bei leicht als auch bei stark verschmutztem Wasser verwendet werden. Ein definiertes Volumen einer Probe (z.b. 100 ml) wird einem flüssigen (oder halbfesten) Nährmedium zugesetzt. Das Substrat wird vermischt und bebrütet. Das Wachstum der gesuchten Mikroorganismen wird durch eine Trübung der Nährlösung, einen Farbumschlag oder Gasbildung angezeigt. Die Bewertung ist qualitativ möglich, z.b. in 100 ml wurde die gesuchte Bakterienart nachgewiesen/nicht nachgewiesen; eine Abschätzung der Keimzahl mittels MPN- Verfahren ist ebenfalls möglich.

6 Isolierung auf festen Nährmedien (Subkulturen) Nach der Anreicherung müssen positiv beurteilte Kulturen bestätigt werden. Es werden von den positiven Proben Sub- bzw. Reinkulturen auf festen Nährmedien angelegt und bebrütet. Für eine weitere Differenzierung müssen gegebenenfalls weitere biochemische Merkmale der Isolate geprüft werden. Spatelplattenmethode Dies ist eine Methode zur quantitativen Erfassung von Bakterien über die Koloniezahl (im Allgemeinen mit 2 oder mehr Parallelansätzen). Vom Wasser oder dessen Verdünnungsstufen werden 0,1 ml auf die Oberfläche fester Nährböden ausgespatelt und bebrütet. Ausgewertet werden nur Platten mit ca. 20 bis 200 Kolonien, da jenseits dieser Grenzen der statistische bzw. der methodische Fehler zu groß wird. Gussplattenmethode Adäquat zur Spatelplattenmethode wird eine Quantifizierung des Bakteriengehalts einer Wasserprobe als Koloniezahl möglich. 1 ml des zu untersuchenden Wassers bzw. der erforderlichen Verdünnungsstufen wird mit dem handwarmen, verflüssigten Nährboden in einer Petrischale vermischt und nach Erstarren bebrütet. Auswertung: siehe Spatelplattenverfahren. Membranfilterverfahren Sie ist zur quantitativen Erfassung von Mikroorganismen im Wasser geeignet, wenn die Keimzahl im zu untersuchenden Wasserkörper sehr niedrig ist (Trinkwasser, Brunnen-, Quell- oder Oberflächenwasser). Durch die Filtration werden die Keime aus einem großen Wasservolumen auf eine kleine Fläche des Membranfilters (Durchmesser 47 oder 35 mm) konzentriert. Der Filter wird auf ein festes Nährmedium aufgelegt, bebrütet und die gewachsenen Kolonien ausgezählt. Die filtrierte Wassermenge ist dabei so zu wählen, dass die Koloniezahl für einen Filterdurchmesser von 47 mm zwischen 20 und 150 liegt. Titermethode Sie gilt als Spezialfall des Verdünnungsverfahrens. Es wird mit mehreren Wasservolumina in Stufen fallender 10er Potenzen (100 ml, 10 ml, 1 ml, 0,1 ml), jedoch ohne Parallelansatz gearbeitet. Es ist eine semiquantitative Auswertung der Probe möglich. Als Titer ist die kleinste Wassermenge in ml definiert, in der noch die Bakterien kulturell nachgewiesen werden können. Die so ermittelten Werte können aufgrund der großen Fehlerbreite bei Verwendung eines Ansatzes je Verdünnungsstufe nur als grobe Näherungswerte betrachtet werden MPN - Methode Das MPN-Verfahren (most probable number) stellt eine Erweiterung des Titer-Verfahrens dar und erlaubt eine Schätzung der Keimzahl. In Parallelansätzen zu je 3 oder 5 Parallelen werden unterschiedliche Wasservolumina (unterschiedliche Verdünnungsstufen) in flüssigen Nährmedien auf Keime untersucht

7 Aus der Anzahl der nach Bebrütung bewachsenen Ansätze je Verdünnungsstufe kann anhand von Auswertetabellen bzw. Berechnungsprogrammen die MPN, also die höchstwahrscheinliche Keimzahl, je 1 ml Probe ermittelt werden. 1.3 AUSWAHL DER METHODE IN ABHÄNGIGKEIT WASSERART Trinkwasser Gussplatten für Koloniezahl mit DEV-Agar, Flüssigkeitsanreicherung / Titerbestimmung zum Nachweis von Indikatororganismen, Membranfilterverfahren, Subkultur, biochemische Identifizierung der nachgewiesenen Bakterien. TABELLE 1: GRENZ- UND RICHTWERTE FÜR TRINKWASSER NACH TWVO (1990). Organismus Grenzwert Richtwert Escherichia coli in 100 ml nicht enthalten d. h. Titer > 100 Coliforme Bakterien in 100 ml nicht enthalten (bei mind. 40 Untersuchungen müssen 95% die Bedingung erfüllen) d. h. Titer > 100 Fäkalstreptokokken in 100 ml nicht enthalten d. h. Titer > 100 Koloniezahl bei 20 C Koloniezahl bei 37 C 100 / ml 100 / ml Oberflächenwasser Guss- / Spatelplatten für Koloniezahl bzw. Coli- / Coliformenzahl, Flüssigkeitsanreicherung / Titerbestimmung zum Nachweis von Indikatororganismen (Quantifizierung mittels MPN-Verfahren), Membranfilterverfahren, Subkultur, biochemische Identifizierung der nachgewiesenen Bakterien. Abwasser Methoden sind variabel, wesentlich ist der angemessene Verdünnungsbereich (Untersuchungen mind. bis Stufe 10-6 ), Voraussetzung ist eine gute Homogenisierung der Probe, z.b. mittels Ultra-Turrax, - 7 -

8 2 ABLAUFPLAN DES PRAKTIKUMS 2.1 ÜBERSICHT DER ZU UNTERSUCHENDEN WASSERPROBEN Bezeichnung TW EL BrW KA-ZL KA-AL BW RW Probe Trinkwasser Studenten Elbe Nähe Blaues Wunder Brunnenwasser Zulauf Kläranlage Kaditz Ablauf Kläranlage Kaditz Badeteich Rohwasser Wasserwerk Coschütz 2.2 ABLAUFSCHEMA In der ersten Woche werden ausgewählte Proben zunächst hinsichtlich der Koloniezahl untersucht. Es wird weiterhin der Nachweis von Coli/Coliformen sowie Fäkalstreptokokken mittels Flüssigkeitsanreicherung (Titer-Bestimmung) durchgeführt, zudem erfolgt eine Quantifizierung nach dem MPN-Verfahren mittels Colilert bzw. Enterolert Quanti tray. Weiterhin sollen unterschiedliche Proben auf ihr Wiederverkeimungspotential hin untersucht werden. Zusätzlich erfolgt die Bestimmung des Biologischen Sauerstoffbedarfes (BSB). In der zweiten Woche werden die angegebenen Proben auf das Vorhandensein von Pseudomonas aeruginosa, der Gattung Aeromonas sowie sulfitreduzierenden, sporenbildenden Anaerobiern (Clostridien) untersucht. Für Trinkwasser relevante Keime soll das Membranfiltrationsverfahren durchgeführt werden. Für ausgewählte Proben ist der Nachweis somatischer Coliphagen geplant. Im Kurs werden zwei Exkursionen durchgeführt: in das Wasserwerk Coschütz und auf die Kläranlage Kaditz. Am Freitag der 2.Woche wird eine Auswertung der durchgeführten Versuche stattfinden. Diese soll durch die Kursteilnehmer gestaltet werden. Für eine Scheinvergabe ist zudem das Bestehen eines Abschlusstestates notwendig Spätestens zwei Wochen nach Kursende ist ein Protokoll zu den Versuchen des Kurses abzugeben

9 3 DURCHFÜHRUNG DER BAKTERIOLOGISCHEN WASSERUNTERSUCHUNGEN 3.1 BESTIMMUNG DER GESAMTKEIMZAHL/KOLONIEZAHL Nährböden und Reagenzien: DEV-Agar (enthält Pepton, Fleischextrakt), sterile PBS (phosphatgepufferte NaCl-Lösung). Verdünnung der Wasserproben: Wasserproben auf Zimmertemperatur temperieren und gut durchmischen Verdünnungsreihe je nach Wasserart mit steriler PBS erstellen (0,5 ml Probe + 4,5 ml PBS). Gussplattenmethode (angewendet für TW eigener Wahl): jeweils 1 ml des Originalwassers mit ca. 15 ml flüssigem handwarmen DEV-Agars (im Reagenzglas) in einer sterilen Petrischale vermischen (fertige Röhrchen stehen im Wasserbad) und in Petrischalen gießen (jeweils zwei Platten) Bebrütung: 44 ± 4 h bei 20 ±2 C bzw. 44 ± 4 h bei 36 ±1 C. Achtung: - Diese Methode nur für die TW-Probe verwenden. - Vor dem Vermischen von Agar und Wasserprobe den Agar auf ca. 50 C abkühlen lassen, dann aber rasch arbeiten, um ein Verklumpen des Agars zu vermeiden. - Bis zum vollständigen Erstarren des Agars die Platten nicht bewegen. Spatelplattenmethode: anzusetzende Proben und deren Verdünnungen : TABELLE.: 3.1 PROBENÜBERSICHT FÜR DIE SPATELPLATTENMETHODE. Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL 10-2, 10-3, ZL-KA 10-5, 10-6, AL-KA 10-2, 10-3, BW orig, 10-1, BrW orig, 10-1, RW orig, 10-1, 10-2 Angegebene Verdünnung herstellen (0,5 ml Probe + 4,5 ml PBS), Von jeder Verdünnungsstufe werden jeweils 0,1 ml auf die Agaroberfläche (DEV- Nähragarplatten, fertig vorbereitet) pipettiert und mit einem Drigalski-Spatel unter drehender Bewegung gleichmäßig verteilt. Hinweis: - Zum Herstellen der Verdünnungen die Ansätze gründlich vortexen, - Bitte einen Spatel pro Probe verwenden und in abnehmender Verdünnung ausstreichen - 9 -

10 Wie beim Gussplattenverfahren (s. o.) werden zwei Platten angelegt und bei 20 ±2 C bzw. 36 ±1 C 44 ± 4 h bebrütet. Auswertung: Auszählung aller gewachsenen Kolonien auf den Agarplatten, Achtung: 1. Nur Platten auswerten, deren Koloniezahl zwischen 20 und 200 pro Platte liegt. 2. Wenn die Platte gleichmäßig bewachsen ist, kann sie zum Auszählen auch geteilt werden. 3. Für Mittelwertbildung und Berechnung nur Platten mit geringem systematischen Fehler verwenden (siehe 1.) Bei Berechnung der Koloniezahl sind die eingesetzte Probenmenge (1 ml bei Gussplatte und 0,1 ml bei Spatelplatte) und die jeweilige Verdünnung zu berücksichtigen. Angabe der Ergebnisse: die Koloniezahl wird auf 1 ml des untersuchten Wassers bezogen, Beispiel: Koloniezahl (DEV-Agar, 44 h, 20 C): 120 Kolonien/ml KBE (DEV-Agar, 44 h, 20 C): 120/ml (KBE = koloniebildende Einheiten) 3.2 NACHWEIS VON COLI/COLIFORMEN Begriffsbestimmung: E. coli und coliforme Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Es sind gramnegative stäbchenförmige Bakterien, die keine Sporen bilden. Es gibt sowohl bewegliche als auch unbewegliche Vertreter. Physiologisch zeichnen sie sich durch einen aeroben und anaeroben Laktose-Abbau aus. Sie sind Cytochromoxidase-negativ. Mit der nachfolgenden Methode werden sowohl E. coli (direkt) als auch viele unterschiedliche Vertreter der Enterobacteriaceae (Coliforme), z.b. Vertreter der Gattungen Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter u.v.a., nachgewiesen. E.coli/Coliforme werden als Indikatorkeime für das Vorliegen von Verunreinigungen mit Warmblüterfäkalien gewertet. Nach TWVO müssen alle die Laktosevergärung zu Säure und Gas (innerhalb von 48 h bei 37 C) als gemeinsames Merkmal haben und Cytochrom-c Oxidase negativ sein QUANTIFIZIERUNG VON E. COLI NACH DEM MPN-VERFAHREN Das Colilert-System basiert auf der Defined Substrate Technology (DST ) zum Nachweis von E.coli und Coliformen in Wasser. Die Nachweis-Reaktionen beruhen auf der Aktivität der Enzyme β-glucuronidase (E.coli) und β-galactosidase (Coliforme). Während der Inkubationszeit verstoffwechseln die coliformen Bakterien mit Hilfe des Enyzms β- Galactosidase den im Colilert-Test enthaltenen spezifischen Indikatornährstoff ONPG und bewirken so eine Farbänderung von farblos nach gelb. Bei Anwesenheit von E.coli wird zusätzlich durch die Aktivitität der β-glucuronidase aus dem Substrat Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) das fluoreszierende 4-Methylumbelliferon freigesetzt. Die Fluoreszenz wird mittels einer UV-Lampe sichtbar gemacht. Die Quantifizierung erfolgt nach dem MPN-Verfahren

11 TAB.: PROBENVERTEILUNG FÜR COLI-TITERBESTIMMUNG. Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL original 2 ZL-KA 3 AL-KA 4 BW 5 BrW 6 RW original original original Es ist folgende Vorgehensweise anzuwenden: 100 ml der zu analysierenden Wasserprobe in einen Messzylinder abfüllen, Die Wasserprobe in eine sterile 250 ml Schott-Flasche geben und den Inhalt des Colilert-Testkits hinzugeben und lösen (+ 2 Tropfen Antifoam-Lösung) Die aus Probe und Reagenz bestehende Mischung in ein Quanti Tray 2000 gießen. Dabei ist folgendes zu beachten: Den oberen Teil des Quanti Trays etwas zusammendrücken. Die Frontlasche von der Seite mit den Vertiefungen abziehen. Dabei darf die Innenseite der Folie oder des Trays nicht berührt werden. Eingießen der Mischung; Berührung mit Folienlasche vermeiden. Seitlich 2-3mal an die kleinen Vertiefungen klopfen, um evl. Luftblasen zu entfernen. Den mit Probe gefüllten Quanti Tray auf die Gummi-Trägerunterlage des Versiegelungsgerätes legen. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten zeigen. Verschweißen des Trays/Beschriften Inkubation der Ansätze bei 35 C für 24h Auswertung: Die Ergebnisse anhand der nachstehenden Ergebnisauswerte-Tabelle ablesen. Die Anzahl der positiven Vertiefungen zählen (Gelbfärbung und Fluoreszenz): Prüfung auf Fluoreszenz mit einer 6-Watt, 365 nm UV-Lampe aus einem Abstand von 13 cm in einer dunklen Umgebung (UV Viewing Cabinet). Colilert18 Ergebnisse sind nach 18 Stunden definitiv. die wahrscheinlichste Zahl (MPN; Most Probable Number) anhand der MPN-Tabelle bzw. des MPN Calculators ermitteln. TABELLE 3.2.1: ERGEBNISAUSWERTUNG DES COLILERT-VERFAHRENS. Erscheinungsbild der Probe keine Gelbfärbung Gelbfärbung Gelbfärbung und Fluoreszenz Ergebnis Negativ für Gesamtcoliforme und E. coli Positiv für Gesamtcoliforme Positiv für E. coli

12 3.2.2 BESTIMMUNG DES COLI-TITERS DURCH FLÜSSIGANREICHERUNG Nährböden und Reagenzien: MUG-Laurylsulfat-Bouillon Probenansätze: Trinkwasser (angewendet für TW eigener Wahl, alle Gruppen): 100 ml Probewasser werden unter sterilen Bedingungen in 50 ml dreifach konzentrierte MUG-Laurylsulfatbouillon gegeben und bei 24 ± 4 h bzw. 44 ± 4 h bei 36 ± 1 C bebrüten. (Die 50 ml MUG-Laurylsulfatbouillon stehen in graduierten Flaschen bereit, d.h. mit der Probe auf 150 ml Gesamtvolumen auffüllen) Oberflächenwasser: TAB.: PROBENVERTEILUNG FÜR COLI-TITERBESTIMMUNG. Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL 2 ZL-KA 3 AL-KA 4 BW 5 BrW 6 RW siehe Anleitung BrW/BW: 10 ml Probe in 5 ml dreifach konzentrierte MUG-Laurylsulfatbouillon gegeben, 1ml Probe in 9 ml einfach konz. MUG-Laurylsulfatbouillon gegeben, 1ml der 10-1 Verdünnung zu 9 ml MUG-Laurylsulfatbouillon gegeben, RW: 1 ml Probe in 9 ml einfach konz. MUG-Laurylsulfatbouillon gegeben, Verdünnungsstufen 10-1 bis 10-3 herstellen, je 1 ml der Verdünnung in 9 ml einfach konz. MUG-Laurylsulfatbouillon gegeben, AL-KA, EL: Verdünnungsstufen 10-2 bis 10-5 herstellen, je 1 ml der Verdünnung in 9 ml einfach konz. MUG- Laurylsulfatbouillon gegeben, ZL-KA: Verdünnungsstufen 10-3 bis 10-6 herstellen, je 1 ml der Verdünnung in 9 ml einfach konz. MUG- Laurylsulfatbouillon gegeben Bebrütung:

13 24 ± 4 h bzw. 44 ± 4 h bei 36 ± 1 C Auswertung: Trübung durch Wachstum E.coli oder Colifome vorhanden Fluoreszenz E. coli vorhanden Coli-Titer ist die größte Verdünnungsstufe bzw. kleinste Wassermenge in der Wachstum bzw. Fluoreszenz festgestellt werden. Beispiel: Trübung Fluoreszenz Verdünnungsstufe Verdünnungsstufe Verdünnungsstufe Der Coli-Titer dieser Probe ist 10-3, d.h. coliforme Keime sind noch in 0,001 ml der Probe nachweisbar. Achtung: Das bisherige Ergebnis ist als Verdacht zu werten, welcher durch weitere Nachweise bestätigt werden muss ANLEGEN VON SUBKULTUREN Nährböden und Reagenzien: ENDO-Agar bzw.tergitol-7-agar Wird in der primären Anreicherungskultur oder den Kulturen der Verdünnungsstufen eine positive Reaktion beobachtet, ist das Anlegen einer Subkultur und eine nachfolgende biochemische Identifizierung notwendig. Von allen verdächtigen Ansätzen wird dazu jeweils ein Tropfen der Bakteriensuspension mit einer Impföse auf feste Selektivmedien (z.b. ENDO-Agar oder Tergitol-7-Agar) fraktioniert ausgestrichen. Ziel ist das Erreichen von Einzelkolonien für die weitere Differenzierung. Wenn kein positiver Ansatz vorliegt, sollte nach Möglichkeit die Menge des für den Nachweis verwendeten Wassers erhöht oder die Differenzierung aus positiven Ansätzen anderer Wasserproben ausgeführt werden BIOCHEMISCHE IDENTIFIZIERUNG BUNTE REIHE Nährböden und Reagenzien: Simmon s Citratagar Tryptophan-Bouillon Laktose-Bouillon Glucose-Bouillon MR-VP-Bouillon Cytochromoxidase-Reagenz Indol-Reagenz (Kovacs Reagenz) Harnstoffagar Kligler-Schrägagar-Röhrchen

14 verdächtige Einzelkolonien der Subkulturen in Tryptophan-Bouillon überimpfen (je 2-3 Kolonien getrennt, mit bzw. ohne Fuchsinglanz). Hierzu nur die beiden höchsten Verdünnungsstufen der jeweiligen Wasserprobe, in denen der Verdacht auf Coli/Coliforme besteht, verwenden. ggf. müssen die Subkulturen noch mal auf Nähragarplatten ausgestrichen werden, um Reinkulturen zu erzielen. die Tryptophanbouillon wird für 3 bis 6 h bei 36 ± 1 C bebrütet, (Achtung damit muss begonnen werden!) daraus Überimpfung mittels steriler Impföse nacheinander in bzw. auf: Ammoniumcitrat-Schrägagar (Simmons-Citrat-Agar) Laktose-Pepton-Bouillon Glucose-Pepton-Bouillon Achtung: Keine Glucose in die Laktosebouillon tragen. (Reihenfolge beachten) MR-VP-Bouillon Harnstoffagar Kligler-Schrägagar-Röhrchen ¼ Sektor NA-Platte (je Einzelkolonie) für den Oxidase-Nachweis und Gram- Färbung Zusätzlich Cytochrom-c Oxidase Test mittels Teststreifen durchführen Bebrütung: 24 ± 4 h bei 36 ± 1 C Achtung: Ausnahme Glukose-Bouillon: die 24 ± 4 h bei 44 ± 1 C bebrütet wird zur Unterscheidung E. coli/coliforme. Auswertung der Bunten Reihe : Indol-Bildung: Nachweis durch Überschichten der Tryptophan-Bouillon mit Indolreagenz: positiv: rosa bis intensiv rote Färbung des Überstandes negativ: schwach bis stark gelbliche Verfärbung des Überstandes Citrat-Verwertung: positiv: negativ: Wachstum und Farbumschlag nach Blau auf der Schrägagarfläche kein Wachstum, kein Farbumschlag Laktose-Fermentation: positiv: Farbumschlag nach Gelb und Gasbildung im Durham-Röhrchen negativ: kein Farbumschlag oder Gelbfärbung ohne Gasbildung Achtung: Laktose-Röhrchen mit negativer Reaktion müssen einen weiteren Tag bebrütet werden, um eine verzögerte Laktoseverwertung der Coliformen zu erfassen! Glucose-Fermentation: positiv: Farbumschlag nach Gelb und Gasbildung im Durham-Röhrchen

15 negativ: kein Farbumschlag oder Gelbfärbung ohne Gasbildung Cytochromoxidase-Test (mit Kolonien von NA-Platte): positiv: kräftig blau innerhalb 2 min negativ: keine Färbung, maximal schwache Blaufärbung (durch andere Oxidationsprozesse, u.u. durch Luftsauerstoff) Hinweis: Unter Umständen kann eine weitere Differenzierung der Coliformen erfolgen (z.b. mittels api-teststreifen (api 20-E). Auswertung Anhand der Subkulturen und der biochemischen Differenzierung kann das Wasservolumen bzw. die Verdünnungsstufe angegeben werden, in denen E. coli und/oder Coliforme nachweisbar sind (Titermethode). Zusätzlich sollten die biochemisch als E. coli/coliforme identifizierten Kolonien angegeben werden. Beispiel: In 1 ml wurden E. coli nachgewiesen ( bzw. nicht nachgewiesen). In 0,1 ml (Verd ) wurden Coliforme nachgewiesen (bzw. nicht nachgewiesen). Nachweis von E. coli sowie der Gattung Klebsiella. Um die Einhaltung der Grenzwerte der Trinkwasserverordnung zu belegen, wird bei Trinkwasserproben angegeben, ob E. coli oder Coliforme in 100 ml nachweisbar sind. Beispiel: Für die untersuchte Trinkwasserprobe konnte in 100 ml kein E. coli nachgewiesen werden. Damit wird der vorgegebene Grenzwert der TWVO eingehalten. Bei dem MPN-Verfahren kann durch den Nachweis/Nichtnachweis in Parallelansätzen verschiedener Verdünnungsstufen die wahrscheinlichste Keimzahl ermittelt werden (quantitative Auswertung). Im Praktikum ist eine MPN-Auswertung auf der Basis der Ergebnisse des Colilert-Ansatzes (Versuch 3.2.1) sowie der Flüssiganreicherung (Versuch 3.2.2) möglich. Im zweiten Fall stellen die Doppelbestimmung der eigenen Ansätze sowie die Ergebnisse des zweiten Praktikumteilnehmers, der die gleiche Probe bearbeitet, die für eine MPN- Auswertung notwendigen Parallelen dar ( 4 Parallelen). Die Ergebnisse beider Verfahren sollten verglichen und diskutiert werden. Neben der Angabe der MPN sollte auch die Spannweite der möglichen Keimzahl bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% als LL= lower level (Untergrenze) und UL=upper level (Obergrenze) angegeben werden. Beispiel: MPN-Colilert (E. coli): 2x10 4 KbE/ml LL: 1,4x10 3 KbE/ml; UL: 3 x10 5 KbE/ml MPN-Colilert (Coliforme): 5x10 5 KbE/ml LL: 3,2x10 4 KbE/ml; UL: 7 x10 5 KbE/ml

16 TAB 3.2.4: DIFFERENZIERUNG GRAMNEGATIVER STÄBCHEN Institut für Mikrobiologie Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie Escherichia coli Klebsiella oxytoca Proteus vulgaris Morganella morganii Salmonella havana Citrobacter freundii Serratia marcescens Pseudom. aeruginosa Pseudom. fluorescens Pseudom. stutzeri Aeromonas hydrophila Acinetobacter junii Oxidase Laktose + + variabel Glucose (OF) F F F F F F F O O O F O Kligler: Schrägfläche Stich Gas gelb gelb + rot/gelb gelb + rot gelb + rot gelb (+) rot gelb meist + rot/gelb gelb + rot gelb ( ) rot rot rot rot rot rot rot rot rot rot (+) H 2 S I Indol M Methylrot Vo Voges- Proskauer C Citrat Urease Beweglichkeit Wachst. auf Cetrimidagar Pigmente Prodigiosin (rot) Pyocyanin (blaugrün), Fluorescein Fluorescein (gelbgrün) gelblich LEGENDE: KEIN WACHSTUM / NEGATIVE REAKTION + NUR IM ANSTRICH WACHSTUM/VARIABLE REAKTION + SEHR ZARTES WACHSTUM ÜBER DEN ANSTRICH HINAUS / POS. REAKTION ++ GUTES WACHSTUM +++ ÜPPIGES WACHSTUM

17 3.3 NACHWEIS VON FÄKALSTREPTOKOKKEN Institut für Mikrobiologie Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie Begriffsbestimmung: Fäkalstreptokokken stellen keine taxonomisch-systematische Einheit dar, sondern umfassen verschiedene Arten, die im Darm von Menschen und Tieren aber auch auf Pflanzen vorkommen. Der Nachweis von Fäkalstreptokokken zeigt mit hoher Wahrscheinlichkeit eine fäkale Verunreinigung des Wassers an. Wegen des Besitzes eines Antigens (des Lancefield-Gruppen-Antigens-D) werden sie zur serologischen Gruppe der D-Streptokokken zusammengefasst. Sie sind grampositiv, Katalase-negativ und wachsen in einem Temperaturbereich von 10 C bis 45 C. Das Wachstum in Gegenwart von 0,02% Natriumazid, 6,5 % NaCl, 40% Rindergalle und ph 9,6 kennzeichnet sie als sehr umweltresistente Keime QUANTIFIZIERUNG VON FÄKALSTREPTOKOKKEN NACH DEM MPN-VERFAHREN Enterolert E ist zum Nachweis von Enterokokken, wie z. B. E. faecium und E. faecalis, in Süßund Meereswasser entwickelt worden. Der Test basiert auf der patentierten Defined Substrate Technology (DST ). Wenn die Enterokokken mit ihrem ß-Glucosidase-Enzym den Nährstoff-Indikator 4- Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid des Enterolert E metabolisieren, fluoresziert die Probe. Enterolert E weist Enterokokken im Bereich von 1 CFU (kbe; koloniebildende Einheit) pro 100 ml Probe innerhalb von 24 Stunden nach. TAB.: PROBENVERTEILUNG FÜR ENTEROLERT-BESTIMMUNG. Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL original 2 ZL-KA AL-KA BW original 5 BrW original 6 RW original Es ist folgende Vorgehensweise anzuwenden: 100 ml der zu analysierenden Wasserprobe in einen Messzylinder abfüllen, Die Wasserprobe in einen sterilen Kolben geben und den Inhalt des Enterolert- Testkits hinzugeben und lösen (+ 2 Tropfen Antifoam-Lösung) Die aus Probe und Reagenz bestehende Mischung in ein Quanti Tray 2000 gießen. Dabei ist folgendes zu beachten: Den oberen Teil des Quanti Trays zusammendrücken. Die Frontlasche von der Seite mit den Vertiefungen abziehen. Dabei darf die Innenseite der Folie oder des Trays nicht berührt werden. Eingießen der Mischung; Berührung mit Folienlasche vermeiden. Seitlich 2-3mal an die kleinen Vertiefungen klopfen, um evl. Luftblasen zu entfernen.

18 Den mit Probe gefüllten Quanti Tray auf die Gummi-Trägerunterlage des Versiegelungsgerätes legen. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten zeigen. Versiegelung/Beschriften Inkubation der Ansätze bei 41 C für 24h Auswertung: Die Ergebnisse anhand der nachstehenden Ergebnisauswerte-Tabelle ablesen. Die Anzahl der positiven Vertiefungen zählen (Fluoreszenz): Prüfung auf Fluoreszenz mit einer 6-Watt, 365 nm UV-Lampe aus einem Abstand von 13 cm in einer dunklen Umgebung (UV Viewing Cabinet). EnteroLert E Ergebnisse sind nach Stunden definitiv. die wahrscheinlichste Zahl (MPN; Most Probable Number) anhand der MPN-Tabelle bzw. des MPN Calculators ermitteln. TABELLE 3.3.1: ERGEBNISAUSWERTUNG DES ENTEROLERT-VERFAHRENS. Erscheinungsbild der Probe Ergebnis Keine Fluoreszenz Negativ für Enterokokken Blaue Fluoreszenz Positiv für Enterokokken NACHWEIS DER FÄKALSTREPTOKOKKEN MITTELS FLÜSSIGKEITSANREICHERUNGSVERFAHREN UND BESTÄTIGUNGSREAKTIONEN Nährböden und Reagenzien: einfach und dreifach konzentrierte Azid-Glucose-Bouillon Nähragar Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar TTC-Azid-Agar Hirn-Herz-Bouillon; ph 9,6 und Hirn-Herz-B; 6,5% NaCl Lösungen zur Durchführung der Gramfärbung Wasserstoffperoxid, 3% Die Methode eignet sich zum Nachweis von Fäkalstreptokokken in Trinkwasser, Oberflächenwasser und Abwasser. Durchführung des qualitativen Nachweises nach TWVO: Trinkwasser: 100 ml des zu untersuchenden Trinkwassers werden mit 50 ml dreifach konz. Azid- Glucose-Bouillon gemischt. (Die 50 ml Azid-Glucose-Bouillon stehen in graduierten Flaschen bereit, d.h. mit der Probe auf 150 ml Gesamtvolumen auffüllen) 18

19 TAB.: 3.3.1: PROBENVERTEILUNG FÜR DEN NACHWEIS VON FÄKALSTREPTOKOKKEN IN OBERFLÄCHENWASSERPROBEN Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL 2 ZL-KA 3 AL-KA 4 BW 5 BrW 6 RW siehe Anleitung BW, BrW, RW: 100 ml des zu untersuchenden Originalwassers werden mit 50 ml dreifach konz. Azid-Glucose-Bouillon gemischt. 10 ml des zu untersuchenden Originalwassers werden mit 5 ml dreifach konz. Azid-Glucose-Bouillon gemischt. 1 ml d. Originalwassers u. der Verdünnung des zu untersuchenden Wassers werden in 9 ml einfach konz. Azid-Glucose-Bouillon gemischt ZL-KA: 1 ml einer 10-2 bis Verdünnung des zu untersuchenden Wassers wird in 9 ml einfach konz. Azid-Glucose-Bouillon gemischt. AL-KA, EL: 1 ml einer 10-1 bis Verdünnung des zu untersuchenden Wassers wird in 9 ml einfach konz. Azid-Glucose-Bouillon gemischt. Bebrütung: 44 ±4 h bei 36 ±1 C, mit einer Zwischenablesung nach 24 h. Bei Trübung werden Fäkalstreptokokken vermutet. In diesem Fall erfolgt ein fraktionierter Ausstrich aller positiven Ansätze auf Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar und TTC-Acid-Agar; Bebrütung: 24 ±4 h bei 36 ±1 Wenn kein positiver Ansatz vorliegt, sollte nach Möglichkeit die Menge des für den Nachweis verwendeten Wassers erhöht oder die Differenzierung aus positiven Ansätzen anderer Wasserproben ausgeführt werden. Verdächtige Kolonien: - helle bis dunkle Kolonien mit einem schwarzen Hof (Halo-Bildung) auf Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar, - dunkelrote kleine Kolonien auf TTC-Azid-Agar verdächtige Einzelkolonien (mind. 3) der Subkulturen bzw. auch von den Spatelplatten (Reinkulturen!) in Hirn-Herz-Bouillon (ohne Zusätze) überimpfen, Hierzu nur die beiden höchsten Verdünnungsstufen der jeweiligen Wasserprobe, in denen der Verdacht auf Fäkalstreptokokken besteht, verwenden. Aus der getrübten Bouillon können dann weitere Differenzierungsnachweise beimpft werden: - Hirn-Herz-Bouillon ph-wert 9,6 und 6,5% NaCl, - NA-Platte zur Gramdifferenzierung und Katalasenachweis beimpfen (Platten teilen) 19

20 Bestätigungstests: Gram-Färbung: Gram + Diplokokken Katalase-Test: Fäkalstreptokokken sind Katalase-negativ Hirn-Herz-Bouillon ph 9,6 bzw. Hirn-Herz-Bouillon mit 6,5% NaCl: nur Fäkalstreptokokken sind in der Lage zu wachsen! Azidresistenz: TTC-Acid-Agar; Wachstum als rote Kolonien Äsculinspaltung: schwarze Kolonien auf Äsculinagar Auswertung: Die Auswertung erfolgt adäquat zum Nachweis von E. coli / Coliformen (siehe 3.2.5). Im Fall der Trinkwasserprobe erfolgt ein qualitativer Nachweis entsprechend der TWVO. Beispiel: Fäkalstreptokokken sind in 100 ml nachweisbar (nicht nachweisbar). Die Vorgaben der TWVO werden damit erfüllt/nicht erfüllt. Anhand der Subkulturen und der Bestätigungstests kann das Wasservolumen bzw. die Verdünnungsstufe angegeben werden, in denen Fäkalstreptokokken nachweisbar sind (Titermethode). Beispiel: In 1 ml wurden Enterococcen nachgewiesen (nicht nachgewiesen). Bei dem MPN-Verfahren kann durch den Nachweis/Nichtnachweis in Parallelansätzen verschiedener Verdünnungsstufen die wahrscheinlichste Keimzahl ermittelt werden (quantitative Auswertung). Im Praktikum ist eine MPN-Auswertung auf der Basis der Ergebnisse des Enterolert- Ansatzes (Versuch 3.3.1) sowie der Flüssiganreicherung (Versuch 3.3.2) möglich. Im zweiten Fall stellen die Doppelbestimmung der eigenen Ansätze die für eine MPN- Auswertung notwendigen Parallelen dar. Die Ergebnisse beider Verfahren sollten verglichen und diskutiert werden. Neben der Angabe der MPN sollte auch die Spannweite der möglichen Keimzahl bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% als LL= lower level (Untergrenze) und UL=upper level (Obergrenze) angegeben werden. Beispiel: MPN-Enterolert E: 2 x 10 4 KbE/ml LL: 1 x 10 4 KbE/ml UL: 4 x 10 4 KbE/ml MPN-Flüssiganreicherung: 1,8 x 10 4 KbE/ml LL: 1 x 10 4 KbE/ml UL: 3 x 10 4 KbE/ml 20

21 3.4 NACHWEIS VON PSEUDOMONAS AERUGINOSA Begriffsbestimmung Pseudomonas aeruginosa ist ein gram negatives, Oxidase-positives, bewegliches Stäbchen, das keine Sporen bildet und durch die Produktion von Farbstoffen, insbesondere dem artspezifischen blaugrünen Pyocyanin, aber auch von Pyorubrin und Fluorescein charakterisiert ist. Es wird häufig im Boden, an Pflanzen und im Abwasser gefunden, kommt aber auch im Darmkanal von Mensch und Tier vor. Charakteristisch sind seine hohe Widerstandsfähigkeit und die geringen Nährstoffansprüche. Aufgrund von Infektionen mit diesem Keim bei unzureichender Badewasseraufbereitung ist die Prüfung auf Ps. aeruginosa für Schwimm- und Badebeckengewässer vorgeschrieben. Ebenso ist eine Prüfung von natürlichen Mineral-, Quell- und Tafelwasser, sowie von Trinkwasser hinsichtlich einer Kontamination notwendig. Nährböden und Reagenzien Malachitgrün-Pepton-Bouillon, einfach und dreifach konzentriert Cetrimid-Agar Cytochromoxidase-Reagenz Chemikalien für Gramfärbung Chloroform Nachweis von Pseudomonas aeruginosa in Brunnen-/Quellwasser sowie im Oberflächenwasser. TABELLE 3.4: PROBENVERTEILUNG FÜR DEN NACHWEIS VON PSEUDOMONAS AERUGINOSA. Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL 2 ZL-KA 3 AL-KA 4 BW 5 BrW 6 RW siehe Anleitung BW, BrW, TW: 100 ml des zu untersuchenden Wassers werden mit 50 ml dreifach konz. Malachitgrün-Pepton-Bouillon gemischt. (Die 50 ml Malachitgrün-Pepton-Bouillon stehen in graduierten Flaschen bereit, d.h. mit der Probe auf 150 ml Gesamtvolumen auffüllen) 10 ml des zu untersuchenden Wassers werden mit 5 ml dreifach konz. Malachitgrün-Pepton-Bouillon gemischt. 1 ml des Originalwassers und der Verdünnung des zu untersuchenden Wassers werden in 9 ml einfach konz. Malachitgrün-Pepton-Bouillon gemischt. 21

22 ZL-KA: 1 ml einer 10-2 bis 10-6 Verdünnung des zu untersuchenden Wassers werden in 9 ml einfach konz. Malachitgrün-Pepton-Bouillon gemischt. AL-KA, EL: 1 ml einer unverdünnten Probe bis Verdünnung des zu untersuchenden Wassers wird in 9 ml einfach konz. Malachitgrün-Pepton-Bouillon gemischt. informativ: Die gesetzliche Untersuchung von Mineral- und Tafelwasser sieht den Nachweis in 250 ml vor, d.h. 250 ml Wasserprobe werden zu 125 ml dreifach konzentrierter Bouillon gegeben. Inkubation für 20 ±4 h bei 36 ±1 C, bei negativer Reaktion noch weitere 24 h, Trübung (evtl. verbunden mit Gelbfärbung) zeigt Wachstum an und gilt als Verdacht auf Ps. aeruginosa. Wenn kein positiver Ansatz vorliegt, sollte nach Möglichkeit die Menge des für den Nachweis verwendeten Wassers erhöht oder die Differenzierung aus getrübten Ansätzen anderer Wasserproben ausgeführt werden. ' Bestätigungstests: Isolation von Reinkulturen durch fraktionierten Ausstrich eines Tropfens der Bouillon auf Cetrimid-Agar; Bebrütung bei 36 ±1 C für 20 ±4 h; für alle positiven Ansätze der Flüssiganreicherung, Wachstum auf diesem Selektivnährboden, verbunden mit Farbstoffproduktion (blaugrün bis violett) spricht für Ps. aeruginosa. Nachweis der Pigmente durch Chloroformausschüttellung: - Beimpfen der Nährbouillon (2 Röhrchen) aus den beiden am höchst verdünnten Ansätzen der Flüssiganreicherung bzw. auf Cetrimidagar; - Inkubation bei 30 und 36 C ±1 C für mind. 24 h - Bei Trübung (nach mind. 1 Tag) 2 ml Chloroform zugeben (unter dem Abzug arbeiten) - Testansatz wiederholt gut vortexen und nachfolgend ca. 3 h stehen lassen (Fensterbrett) Hinweis: P. aeruginosa bildet zwei Pigmente: Pyocyanin ist ein blaugrünes Pigment, welches in Chloroform und Wasser löslich ist. Fluorescein ist ein gelbgrünes Pigment, welches in Wasser löslich aber in Chloroform unlöslich ist. Durch das Überschichten einer Flüssigkultur von P. aeruginosa mit Chloroform können die beiden Pigmente getrennt und sichtbar gemacht werden. Test auf Cytochromoxidase und Anfärbung nach GRAM. gramnegative und Oxidase-positive Stäbchen bestätigen den Verdacht ggf. Differenzierung mittels API 20 NE. 22

23 Auswertung Die Angabe des Ergebnisses erfolgt als Wasservolumen/Verdünnungsstufe, in dem Ps. aeruginosa noch nachgewiesen werden konnte (Titerangabe). Die Auswertung der von den verschiedenen Bearbeitern parallel angesetzten Proben sowie der eigenen Parallelen kann auch nach dem MPN-Verfahren erfolgen (Angabe des MPN-Index je Probevolumen) (siehe Auswertung Versuch 3.2 bzw. 3.3). 3.5 NACHWEIS UND DIFFERENZIERUNGSGANG MITTELS MEMBRANFILTERVERFAHREN (EINSATZ VON NÄHRKARTONSCHEIBEN) Dieses Verfahren ist vorrangig zur Untersuchungen von Wässern mit geringerer Keimbelastung geeignet. Im Kurs werden TW (100ml) und RW (10 ml und 1 ml) untersucht Einfachbestimmung! Die benötigten Nährkartonscheiben (NKS) werden aus der Verpackung entnommen und mit ca. 3 ml sterilem A. dest. angefeuchtet. 100 ml der Originalprobe werden durch sterile Membranfilter (Porenweite 0,45 µm) filtriert. Wenn geringere Probenvolumina eingesetzt werden sollen, wird das zu filtrierende Volumen mit sterilem Leitungswasser auf 100 ml aufgefüllt und die Probe vor dem Filtrieren gut durchmischt. Nach Filtration der Probe wird der Filter unter Vermeidung von Luftblasenbildung auf die NKS gelegt und entsprechend der nachfolgenden Tabelle bebrütet. Die Auswertung erfolgt nach der angegebenen Inkubationsdauer anhand der in der Tabelle 3.5 aufgeführten Merkmale. Das Ergebnis wird als Koloniezahl pro filtriertes Wasservolumen angegeben (gegebenenfalls werden verschiedene Kolonietypen separat erfasst, z.b. auf Tergitol- TTC-NKS E. coli und Coliforme). Beispiel: 10 Kolonien (E. coli - verdächtig oder bestätigt) in 100 ml, 25 Kolonien Coliforme in 100 ml 23

24 TABELLE 3.5: ÜBERSICHT DER VERWENDETEN NÄHRKARTONSCHEIBEN. Bezeichnung spezielle Verwendung Bebrütung Kolonien Standard-NKS Pepton-Fleischextrakt 44 ± 4 h; Verschieden ausgebildete Medium (entspr. TWVO) 20 ± 2 C Kolonien zur Best. der Koloniezahl ENDO-NKS Selektiv-Nährboden zum Nachweis von E. coli und 20 ± 4 h; 36 ± 1 C coliformen Bakterien Tergitol-TTC- Nachweis coliformer 20 ± 4 h; NKS Bakterien u. E. coli 36 ± 1 C Azid-NKS Cetrimid-NKS Nachweis von Enterokokken nach SLANETZ UND BARTLEY Nachweis von Pseudomonas nach LOWBURY 44 ± 4 h; 36 ± 1 C 44 ± 4 h; 36 ± 1 C dunkelrot; E. coli: Fuchsinglanz Coliforme Bakterien: rote Kolonien; E. coli u. evtl. Enterobacter aerogenes: gelb bis orange mit gelbem Hof. Schwärmen von Proteus verhindert rote bis rotbraune kleine runde Kolonien Ps. aeruginosa meist blaue Kolonien mit blauem Hof; d:1-2 mm 3.6 NACHWEIS VON AEROMONADEN Begriffsbestimmung Aeromonaden sind gramnegative, fakultativ anaerobe Kurzstäbchen, die keine Sporen bilden. Sie sind zum Atmungs- und Gärungsstoffwechsel befähigt und besitzen Katalase- und Oxidase- Aktivität. Sie weisen nur geringe Nährstoffansprüche auf und wachsen auch bei niedrigen Temperaturen (optimal bei 15 bis 30 C). Aeromonaden sind ubiquitär im Wasser verbreitet und kommen teilweise mit hohen Keimzahlen im Abwasser vor. Die Anwesenheit im Trinkwasser weist auf unzureichende Desinfektionswirkung oder auf das Vorhandensein von durch Bakterien assimilierbare Wasserinhaltsstoffe hin. Einige Arten gelten als human- und tierpathogen. Nährböden und Reagenzien Ampicillin-Dextrin-Medium (Anreicherungsmedium, 5fach konzentriert) enthält: Bromthymolblau als ph-indikator und Ampicillinlösung Ampicillin-Dextrin-Agar enthält: Bromthymolblau als ph-indikator und Ampicillinlösung ENDO-Agar VP-Methylrot-Bouillon OF-Medium (mit und ohne Paraffinüberschichtung) Cytochromoxidase-Reagenz Katalasenachweis (H 2 O 2) 24

25 TABELLE 3.6: PROBENVERTEILUNG FÜR AEROMONASNACHWEIS. Gruppe Proben Verdünnungen 1 EL 2 ZL-KA 3 AL-KA siehe Anleitung 4 BW 5 BrW 6 RW BW, BrW, RW: 8 ml des zu untersuchenden Wassers werden mit 2 ml 5fach konz. Ampicillin-Dextrin- Bouillon gemischt (1:5 Verdünnung!!). 1 ml des Originalwassers und der Verdünnungen des zu untersuchenden Wassers werden in 9 ml einfach konz. Ampicillin-Dextrin-Bouillon gemischt. ZL-KA: 1 ml einer 10-2 bis 10-6 Verdünnung des zu untersuchenden Wassers wird in 9 ml einfach konz. Ampicillin-Dextrin-Bouillon gemischt. AL-KA, EL: 1 ml einer unverd. bis Verdünnung des zu untersuchenden Wassers werden in 9 ml einfach konz. Ampicillin-Dextrin-Bouillon gemischt Ansätze bei 28 ±2 C für 20 ±4 h inkubieren. Bestätigungsreaktionen: im Falle einer Gelbfärbung des Mediums wird zur Isolation von Einzelkolonien und zur Bestätigung auf Ampicillin-Dextrin-Agar fraktioniert ausgestrichen und nochmals bei 28 ±2 C 20 ±4 h lang bebrütet. Achtung: Da die Ampicillin-Dextrin-Bouillon erfahrungsgemäß häufig zu falschpositiven Ergebnissen führt, sollten alle Anreicherungsansätze getestet werden. Achtung: - Gelbe Kolonien mit einem Durchmesser von ca. 2-3 mm, die auch das umgebende Medium gelb färben (Stärkeverwertung unter Säurebildung) sind "Aeromonas-verdächtig". - Kleiner oder verzögert wachsende Kolonien gelten als Begleitflora. Wenn kein positiver Ansatz vorliegt, sollte nach Möglichkeit die Menge des für den Nachweis verwendeten Wassers erhöht oder die Differenzierung aus getrübten Ansätzen anderer Wasserproben ausgeführt werden. 25

26 Mit den beiden höchstverdünnten Ansätzen, in denen ein positiver Nachweis (charakteristisches Wachstum auf Ampicillin-Dextrin-Agar) geführt werden konnte, sollten nachfolgende Bestätigungsreaktionen durchgeführt werden (mit mind. zwei verdächtigen Kolonien). Die Einzelkolonien sollten zunächst in die VP-Methylrot-Bouillon abgeimpft werden (3-4h bei 37 C inkubieren), anschließend können hieraus alle anderen Nachweise abgeimpft werden (siehe Tabelle ) Beimpfen des O/F-Mediums mit und ohne Paraffinüberschichtung (24h bei 37 C inkubieren) Achtung: Für die Bestätigungsreaktionen die Platten Vierteln Eine weitere Bestätigung mittels einer speziellen "Bunten Reihe" wird im Rahmen des Praktikums nicht durchgeführt, ggf. kann aber eine Bestätigung mittel API-Teststreifen erfolgen (entsprechende Gebrauchsanweisung beachten!) Angabe der Ergebnisse Die Auswertung erfolgt entsprechend dem Titerverfahren, d.h. es wird das Wasservolumen bzw. die Verdünnungsstufe angegeben, in dem noch Aeromonaden nachgewiesen werden konnten. Eine Abschätzung der Keimzahl mittels MPN-Verfahren wird beim Ansetzen mehrerer Parallelen je Verdünnungsstufe möglich (siehe auch Auswertung der Versuche 3.2 und 3.3). 3.7 NACHWEIS VON CLOSTRIDIEN Begriffsbestimmung: Mit der beschriebenen Methode werden die Sporen sulfitreduzierender Clostridien, grampositiver, anaerober Sporenbildner nachgewiesen. Clostridiensporen sind im Abwasser, aber auch in Böden oder Gewässersedimenten verbreitet, ihr Nachweis zeigt Verunreinigungen (fäkaler Natur) an. Einige Arten sind humanmedizinisch bedeutsam (Gasbranderreger: Clostridium perfringens). Nährböden und Reagenzien: TSC-Agar (enthält Tryptose, Sulfit, Cycloserin) Schaedler Bouillon Blutagar Anaerobier-Topf inkl. Reagenzien (falls kein Anaerobier-Brutschrank vorhanden ist) Reverse CAMP-Test auf Blutagar 26

27 Ansatz: Die zu untersuchende Wasserprobe wird auf 80 C erhitzt und 15 min bei dieser Temperatur gehalten (Abtötung der vegetativen Zellen, auch der Begleitflora). Proben rasch abkühlen lassen, TABELLE 3.7: PROBENVERTEILUNG FÜR DEN NACHWEIS VON CLOSTRIDIEN. Gruppe Proben Volumen 1 EL 1, 0.1, 0.01 ml 2 ZL-KA 10-2 bis AL-KA 1, 0.1, 0.01 ml 4 BW 50, 25, 10 ml 5 BrW 50, 25, 10 ml 6 RW 50, 25, 10 ml Die entsprechenden Probenkonzentration(-menge) über eine Cellulosenitratfilter (0,45µm) filtrieren und die Filter auf TSC-Agar auflegen (filtrierte Zellen nach oben). Achtung: - Mindestmenge für Filtration: 1mL; ggf. Verdünnungen herstellen. - Für die Filtration ca. 10mL steriles Leitungswasser vorlegen, um eine gute Verteilung der Sporen auf dem Filter zu sichern. Bebrütung für 24 h bei 44 C im Anaerobier-Brutschrank oder im Anaerobier-Topf, Hinweis: Entsprechende Bedienungsanleitungen beachten! Der Zutritt von Luftsauerstoff bei der Weiterbearbeitung der Proben ist auszuschließen bzw. zu minimieren! Das Wachstum braunschwarzer Kolonien und deren Fluoreszenz weist auf Clostridien hin. Zur Anreicherung je Filter 1-2 positive Einzelkolonien jeweils in Schaedler Bouillon abimpfen und anaerob bei 24 h bei 44 C bebrüten. Kontrollausstrich der gewachsenen Kulturen auf Schaedleragar/Blutagar (Platten teilen!) unter aerober und anaerober Bebrütung (bei 44 C für 24 h) Nachweis von Clostridien gilt als erbracht, wenn Wachstum nur in anaerober Subkultur erfolgt. Reverse CAMP-Test zum Nachweis von Clostridium perfringens 27

28 3.8 NACHWEIS VON BAKTERIOPHAGEN AM BEISPIEL SOMATISCHER COLIPHAGEN Begriffsbestimmung: Bakteriophagen, also Viren, die Bakterien als Wirtszelle befallen, sind vor allem dort zu finden, wo auch die betreffende Bakterienart natürlicherweise vorkommt, da die Vermehrung von Phagen an die Wirtszelle und ihren Stoffwechsel gebunden ist. Bakteriophagen sind vor allem in der genetischen Forschung von großer Bedeutung, spielen aber auch in der industriellen Mikrobiologie eine wichtige Rolle, z.b. als Verursacher von Fermentationsstörungen. Da nur wachsende Zellen Phagen vermehren können, ist für ihren Nachweis eine Kultur der entsprechenden Wirtsbakterien in der exponentiellen Wachstumsphase notwendig. Neben dem Nachweis der phagenbedingten Bakterienlyse durch Trübungsmessung können Phagen auch durch die Auszählung der Löcher in einem Bakterienrasen, der sog. Plaques, quantifiziert werden. Letzteres kann mit Hilfe des Oberflächenverfahrens oder des Schichtagarverfahrens (siehe diesen Versuch) erfolgen. Objekte: Wirtsstamm Escherichia coli C (ATCC 13706) Arbeitskultur TABELLE 3.8: PROBENVERTEILUNG FÜR DEN NACHWEIS SOMATISCHER COLIPHAGEN. Gruppe Proben Volumen 1 EL 1 ml 2 ZL-KA 0.1, 0.01 ml 3 AL-KA 1, 0.1 ml 4 BW 1 ml 5 BrW 1 ml 6 RW 1 ml Achtung: Proben als Doppelbestimmung ansetzen! Durchführung: Herstellung einer Inokulumskultur des Wirtsstamms (ist vorbereitet!): 50 ml MSB-Medium werden mit 0,5 ml einer bei 70 C gelagerten und auf Raumtemperatur temperierten E. coli Kultur (aus der exponentiellen Wachstumsphase) inokuliert und bei 37 C inkubiert. Die Kultur kann verarbeitet werden, wenn die Zelldichte ca 10 8 Zellen (OD=0,11) je ml beträgt (Lagerung auf Eis). 28

29 Zu jeweils 50 ml ssmsa-basalmedium, die im Wasserbad gelöst und bei 46 C temperiert wurden, werden 300 µl vorgewärmte CaCl 2 -Lösung steril zugegeben (ist vorbereitet!). Der flüssige Agar wird zu 2,5 ml Aliquots in Röhrchen verteilt und im Wasserbad bei 46 C gelagert (ist vorbereitet!). Pro Ansatz wird die entsprechende Probemenge hinzugefügt (jeweils Doppelbestimmung), Zugabe von 1 ml Inokulumskultur je Ansatz, vorsichtig schwenken, Blasenbildung vermeiden. Der gesamte Ansatz wird auf eine vorbereitete MSA-Agarplatte ausgegossen. Nachdem die Platte ausgekühlt und der Agar erstarrt ist, kann die Platte umgedreht und bei 37 C ca. 20 h inkubiert werden Anschließend Auszählung der Plaques, Auswertung: Auf der Agarplatte mit dem Bakterienrasen wird eine Phagenkolonie als Loch (Plaque) sichtbar. Es sind die Plaques auszuzählen und die Plaque bildenden Einheiten (pfu plaque forming unit) je ml Originalprobe anzugeben. 3.9 DIE BESTIMMUNG DES BIOLOGISCHEN SAUERSTOFFBEDARFES (BSB) Begriffsbestimmung: Der Biologische Sauerstoffbedarf ist ein Summenparameter für die Konzentration an biologisch abbaubaren organischen Stoffen in Wässern. Er gibt die Menge an Sauerstoff an, die von den Mikroorganismen innerhalb eines bestimmten Zeitraumes verbraucht wird, um die organischen Stoffe im Abwasser abzubauen. Üblich ist die Angabe des BSB nach 5 Tagen. Dieser BSB 5 stellt sicher, dass die Bakterien ausreichend Zeit hatten, sich so weit zu entwickeln, dass die Hauptmenge der organischen Stoffe abgebaut ist, eine wesentliche Nitrifikation aber noch nicht eingesetzt hat (Sauerstoffverbrauch durch Nitrifikation 3,5 mg je mg NH 4 + ). Durch die Zugabe von Allylthioharnstoff (ATH) kann eine Nitrifikation unterbunden werden. Ansatz: Der biochemische Sauerstoffbedarf ist entsprechend der nachfolgenden Probentabelle anzusetzen und zu bestimmen. Es erfolgt jeweils ein Ansatz mit und ein Ansatz ohne Zugabe von ATH. TABELLE 3.9: PROBENVERTEILUNG FÜR DIE BESTIMMUNG DES BSB. Gruppe Probe ATH- Zugabe Ansatzmenge Faktor Quecksilber Manometer Faktor elektr. Sensoren 1 ZL-KA Kaditz Nein 157 ml 1, AL-KA Kaditz Nein 428 ml 0,1 1 3 ZL-KA Kaditz Ja 157 ml 1, AL-KA Kaditz Ja 428 ml 0,1 1 5 EL Nein 428 ml 0,1 1 6 EL Ja 428 ml 0,1 1 29