Einfluss von Interferon-β auf Oligodendrozyten: In vitro und in vivo Untersuchungen

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1 Aus der Klink für Kleine Haustiere der tierärztlichen Hochschule Hannover und der Neurologischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover Einfluss von Interferon-β auf Oligodendrozyten: In vitro und in vivo Untersuchungen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr.med.vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Sandra Heine aus Braunschweig Hannover 2006

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof`in Dr. A. Tipold PD Dr. M. Stangel 1.Gutachterin: Prof`in A. Tipold 2.Gutachter: Prof. Dr. G. Bicker Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinen lieben Eltern

4 Teile der vorgelegten Dissertation wurden bereits in folgendem Paper veröffentlicht: HEINE S., J. EEBNET, S. MAYSAMI, M. STANGEL (2006): Effects of interferon-beta on oligodendroglial cells. Journal of Neuroimmunology 177:

5 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG LITERATURÜBERSICHT Krankheitsverlauf und klinische Symptome der Multiplen Sklerose Pathologische Merkmale der Multiplen Sklerose Das Heterogenitätskonzept zur Läsionsentstehung Bestandteile der Myelinscheide Oligodendrozyten Oligodendrozyten Myelinisierung des Zentralen Nervensystems Morphologische Veränderungen während der Reifung der Oligodendrozyten Myelinisierung der Axone Warum findet in der Multiplen Sklerose keine vollständige Remyelinisierung statt? Interferone Immunmodulatorische Effekte von Interferon-β Interferon-ß in der Therapie der Multiplen Sklerose Das Cuprizonemodell- ein toxisches Tiermodell für die Multiple Slerose MATERIAL UND METHODEN Geräte und Materialien Geräte, Laborbedarf Zentrifugen: Mikroskope: Reagenzien und Laborbedarf für die in vitro Untersuchungen: Antikörper für die in vitro Färbungen Verwendete Kulturmedien und Lösungen Verwendete Tiere Materialien und Reagenzien für die in vivo Untersuchungen Lösungen für die Eponeinbettung Lösungen für die Luxol Fast Blue-Färbung Übersicht über die verwendeten Antikörper für die Immunhistochemie Computer-Software In vitro Untersuchungen Präparation der Pimärzellkulturen... 37

6 3.3.2 Gewinnung der gemischten Gliazellkultur Kultivierung der gemischten Gliazellkultur Aufreinigung von Oligodendrozytenvorläuferzellen Kultivierung der gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen In vitro-versuche Poliferationsassay Differenzierungsassay Differenzierungsassay an gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen Statistische Auswertung der in vitro Daten In vivo Untersuchungen Gehirnentwicklung bei C57Bl/6-Mäusen und Interferon-β-k.o.-Mäusen Durchgeführte Färbungen zur Gehirnentwicklung an Paraffinschnitten Auswertung der Ergebnisse der vergleichenden Gehirnentwicklung Interferon-β k.o.-mäuse im Cuprizonemodell Durchgeführte Färbungen Allgemeine Durchführungen für die vergleichende Gehirnentwicklung und das Tiermodell Einbettung in Paraffin Einbettung in Epon Luxol Fast Blue Grundsätzlicher Färbevorgang immunhistologischer Färbungen: Auswertung der Daten in vivo Auswertung der Gewichtsverläufe Myelinbeurteilung Auswertung der elektronenmikroskopischen Bilder Auszählung der Oligodendrozytenvorläuferzellen (NG2) Auszählung der Astrozyten (GFAP) Auszählung der Mikroglia (MAC-3) Statistik für die NG2-, GFAP- und MAC-3 Färbung ERGEBNISSE In vitro Ergebnisse IFN-β hat keinen Effekt auf die Proliferation von OPCs in gemischten Gliakulturen IFN-β hemmt die Differenzierung von OPCs in gemischten Gliazellkulturen IFN-β zeigte keinen direkten Effekt auf die Differenzierung von gereinigten OPCs In vivo Ergebnisse Vergleichende Untersuchungen zur Gehirnentwicklung bei C57Bl/6-Mäusen und IFNβ-k.o.- Mäusen Untersuchung der Myelinbildung Entwicklung der Astrozyten Untersuchung der Oligodendrozytenvorläuferzellen... 58

7 4.3 Ergebnisse von IFN-β-k.o.-Tieren im Cuprizonemodell Gewichtsverläufe Unterschiede im Habitus und Verhalten zwischen Kontrollen und IFN-β-k.o.-Mäusen Ergebnisse der Demyelinisierung und Remyelinisierung bei IFNβ-k.o.-Mäuse und Kontrolltieren Elektronenmikroskopische Ergebnisse Auftreten von Mikroglia und Makrophagen Astrozyten Auftreten von Oligodendrozytenvorläuferzellen Axonaler Schaden DISKUSSION Diskussion der in vitro Ergebnisse Diskussion der Ergebnisse der Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen Diskussion der Ergebnisse der Differenzierung der Oligodendrozytenvorläuferzellen Diskussion der in vivo Ergebnisse Das Cuprizonemodell Oligodendrozytenrekrutierung Mikroglia- und Makrophagendetektion Astrozytenexpression Axonale Schädigung Schlußfolgerungen ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNG...116

8 Abkürzungen und Termini technici Abb. AK aqua dest. A2B5 BRDU BSA bzw. Abbildung Antikörper aqua destillata Hybridomüberstand des A2B5 clons, Marker für OPCs 5-Bromo-2` Deoxyuridine bovines Sesumalbumin beziehungsweise C Grad Celsius CG4-Medium CIS cm CNPase CO 2 Cuprizone d.h. DNAase DNS EAE engl. exkl. Fa. FCS FGF Medium, welches die Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen fördert clinically isolated syndrome (klinisch isoliertes Syndrom) Zentimeter 2`,3`-cyclic nucleotide3`-phosphodieesterase Kohlendioxid Biscyclohexanone oxaldihydrazone das heißt Deoxyribonuklease Desoxyribonukleinsäure experimentelle allergische Enzephalomyelitis englisch exklusive, ausschließlich Firma fetal calf serum (fötales Kälberserum) Fibroblastenwachstumsfactor

9 g GA GalC GFAP ggr./mgr./hgr. GM GPDH h H 2 O 2 HBSS IFN-β IFN-γ IgG IL l Lat. LFB m MAC-3 m Ak MAG MAO MGP MOG mg Gramm Glatiramer Acetat Galactosylceramid, Marker für reife Oligodendrozyten Glial fibrillary acidic protein, saures Gliafaserprotein geringgradig/mittelgradig/hochgradig Gliamedium, Kontrollmedium für alle in vitro Versuche an gemischten Gliakulturen Glycerol Phosphat Dehydrogenase Stunde (engl.: hour) Wasserstoffperoxyd Hanks Balanced Salt Solution Interferon-beta Interferon-gamma Immunglobulin G Interleukin Liter lateinisch Luxol Fast Blue (Myelinfärbung) milli Microglia-/Makrophagenmarker monoklonaler Antikörper Myelinassoziiertes Glycoprotein Monoaminooxidase Gemischte Gliazellkutur Myelin Oligodendrozyten Glycoprotein Milligramm

10 Min. ml mmol MMP mrna MS N2B3- Medium NG2 Minute/n Milliliter Molarität, milli mol/l Metalloproteinase messenger ribonucleic acid Multiple Slerose Kontrollmedium für die gereinigten Vorläuferzellkulturen Chondroitin sulfat Proteoglykan NG2 nm Nanometer (=10-9 m) NO Nr. O 2 O 4 OPC PBMCs PBS PDGF PDGFαR Pellet ph PLP RR-MS RNS rpm RT Stickstoffmonoxid Nummer Osmiumtetroxid oligodendrocyte preacursor cell (Oligodndrozytenvorläuferzelle) Peripheral blood mononuclear cells (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes = Monozyten, Lymphozyten) phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) Platelet-derived growth factor Platelet-derived growth factor alpha receptor durch Zentrifugation gewonnener Bodensatz Potentia Hydrogenii (Stärke des Wasserstoffes) Proteolipidprotein relapsing remitting MS (schubförmig verlaufende MS) Ribonukleinsäure Revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur s. siehe

11 Sp. SPF SP-MS SVZ T 3 T 4 Tab. T H 1 T H 2 TNF-α Spezies spezifisch pathogen frei secondary progressive MS (Secundär progressiv verlaufende MS) Subventrikuläre Zone (Bereich unterhalb des Ventrikels) 3,3`,5-Triiodo-L-thyroninesodiumsaiz Thyroxine Tabelle inflammatorische T-Zellen T-Helferzellen Tumornekosisfaktor-α u. und u.a. verw. vgl. VCAM Well z.b. ZNS z.t. unter anderem verwendet/e vergleiche vascular cell adhesion molecule (Adhäsionsmoleküle der Blutzellen) Vertiefung der Miktotiterplatte zum Beispiel Zentrales Nervensystem zum Teil µ mikro (x10-6 ) µl Mikroliter

12

13 Einleitung 13 1 Einleitung Die Multiple Sklerose (MS) ist neben der Epilepsie die häufigste neurologische Erkrankung. Obwohl eine Menge Investitionen in die Erforschung der Ätiologie und Therapie dieser Erkrankung getätigt wurden, ist ihre Ursache bisher nicht geklärt und die Behandlung nur teilweise erfolgreich. Weltweit sind ca. 1,2 Millionen Menschen betroffen, in Deutschland geht man von über Erkrankten aus, wobei ca. zweimal mehr Frauen als Männer erkranken (Noseworthy et al. 2000). Es besteht ein lebenslanges Risiko von 1 zu 400 an Multipler Sklerose zu erkranken (Compston und Coles, 2002). Die Entstehung der Erkrankung wird als multifaktoriell angenommen, wobei insbesondere genetische, infektiöse und Umweltfaktoren diskutiert werden. Ohne spezifische Immuntherapie führt die MS bereits nach wenigen Jahren zu signifikanten Behinderungen (Gold und Rieckmann, 2000). Ca. 25% der Patienten können ein normales Leben führen ohne große Einschränkungen im alltäglichen Geschehen eingehen zu müssen, während bis zu 15% der Patienten in kurzer Zeit schwerste Behinderungen aufweisen. Typischerweise treten Entmarkungsherde in der weißen Substanz des Zentralnervensystems auf, in vielen dieser Läsionen sind neben der Demyelinisierung auch axonale Schädigungen nachweisbar (Trapp 1999). Das Auftreten der klinischen Behinderung korreliert mit dem Ausmaß des axonalen Schadens (Bjartmar et al, 2000; De Stefano, 1998). Arbeiten an Biopsie- und Autopsiematerial beschreiben eine profunde Heterogenität von MS Läsionen bezüglich der Zusammensetzung der infiltrierenden Zellen, dem Ausmaß und Auftreten von Oligodendrozytenschädigung sowie der Inzidenz von Remyelinisierung. Bei der MS können vier verschiedene Subtypen unterschieden werden (Trebst C. et al., 2006; Luchinetti et al., 2000). Remyelinisierungsvorgänge sind überwiegend in den beiden Subtypen I und II beobachtet worden, die als primär entzündlich/ autoimmun vermittelt angesehen werden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von 1993 belegen Remyelinisierungsvorgänge in Läsionen (Prineas et al., 1993; Ralne und Wu, 1993), doch das neu gebildete Myelin ist wesentlich dünner und weißt kürzere internodale Abstände auf (Blakemore, 1973). In den anderen beiden Untergruppen, die wahrscheinlich primär durch Oligodendrozytenschädigungen entstehen, wird dagegen nur wenig Remyelinisierung beobachtet. Der Erfolg der Remyelinisierung hängt unter anderem von der Rekrutierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen sowie deren Differenzierung ab. Sowohl Oligodendrozyten als auch deren Vorläuferzellen wurden in demyelinisierten Läsionen

14 Einleitung 14 gefunden (Chang et al., 2002, Brück et al., 1994). Warum diese Remyelinisierungsvorgänge jedoch in der MS nur unvollständig ablaufen ist bisher unklar. Aufgrund der Vielgestaltigkeit dieser neurologischen Erkrankung ergeben sich ebenso heterogene therapeutische Maßnahmen, die zum einen aus symptomatischen Behandlungen akuter Verschlechterungen und zum anderen aus präventiven (immunsuppresiven oder immunmodulierenden) Therapien bestehen. IFN-ß wird seit über 10 Jahren aufgrund seiner immunmodulierenden Wirkung vor allem bei der schubförmig verlaufenden Form der MS therapeutisch eingesetzt. Auf welchen Mechanismen die Wirkung des IFN-ß beruht, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Vor allem über die Wirkung von IFN-ß auf die myelinbildenden Zellen des ZNS, die Oligodendrozyten, ist bisher noch wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung der Wirkung von IFN-ß auf die Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs) in vitro, mit dem Ziel neue bzw. zusätzliche Rückschlüsse auf die Zusammenhänge der Wirkung dieses Zytokins bei der Remyelinisierung zu erhalten. Hierzu wurden Untersuchungen sowohl an gemischten Gliakulturen als auch an gereinigten OPC-Kulturen (nur Differenzierung) vorgenommen, die Informationen zu der Frage liefern sollten, ob ein direkter oder indirekter, durch andere Gliazellen vermittelter Einfluss des IFN-ß auf die OPCs vorliegt. Zum anderen wurden IFN-ß-k.o.-Mäuse in einem toxischen Tiermodell für die MS, dem Cuprizonemodell, mit genetisch unveränderten Mäusen verglichen. Hieraus sollten zusätzliche Erkenntnisse über die Wirkung von IFN-ß bei der Remyelinisierung im lebenden Organismus resultieren und zum weiteren Verständnis der Pathogenese und der Verbesserung der Therapie der MS beitragen.

15 Literaturübersicht 15 2 Literaturübersicht 2.1 Krankheitsverlauf und klinische Symptome der Multiplen Sklerose Der Krankheitsverlauf der MS ist sehr variabel und für die einzelne Person nur schwer vorhersagbar. Grundsätzlich unterscheidet man einen schubförmigen von einem chronischprogredienten Verlauf, wobei auch Mischformen existieren. Als Schub definiert man nach Ausschluss physiologischer Schwankungen akute, ohne assoziierte Infekte oder Fieber auftretende neurologische Ausfälle bzw. Verschlechterungen, die mindestens 24 Stunden lang anhalten. Häufungen neuer Symptome innerhalb von 4 Wochen werden noch zum selben Schub gerechnet. Nach der Verschlechterung kann es zur kompletten Rückbildung der Symptome kommen oder nur eine Teilremission eintreten. Der chronisch-progrediente Verlauf zeichnet sich durch unterschiedlich rasch zunehmende Verschlechterungen der neurologischen Befunde ohne Remission aus. Aus einer primär schubförmigen Form kann sich zum Beispiel auch im Anschluss eine chronisch-progrediente Form entwickeln, was bei 30-50% der initial schubförmig verlaufenden Erkrankungsformen in einem Zeitraum von 10 Jahren der Fall ist (Gold und Rieckmann, 2000). Welche immunologischen Mechanismen den Verlaufsänderungen der Multiplen Sklerose zugrunde liegen ist bisher nur teilweise geklärt. Die Initialsymptome der MS, wie zum Beispiel Sehstörungen, Lähmungen, Ataxie, Paresen, und Parästhesien, sind grundsätzlich unspezifisch und können auch bei anderen Erkrankungen in Erscheinung treten (Poser et al., 1979). Im Verlauf der Erkrankung können alle neurologischen Systeme betroffen sein, wobei die oben genannten Symptome dominieren (Noseworthy et al., 2000). Häufig kommt es zur vollständigen Rückbildung dieser Symptome. Persistieren die Behinderungen noch nach dem Ablauf von 3 Monaten nach dem letzten Schub, haben diese insgesamt nur noch eine geringe Rückbildungstendenz. Nach 6 Monaten geht man in 95% der Fälle von einem permanenten Defizit aus (Gold und Rieckmann, 2000). 2.2 Pathologische Merkmale der Multiplen Sklerose Hauptmerkmal der MS ist neben den axonalen Schädigungen das Auftreten von Entmarkungsherden im Zentralnervensystem (ZNS). Diese Plaques treten typischerweise periventrikulär auf, aber auch radial nach außen angeordnet, dem Verlauf der Blutgefäße folgend. Bevorzugte Lokalisationen finden sich im N. opticus, in der periventrikulären weißen Substanz, im Corpus callosum, Kleinhirn und Rückenmark (Stangel und Lassmann

16 Literaturübersicht , Noseworthy et al. 2000). Neben diesen typischen Entmarkungsherden kommen bei vielen Patienten auch kleine, kortikale Läsionen vor, die allerdings kernspintomographisch oft nicht gesehen werden. Durch diese Demyelinisierungsherde kann es zur Schrumpfung betroffener Regionen kommen, so dass man bei chronischen Verläufen schwere atrophische Veränderungen finden kann. Der Durchmesser der Läsionen ist mit 1mm bis zu mehreren cm sehr variabel. Finden sich viele Läsionen im selben Bereich, so können diese auch konfluent sein. Man kann die Läsionen auf Grund immunzytochemischer Analysen von Makrophagenpopulationen und der Phagozytose von Myelinprodukten durch Makrophagen in 3 verschiedene Klassen einteilen: Frühaktive- spätaktive- und inaktive demyelinisierende Läsionen. Als frühaktive Läsionen bezeichnet man solche, die sämtliche Hauptbestandteile des Myelins beinhalten. In späten aktiven Läsionen ist der Myelinabbau bereits fortgeschritten, man kann die Myelinproteine Myelin Oligodendrozyten Glycoprotein (MOG) und 2`, 3`-cyclic nucleotide 3`-phosphodieesterase (CNPase) in Makrophagen nicht nachweisen. Histopathologisch fällt bei der MS auf, dass es zum Auftreten von perivaskulären Rundzellinfiltraten kommt. In den Läsionen findet man aktivierte Makrophagen und Mikroglia, so wie Demyelinisierung mit verschiedenen Stadien der Remyelinisierung. Der axonale Schaden tritt sowohl während der aktiven Demyelinisierung als auch in inaktiven Läsionen auf, sein Ausmaß variiert jedoch interindividuell sehr stark (Kornek et al., 2000). Kuhlmann et al. beschrieben 2002, dass der akute axonale Schaden mit der Entzündungsreaktion korreliert, zu Beginn der Erkrankung am ausgeprägtesten ist und in remyelinisierten Plaques kaum zu finden ist (Kuhlmann et al., 2002). Des weiteren kommt es zur Gliose mit Proliferation von Astrozytenfortsätzen, deren Funktion in der Pathogenese der MS noch unklar ist. So besteht zum einen die Diskussion, dass die Gliose ein Hindernis für regenerative Vorgänge darstellen kann (Rosen, 1989) zum anderen werden von den Astrozyten eine Reihe von Wachstumsfaktoren produziert, die für die Regeneration und den Erhalt der Axone und der Myelinscheiden notwendig sein können (Rider, 1997). 2.3 Das Heterogenitätskonzept zur Läsionsentstehung Der Pathomechanismus zur Entstehung der MS-Läsionen ist bisher weitestgehend ungeklärt. Aufgrund von Studien an mehr als 200 MS-Fällen der Arbeitsgruppen Lucinetti, Brück und Lassmann der letzten Jahre entstand das Konzept der interindividuellen Heterogenität (Trebst et al., 2006; Lucinetti et al., 2000). Dieses Konzept besagt, dass bei bestehender intraindividueller Läsionshomogenität eine Heterogenität der Patienten

17 Literaturübersicht 17 nachweisbar ist. Hierbei werden vier MS-Subtypen aufgrund ihrer individuellen Ausprägung der entzündlichen Komponenten, der Oligodendrozytenschädigung und der Histopathologie unterschieden. Die Typen I und II weisen eine ausgeprägte entzündliche Komponente mit Infiltration der Läsionen mit T-Zellen und Monozyten/Makrophagen auf. Zusätzlich sind im Typ II Komplementfaktoren und Immunglobuline vorhanden. Bei den Typen III und IV treten typischerweise Störungen der Oligodendrozyten auf. So weist der Typ III Zeichen der Oligodendrozytenapoptose auf und einen bevorzugten Verlust des myelinassoziierten Glykoproteins (MAG). Entsprechend der Heterogenität der Typen im histopathologischen Bild geht man auch von unterschiedlichen pathogenetischen Mechanismen der Läsionsentstehung aus. Dementsprechend basieren die Typen I und II auf primär (autoimmun) entzündlich vermittelten Demyelinisierungen und die Typen III und IV auf primären Schädigungen der Oligodendrozyten. Wie es allerdings zum initialen Ereignis der Schubauslösung kommt, bleibt dabei unklar. Als Ursache für die Oligodendrozytenapoptose werden unterschiedliche Mechanismen, wie z.b: Stickstoffmonoxid (NO), Sauerstoffradikale, bestimmte Zytokine wie Tumornekrosisfaktor- α (TNF-α), mitochondriale Schädigungen, glutamaterge Schädigung oder auch endogene humane Retroviren diskutiert (Merrill und Scolding, 1999). 2.4 Bestandteile der Myelinscheide Die weiße Substanz des Zentralnervensystems besteht zu % aus Myelin, dessen Trockengewicht sich aus 70% Lipiden und 30% Proteinen zusammensetzt, welche durch die Oligodendrozyten gebildet werden (Baumann und Pham-Dinh 2001). Mit ca. 50% des Proteingehaltes stellen das Proteolipidprotein (PLP) zusammen mit dem basischen Myelinprotein (MBP), welches einen Anteil von 10-20% ausmacht, die Hauptkomponenten des Myelins dar. Das PLP ist ein transmembranes Protein, welches in zwei Isoformen (30 kd und 26 kd) vorkommt. Aus Tiermodellen ist bekannt, dass es eine entscheidende Funktion für die Integrität der Myelinscheide erfüllt, es bildet die sogenannte major dense line des Myelins, welche eine Rolle bei der Kompaktierung des Myelins spielt. Daneben gibt es Myelinproteine die einen wesentlich geringerem Anteil am Gesamtmyelin darstellen. Hierzu zählen das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG), mit einem Anteil von ca. 1%, sowie das Myelin- Oligodendrozyten- Glykoprotein (MOG) mit ca. 0,1% Anteil. Trotz ihres geringen Anteil am Gesamtmyelin besitzen diese Proteine eine hohe immunogene Wirkung. Entsprechend zeigt eine durch MOG ausgelöste EAE in einigen Tierstämmen einen ähnlich rezidivierenden Verlauf, wie die MS. Zusätzlich ist

18 Literaturübersicht 18 MOG in seiner extrazellulären Lokalisation exponiert und für Antikörper leicht zugänglich (Kennel De Marczh et al., 2003, Iglesias A. et al., 2001). 2.5 Oligodendrozyten Der Oligodendrozyt hat als myelinbildende Zelle des ZNS eine besondere Rolle in der Pathogenese demyelinisierender Erkrankungen entdeckte der Berliner Pathologe Rudolf Virchow, dass es außer Neuronen noch andere Zellen im ZNS gibt, von denen er glaubte, dass sie das Gewebe zusammenhalten, woraufhin er sie kurzerhand als Nervenkitt, Neuroglia, bezeichnete. Aufgrund von Metallimprägnationsfärbungen konnte die Neuroglia in Astrozyten (Ramon und Cajal, 1913), Oligodendrozyten und Mikroglia (Rio Hortega, 1921) unterschieden werden. Die Bezeichnung Oligodendroglia wurde 1921 von Rio Hortega eingeführt, der diese Zellen der Makroglia als neurogliale Zellen mit wenigen Fortsätzen beschrieb (Hortega, 1921). Hauptsächlich sind die Oligodendrozyten myelinbildende Zellen, es gibt aber auch Oligodendrozyten, die keine direkte Verbindung zu Myelinscheiden aufweisen und als Satellitenzellen bezeichnet werden. Diese Zellen tragen zur Regulation des Mikrostoffwechsels in der Umgebung der Neurone bei (Ludwin, 1997). 2.6 Oligodendrozyten Myelinisierung des Zentralen Nervensystems Wie die Astrozyten sind die Oligodendrozyten neuroektodermalen Ursprungs (Levison und Goldman, 1993; Cameron, Curry und Le Douarin, 1995) und entwickeln sich im Zentralnervensystem von Säugetieren aus proliferierenden neuroepithelialen Zellen der ventrikulären und subventrikulären Zonen (SVZ) (Miller, 1996; Doetsch, 1997). Nicht unerwähnt bleiben soll, dass im ausgewachsenen ZNS auch der Hippocampus (Johe et al., 1996, Palmer et al., 1997) und das Rückenmark (Weiss et al., 1996) multipotentielle Zellen beinhalten, die in vitro fähig sind, Oligodendrozyten, Astrozyten und auch Neurone zu generieren. Im Gehirn findet die Myelinisierung in kaudorostraler Richtung statt und im Rückenmark rostrokaudal. Für jede Spezies folgt die Myelinisierung einem genauen reproduzierbaren Ablauf. Im Zentralnervensystem von Nagern konnten bereits in den letzten 3-4 Tagen des Embryonalstadiums Chondroitin sulfat Proteoglykan NG2 (NG2) -positive OPCs detektiert werden (Levine et al., 1993). Innerhalb der ersten 10 Tage des postnatalen Lebens kommt es zu einem starken Anstieg dieser Zellen, die durch Migration die entstehende weiße und

19 Literaturübersicht 19 graue Substanz besiedeln und sich letztendlich zu myelinformenden Oligodendrozyten differenzieren. So sind bei Mäusen Tage nach der Geburt fast alle Bereiche des Gehirns myelinisiert. Bei der Ratte kann der Höhepunkt der Myelinisierung ziemlich genau auf den Tag 18 nach der Geburt bestimmt werden, beim Menschen tritt er während des ersten Lebensjahres auf, der Myelinisierungsprozess beginnt jedoch schon in der zweiten Hälfte der Embryonalentwicklung im Rückenmark (Baumann und Pham-Dingh, 2001). 2.7 Morphologische Veränderungen während der Reifung der Oligodendrozyten In den verschiedenen Entwicklungsstadien von der Vorläuferzelle bis hin zum reifen myelinisierenden Oligodendrozyten weisen die Zellen Unterschiede in ihrer Morphologie, mit entsprechend wechselnden Oberflächenmarkern auf, außerdem ändern sich ihre Fähigkeiten im Bezug auf Migration, Proliferation und Myelinbildung. Die bipolaren Oligodendrozytenvorläuferzellen sind in der Lage von ihrem Entstehungsort, der SVZ weite Strecken zu migrieren, um das entstehende Gehirn zu besiedeln (Small et al., 1987), wie aus Entwicklungsstudien (Frost, 1996, Levison und Goldman, 1993) und Transplantationsstudien hervorgeht (Espinosa de los Monteros, 1993; Lachapelle et al., 1983). In vitro Studien belegen, dass diese Progenitorzellen, abhängig von verschiedenen Wachstumsfaktoren wie z.b. dem Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) und dem Plateletderived growth factor (PDGF) (Gard, Pfeiffer, 1993; Hardy, Reynolds, 1993; Milner et al., 1997; Raff et al., 1988; Ridchardson et al., 1988) proliferieren. Unreife Vorläuferzellen weisen unter anderem A2B5-Antigene auf der Zelloberfläche auf. Zusätzlich zu diesem Marker treten der platlet-derived growth factor alpha receptor (PDGFαR) und das Chondroitin Sulfat Proteoglycan NG2 (NG2) in dieser Entwicklungsphase der Vorläuferzelle in Erscheinung. Am Bestimmungsort angelangt wandeln sie sich zu Präoligodendrozyten mit mehreren Fortsätzen um, die noch zur Zellteilung fähig sind, deren Migrationsfähigkeit jedoch verringert (Orentas und Miller, 1996) bzw. verloren gegangen ist (Pfeiffer et al., 1993). Diese Zellen weisen den Marker O4 auf (Sommer und Schachner, 1981). Die Entwicklung zum unreifen Oligodendrozyten ist durch das Auftreten des Markers GalC und den Verlust des A2B5-Antigens auf der Zelloberfläche gekennzeichnet. Das erste myelinspezifische Protein, welches der entstehende Oligodendrozyt besitzt ist das CNP (Reynolds, Wilking, 1988; Richardson et al., 1980; Sprinkle, 1989; Vogel, Thomson, 1988) gefolgt von anderen Markern, wie dem MBP (Butt et al., 1995). Das Auftreten der myelinspezifischen Proteine MBP, MAG und PLP während der Differenzierung tritt sequentiell sowohl in vivo als auch in vitro auf (Dubois-Dalcq et

20 Literaturübersicht 20 al., 1986; Hardy, Reynolds, 1993; Monge et al. 1986; Pfeiffer et al. 1993) und kennzeichnet das Stadium des reifen Oligodendrozyten. Das Auftreten des Markers MOG findet eher zu späteren Zeitpunkten der Reifung statt (Solly et al., 1996) und zeigt deren volle Ausdifferenzierung zu myelinbildenden Zellen an. Migration Proliferation Myelinisierung Pro- Oligodendrozyt Prä-oligodendrozyt Progenitor Unreifer Oligodendrozyt Reifer Oligodendrozyt Olig2 A2B5 O4 O1 O1 MBP PDGFα-R PDGFα-R GD3 NG2 O4 GalC O4 GalC PLP MAG Marker CNP CNP MOG Abb.1 Entwicklungsstadien von der Vorläuferzelle zum reifen myelinisierenden Oligodendrozyten mit ihren entsprechenden Markern (Modifiziert nach Stangel und Hartung, 2002) 2.8 Myelinisierung der Axone Die Bildung und Anordnung von Myelin im ZNS erfordert viele verschiedene Signale die präzise die Wechselwirkung zwischen Axonen und Oligodendrozyten steuern. Hierbei wird die Menge der reifen myelinisierenden Oligodendrozyten festgelegt durch die Anzahl der proliferierenden Vorläuferzellen und dem Stattfinden des programmierten Zelltods. Die Vorläuferzelle verliert bei Beendigung der Proliferationsphase und Beginn der Differenzierung die Sensitivität für das überlebenswichtige Signal PDGF. Somit bleiben ihr nur 2-3 Tage Zeit, um in Interaktion mit einem nicht myelinisierten axonalen Segment zu gelangen, welches neue überlebenswichtige Signale liefert (Bozalli, 2004). Zellen die diesen axonalen Kontakt eingehen, überleben und beginnen mit der Myelinisierung (Trapp et al., 1997). Ein reifer Oligodendrozyt synthetisiert und unterhält die Myelinscheiden von bis zu 40 benachbarten Axonen im ZNS (Compston und Coles, 2002).

21 Literaturübersicht Warum findet in der Multiplen Sklerose keine vollständige Remyelinisierung statt? Demyelinisierte MS Läsionen zeigen zumindest teilweise eine spontane Remyelinisierung (Prineas et al.,1993; Ralne et al., 1993), unklar ist jedoch warum diese nicht vollständig ist und nicht alle Läsionen betrifft. Im Vergleich zu physiologisch gebildetem Myelin ist das neugebildete Myelin dünner und weist kürzere internodale Abstände auf (Blakemore WF, 1973). Bei der Remyelinisierung geht man davon aus, dass sich die Vorgänge der physiologischen Myelinisierung wiederholen d.h. es wandern OPCs in die Läsionen ein, proliferieren und differenzieren sich zu reifen myelinbildenden Oligodendrozyten (Stangel und Hartung, 2002; Franklin, 2002). Zu der Frage warum in der MS die entstandenen Läsionen jedoch nicht vollständig remyelinisieren, existieren verschiedene Hypothesen. Möglich wäre, dass ein Mangel an OPCs vorliegt, der entweder durch die Demyelinisierung bedingt ist oder dass die Zellen bei großen Läsionen nicht weit genug migrieren können (Blakemore und Keirstead, 1999). Zentral in chronischen MS-Läsionen und am Rande der Läsionen konnten NG2-positive Zellen nachgewiesen werden (Scolding et al 1998, Chang et al. 2000, Maeda et al. 2001). Andere Theorien gehen somit davon aus, dass nicht die OPCs der limitierende Faktor sind sondern die Axone für eine Remyelinisierung nicht rezeptiv sind (Chang et al., 2002). Im Gegensatz zur physiologischen Myelinisierung sekretieren infiltrierte Immunzellen eine Vielzahl an Zytokinen, die nicht nur OPCs sondern auch Mikroglia und Astrozyten beeinflussen (Lock et al., 2002; Baranzini et al., 2000). Auch eine verminderte Expression von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie z.b. dem Neuregulin, welches von Astrozyten gebildet wird und in MS-Läsionen verringert ist, könnte zu einer inkompletten Remyelinisierung führen (Viehover et al., 2001). Wahrscheinlich ist allerdings, dass es auch auf diese Frage entsprechend der Heterogenität der Läsionen keine einheitliche Ursache gibt Interferone Interferone (IFN) werden aufgrund unterschiedlicher Stimuli von Zellen produziert. Sie gehören zu den Zytokinen und werden in zwei Gruppen, die Typ-I-IFN und die Typ-II- IFN, eingeteilt. Zu den Typ-I-IFN gehören das IFN-α und das IFN-β. Diese Typ-I-IFN werden natürlicherweise im Organismus von Fibroblasten, Makrophagen und dendritischen Zellen nach erfolgter viraler Infektion oder als Folge unspezifischer Entzündungsreaktionen produziert. Typ-II-IFN, zu denen das IFN-γ zählt, werden vorwiegend von Immunzellen gebildet. Bei der MS werden therapeutisch die Typ-I- IFN

22 Literaturübersicht 22 genutzt und zwar das IFN-β -1a und das IFN-β-1b. IFN-β-1a wird von Säugetierzellen hergestellt, liegt glykosyliert vor und besitzt eine Aminosäuresequenz, die identisch mit dem natürlich vorkommenden IFN-β ist. Im Gegensatz dazu wird das IFN-β-1b von Bakterien hergestellt, ihm fehlen zwei Aminosäuren so wie die Glykosylierung (Gold und Rieckmann, 2000). In ihrer biologischen Wirkung sind beide IFN jedoch ähnlich Immunmodulatorische Effekte von Interferon-β Die Typ-I-Interferone IFN-α und IFN-β binden an den selben an der Zelloberfläche lokalisierten Typ-I-Rezeptor. Dieser Rezeptor besteht aus zwei Ketten, IFN-αR1 und IFNαR2. Die Interaktion der Liganden an den extrazellulären Teil des Rezeptor löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus, die über Phosphorylierungen von Signalproteinen und Aktivierungen von Transkriptionsfaktoren zur Bindung an bestimmte Gensequenzen und letztendlich zur Proteinbildung führt. Diese genetischen Produkte besitzen antivirale, antiproliferative und immunmodulierende Eigenschaften (Dhib-Jalbut, 2002). Ergebnissen aus Tiermodellen und humanen Studien lassen den Schluss zu, dass IFN-β durch unterschiedliche Mechanismen in der Lage ist, in den Verlauf der MS einzugreifen (Yong V. W. et al., 1998). Einige Funktionen von IFN-β sind bekannt, doch bestehen noch viele Unklarheiten bezüglich der Wirkmechanismen und Zusammenhänge (Billiau et al. 2004, Hartung et al., 2004). IFN-β hemmt z.b. die Migration von Zellen durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB). Ein vermuteter Mechanismus ist die IFN-induzierte verminderte Expression von Adhäsionsmolekülen wie das vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 auf Lymphozyten (Calabresi P.A. et al., 1997). Ein anderer postulierter Wirkmechanismus ist der Einfluss des IFN-β auf die Interleukin (IL)-2 induzierte Sekretion der Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9. Dieses kann zu einer dosisabhängigen, verminderten Migration von PBMCs oder auch T-Zellen in das Zentralnervensystem führen (Leppert et al., 1996; Stuve, 1996). Über die Wirkung von IFN-β auf die T-Zellfunktion ist bekannt, dass es deren Aktivierung und die Produktion des proinflammatorischen Botenstoffes IFN-γ inhibieren kann (Noronha et al., 1993). Zu seinen immunmodulatorischen Eigenschaften gehört des weiteren, die Beeinflussung des Verhältnisses der Th-1- und Th-2-Zytokine. Es ist bekannt, dass IFN-β die

23 Literaturübersicht 23 Interleukin12-Produktion unterdrückt und die Bildung von Interleukin-10 induziert (Karp et al., 2000). Des weiteren vermindert es die Interleukin-2 Sekretion und Expression des Interleukin-2 Rezeptors (Noronha A. et al., 1993). IFN-β besitzt blockierende Effekte gegenüber dem schubauslösenden proinflammatorischen Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) (Giacomini et al.,1988). Unter physiologischen Bedingungen gelangen geringe Mengen von natürlich vorkommendem IFN-β in das ZNS (Ross et al., 2004). Durch das Zusammenbrechen der Bluthirnschranke in MS-Schüben kann es allerdings zu einem erheblichen Anstieg des INF-ß-Titers im ZNS kommen und somit auch einen Einfluss auf Gliazellen ausüben. In Astrozyten kommt es unter dem Einfluss von IFN-β zur Bildung des nerve growth factors (NGF) in vitro (Stweart et al., 1997, Boutros et al., 1997) und dem IL-6 (Okada et al., 2005), welchem neuroprotektive oder anti- inflammatorische Einflüsse zugeschrieben werden (Yamada et al., 1994). Dieser anti-inflammatorische Effekt scheint darauf zu beruhen, dass dieser Botenstoff die Expression von VCAM-1 und die Induktion des IL-1 Rezeptorantagonisten bewirkt und somit als ein negativer Rückkopplungsmechanismus im Entzündungsprozess fungiert (Gadient und Otten, 1997). In Mikroglia kommt es durch den Einfluss von IFN-β zur Expression verschiedener Chemokin- mrna (RANTES, IP-10, MIP-1β, MIP-1α und MCP-1) (Hua LL und Lee, 2000; McManus et al., 2000). Kawanokuchi beschrieb 2004, dass die Wirkung von IFN-β auf Mikroglia eine vermehrte Bildung von NO-, TNF-α- und Interleukin1-beta induzierte, was zu einer Verstärkung der Demyelinisierung beitragen kann (Kawanokuchi et al., 2004). Über die Wirkung von IFN-β auf Oligodendrozyten gibt es bisher nur wenig Informationen. Passaquin et al. (1989) beschrieb eine Hemmung von Hydrocortison induzierter Expression von Glycerol Phosphat Dehydrogenase (GPDH) in Oligodendrozyten. In einer humanen Oligodendrozytenzellinie induzierte IFN-β die vermehrte Ausbildung von Fortsätzen als Zeichen der verstärkten Zellreifung (Mastronardi et al., 2004). Halfpenny und Scolding hingegen beschrieben 2003, dass IFN-β keinen Einfluss auf die Proliferation und Migration von Oligodendrozytenvorläuferzellen der Zelllinie CG4 ausübt. In einem virusinduzierten Tiermodell (Theiler Virus) der MS wurde festgestellt, dass die kurzfristige Therapie mit IFN-β zu einer vermehrten Remyelinisierung

24 Literaturübersicht 24 führte, während der Langzeiteinsatz von IFN-β die Demyelinisierung verstärkte (Njenga et al., 2000) Interferon-ß in der Therapie der Multiplen Sklerose Aufgrund seiner immunmodulatorischen Eigenschaften wird Interferon-β (IFN-β) therapeutisch seit über einer Dekade in der Therapie der schubförmig verlaufenden MS (RR-MS) eingesetzt. Es gehört zusammen mit dem Glatiramer Acetat (GA) zu den beiden meist eingesetzten Substanzen bei der Behandlung der schubförmigen MS (Gold und Rieckmann, 2000, Hartung et al., 2004). Die Behandlung von Patienten mit IFN-β im Vergleich zu unbehandelten Patienten zeigte eine geringere jährliche Schubrate. Welche zellulären und molekularen Mechanismen die schubmindernden Erfolge hervorrufen ist noch nicht vollständig geklärt. Es gibt drei zugelassene Formen des IFN-β bei der Therapie der MS, zum einen Interferon-β-1a-Präparate (Avonex und Rebif ) und zum anderen Interferon-β-1b-Medikamente (Betaferon /Betaseron ) (Noseworthy et al., 2000, Compston und Coles, 2002). Das unter dem Handelsnahmen Betaferon bekannte IFNß1b wurde 1993 erstmalig in den USA und 1995 in Deutschland als Immunmodulator für die Therapie von RR-MS zugelassen. Drei Jahre später erfolgte die erweiterte Zulassung für die Behandlung der SP-MS und seit diesem Jahr auch die Zulassung für die Behandlung des klinisch isolierten Syndroms (clinically isolated syndrome, CIS) bei Risikopatienten Das Cuprizonemodell- ein toxisches Tiermodell für die Multiple Slerose Das Cuprizonemodell gehört zu den toxischen Tiermodellen für die Multiple Sklerose. Der Einsatz von Cuprizone als demyelinisierende Substanz wird seit vielen Jahren untersucht beschrieb Blakemore erstmals dessen Einsatz bei der De- und Remyelinisierung in Mäusen und untersuchte den superioren zerebellären Pedunkel (Blakemore, 1969). Ludwin beschrieb 1978, dass es beim Einsatz des Toxins zur Degeneration der Oligodendrozyten und deren Fortsätzen kommt, gefolgt von Demyelinisierung, wobei die Axone jedoch intakt bleiben (Ludwin, 1978). Durch Zugabe des Kupferchelators Cuprizone zum Futter kommt es zu einer Kupferdefizienz und reproduzierbaren Demyelinisierung im ZNS (Blakemore, 1972; Blakemore, 1973, Kerstenson, 1971, Ludwin, 1978, Pattison, 1971, Suzuki, 1969). Es besteht die Hypothese, dass diese cuprizoneinduzierte Kupferdefizienz

25 Literaturübersicht 25 schädigend auf die Funktion der Mitochondrien wirkt (Venturini, 1973), wodurch es aufgrund einer Störung im Energiehaushalt der Oligodendrozyten letztendlich zur Demyelinisierung im ZNS führt (Cammer, 1999, Fujita, 1990, Komoly, 1987, Morell, 1998). Kupfer ist ein essentielles Element für verschiedene Metalloenzyme (Walshe, 1995) hierzu zählen auch die Kupfer-Zink Superoxid-Dismutase und das Ceruloplasmin (Zlotkin, 1995). Im Gehirn verursacht das Toxin eine Aktivitätsreduktion der mitochondrialen Enzyme Cytochromoxidase und der Monoaminooxidase (MAO) (Venturini, 1973). Warum die Oligodendrozyten bei geringen Mengen Cuprizonegabe bevorzugt empfindlich für eine Kupferdefizienz sind, andere Zellen jedoch nur minimal geschädigt werden, ist nicht bekannt (Blakemore, 1973, Ludwin, 1978, Komoly et al., 1987; Fujita et al., 1990). Es existiert jedoch die Hypothese, dass das Perikaryon dieser Zellen mit seiner sehr großen Menge Myelin entsprechend großen metabolischen Leistungen unterlegen ist und somit anfällig für Störungen wird, wenn dieser Metabolismus nicht unterhalten werden kann (Matsushima, 2001). Bei diesem Tiermodell beginnt die Demyelinisierung zeitlich innerhalb der 2./3. Versuchswoche und ist anatomisch vorhersagbar im Bereich des Corpus callosum sowie der superioren zerebellären Pedunkel (Hiremath, 1998; Morell, 1998; Matsuschima, Morell, 2001). Bei Fütterung von 0,2 % des Toxins erreicht man in der 6. Fütterungswoche eine vollständige Demyelinsierung dieser Bereiche (Matsushima, 2001). Die Remyelinisierungsphase wird durch das Absetzen des Toxins eingeleitet, wobei es auch schon während der Toxingabe zum Einsetzen von Remyelinisierungsvorgängen kommt (Matsushima, 2001). Nicht alle Nagetiere reagieren auf Cuprizonegabe mit Demyelinisierung und die Mausstämme untereinander weisen unterschiedliche Toxinverträglichkeiten auf. Bekannt ist, dass bei Swiss oder ICI Mäuse (Blakemore WF, 1973; Ludwin SK, 1978) und C57BL/6 Mäuse (Matsushima, 2001) die toxische Demyelinisierung induziert werden kann. Änderungen des eingesetzten Mausstammes erfordern eine Neubestimmung der verträglichen Toxinkonzentration (Matsushima, 2001). Über C57BL/6 Mäuse ist bekannt, dass sie nur einer Konzentration von 0,2% Cuprizone tolerieren ohne signifikante Gewichtsverluste oder Lebertoxizität aufzuweisen (Hiremath, 1998). Matsushima und Morell setzten 8-10 Wochen alte Mäuse mit C57Bl/6-Hintergrund bei einer Toxinkonzentration von 0,2% ein, da diese im Gegensatz zu jüngeren Tieren, gleiche Gewichtsveränderungen wie die C57Bl/6 Mäuse aufwiesen und eine besser reproduzierbarere Demyelinisierung, bei minimierten systemischen Effekten wie z.b. der

26 Literaturübersicht 26 Lebertoxizität (Matsushima, 2001) zeigten. Während der Demyelinisierung kommt es zum Auftreten von Mikrogliareaktionen sowie Astrogliose (Blakemore, 1972/73, Ludwin, 1978, Matsushima, 2001, Hiremath, 1998). Eine Aktivierung der mrna von Myelingenen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Mikroglia und Makrohagen wurde von Morell et al. (1998) beschrieben. Der Vorteil dieses Tiermodells besteht u.a. darin, dass es beständig feststellbare, definierte und anatomisch gut reproduzierbare De- und Remyelinisierung erlaubt. Im Gegensatz dazu kommt es bei anderen gut untersuchten Modellen, wie der Experimentellen Allergischen Enzephalomyelitis (EAE) und der viral induzierten Demyelinisierung (Theiler Virus) zu sporadischen zerstreuten Läsionen (Ludwin, 1980). Im Gegensatz zur EAE bleibt die Blut- Hirn-Schranke im Cuprizonemodell primär erhalten (Bakker, 1987). Zwischen dem verwendeten Tiermodell und der Erkrankung MS gibt es verschiedene Bezüge, wie z.b. die Astroglianarbe, Aktivierung von Mikroglia (Hiremath, 1998), die selektive Schädigung der Oligodendrozyten, als auch remyelinisierte Axone die im Randbereich von MS-Plaques z.t. zu finden sind (Ludwin, 1994), die Rückschlüsse auf die Zusammenhänge im Krankheitsverlauf der MS erlauben. Durch den Einsatz von IFN-β-k.o.-Mäusen im Cuprizonemodell wurde in der vorliedenden Arbeit die Wirkung von Interferon-β bei der Remyelinisierung untersucht, um weitere Erkenntnisse über die Pathogenese der MS zu erlangen und zur Verbesserung der Therapie beizutragen.

27 Material und Methoden 27 3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Materialien Geräte, Laborbedarf Einmalpipetten 25 ml (Bestell-Nr ) 10 ml (Bestell-Nr ) 5 ml (Bestell-Nr ) Inkubator Laborumlufttrockenschrank, Function line Fa. Saarstedt, Nümbrecht Fa. Heraeus, Osterode Fa. Heraeus, Osterode Lamin Air HB2472 Fa. Heraeus, Osterode Mikrowelle, Euronet MW4270 Fa. HTS Haustechnik-Service GmbH, Bremen Paraffinschneidegerät RM2245 Pipetten Pipetus akku Edmund Bühler KS-15 control und TH15 (Schüttler) Fa. Leica Microsystems GmbH, Benshein Fa. Gilson, Langenfeld Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Fa. Johanna Otto GmbH, Hechingen Sterilbank Fa. CEAG-Schirp Reinraumtechnik, Dortmund Varioklave 250T Fa. H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim Waagen Wasserbad, 1052 Fa. Satorius, Göttingen Fa. GFL, Burgwedel Wasserbad, 1083 Netz Grit 10x10mm (Bestell-Nr ) Petrischalen (Bestell-Nr ) Gewebekulturschale Cellstar (Bestell-Nr ) Fa. GFL, Burgwedel Fa. Präzisionsoptik Gera, Gera Fa. Nunc, Roskilde, Dänemark Fa. Greiner, Frickenheim

28 Material und Methoden Zentrifugen: Megafuge 2,0R Eppendorf centrifuge 5417R Fa. Heraeus, Osterode Fa. Eppendorf, Hamburg Mikroskope: Te Laval 31 Axiostar, Zeiss Stemi DCR Leica DM LB und Leica Kamera DC300 Fa. Zeiss, Göttingen Fa. Zeiss, Göttingen Fa. Zeiss, Göttingen Fa. Leica Microsystems GmbH, Bensheim Reagenzien und Laborbedarf für die in vitro Untersuchungen: 3,3`,5-Trijodo-L-thyronine sodium salt (Bestell-Nr.T6397) 4-Pregnene-3,20-dione (Bestell-Nr.P8783) Balanced Salt Solution (Hank`s) (Bestell-Nr.H9269) Biotin (Bestell-Nr.B-4639) Boratpuffer 99% (Bestell-Nr.B6768) Bovines Serum Albumin (BSA) (Bestell-Nr. A-7030) Corbit- Balsam (Progesteron) Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Hecht, Sondheim Deckgläser 12 mm (Bestell-Nr. P2312) Deoxyribonuclease (Bestell-Nr. D5025) Fa. Roth, Karlsruhe Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

29 Material und Methoden 29 D-MEM (Bestell-Nr ) Fötales Kälber Serum (Bestell-Nr. S0115) Hepes Buffer (Bestell-Nr. H0887) Interferon-β (Bestell-Nr Lot Nr. 0000) Interferon-γ (Bestell-Nr Lot Nr ) ITS culture supplement (Bestell-Nr Lot. Nr ) Kulturflaschen (Bestell-Nr ) L-Thyroxine (Bestell-Nr. T1775) Methanol (Bestell-Nr.8045) Netz Grit 10x10mm (Bestell-Nr ) Neuroblastom-Zellinie B104 Penicillin-Streptomycin (Bestell-Nr.P 0781) Poly-L-Lysine Hydrobromide (Bestell-Nr. P 1274) Putrescin (1,4-Diaminobutane dihydrochloride) (Bestell-Nr.P5780) SFCA Filter (250ml) (Bestell-Nr ) Fa. Gibco, New York, USA Fa. Biochrom AG, Berlin Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. PBL Biomedical Laboratories, New Jersay, USA Fa. Peprotech Inc., New Jersay, USA Fa. BD Biosience, Bedford, USA Fa. Sarstedt AG & Co., Newton, USA Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim J.T.Baker, Deventer, Niederlande Fa. Präzisionsoptik Gera,Gera Geschenk von PD Dr. Stangel, Hannover Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma, Missouri, USA Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Nalgene NuncInternational, New York, USA

30 Material und Methoden 30 Triethylenediamine (Dabko) (Bestell-Nr.D2522) Trypanblau Lösung (Bestell-Nr.T-6146) Trypsin inhibitor (Bestell-Nr. T-6414) Trypsin (Bestell-Nr.L 2123) Wellplatten (24 ) mit Deckel (Bestell-Nr ) Wellplatten (4 ) Multidish (Bestell-Nr ) Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmBH, Schnelldorf Fa. Sigma, Missouri, USA Fa. Biochrom AG, Berlin Fa. Greiner, Frickenhausen Nunc, Roskilde, Dänemark Antikörper für die in vitro Färbungen A2B5 (A2B5 clon 105) (Bestell-Nr. ATCC CRL-1520) Bromo-2`-Beoxy-uridine (BrdU) (Bestell-Nr ) 5- GalC (Galactosylceramid) (clon IC-07) anti-igg konjugiertes Cy2 (Bestell-Nr , Lot. Nr ) anti-igm konjugiertem Cy3 (Bestell-Nr , Lot. Nr ) Fa. ATCC, Manassas, USA Fa.Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA ECACC, über Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen Jackson Immuno Research, West Grove, USA Jackson Immuno Research, West Grove, USA Verwendete Kulturmedien und Lösungen A) CG4- Medium: 67 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium + Glutamine + Glucose (D-MEM)

31 Material und Methoden ml B104CM (Hybridoma-Überstand der Neuroblastomzellinie B104) 1 ml Penicillin-Streptomycin (PS) 1 ml ITS culture supplement 5 µl Biotin 5 µl Progesteron 50 µl Putrescin B) Gliamedium: 500 ml D-MEM 50 ml hitze-inaktiviertes FCS 5 ml PS C) N2B3- Medium: 100 ml D-MEM 0,5 ml FCS 1ml PS 1ml ITS 10 µl Progesteron 100 µl Putrescin 10 µl Biotin 10 µl 3,3`,5- Trijodo-L-thyronine sodium salt (T3) 10 µl l-thyroxine (T4) D) Trituating Solution: 1% BSA 0,03 mg/ml Dnase 0,5 mg/ml Trypsin inhibitor

32 Material und Methoden 32 E) Serumfreies Medium für die Herstellung von B104 konditioniertem Medium ( B104 CM): DMEM 1% IST 1% Penicillin/ Streptomycin F) Serumhaltiges Kulturmedium für die Herstellung von B104 konditioniertem Medium: DMEM 5% FCS 1% Penicillin/ Streptomycin G) Herstellung von B104-Medium: Für die Herstellung von B 104 konditioniertem Medium (B104 CM) wurden 1,5-2 x 10 6 Zellen der Neuroblastom-Zellinie B104 in Kulturflaschen (75 cm 2 ) für 24 Stunden mit serumhaltigem Kulturmedium inkubiert. Die Kulturen wurden, nach 2x Waschen mit 10 ml PBS, mit serumfreiem Medium für drei Tage kultiviert. Der Überstand wurde abpipettiert, 5 bis 10 Min. bei 1891 g zentrifugiert, steril filtriert (SFCA Filter) und portioniert bei -20 C bis zum Gebrauch tiefgefroren Verwendete Tiere Sprague Dawley Ratten C57Bl/6 Mäuse IFNβ-k.o.-Mäuse CrlT:CD, von Charles River, England importiert, gezüchtet im Tierhaus der MHH Harlan, Niederlanden GBF, Braunschweig, Referenz: Erlandsson et al., 1998 Tierversuchsnummer: 03/671 Charakterisierung von Regulationsfaktoren der De- und Remyelinisierung in genetisch veränderten Tieren

33 Material und Methoden Materialien und Reagenzien für die in vivo Untersuchungen 2-Dodecylsuccinic acid anhydride Fa. Serva, Heidelberg (Bestell-Nr.20755) 2,4,6-Tris(dimethylaminometthyl)phemol (DMP30) (Bestell-Nr ) ABC Kit (Avidin-Biotin-Komplex) Bis(cyclohexanone)oxaldighydrazone (Bestell-Nr.C 9012) DAB Chromogen (Bestell-Nr.S 3000) Epon, Gycid Ether100 Essigsäure 96% Etanol absolut (Bestell-Nr. 624 Eukitt 100ml Fuchsin-sulfit reagent (Bestell-Nr. S5133-1L) Glutaraldehyd H2O2 30% (Bestell-Nr ) Hämalaun (Bestell-Nr ) HCL (1N) (Bestell-Nr ) Liquidblocker (PAP-Pen) Methylnadic anhydride (Bestell-Nr ) Na-Cacodylatpuffer 0,2 M Fa. Serva, Heidelberg Fa. Vektor Laboratories, Burliname USA Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Dako, Glostrup, Dänemark Roth, Karlsruhe Fa. J.T. Baker, Deventer, Niederlande Fa. J.T.Baker, Deventer, Niederlande Fa. Kindler GmbH & Co, Freiburg Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Polysiences Varrington, PA, USA Fa. Merck, Darmstadt Fa. Merck, Darmstadt Fa. Merck, Darmstadt Fa. SCI Sience Services, München Fa. Serva, Heidelberg Fa. Merck, Darmstadt (Dimethylarsensäurenatriumsalz)

34 Material und Methoden 34 Natriumdisulfit Fa. Merck, Darmstadt (Bestell-Nr.Bt 6528) Osmium tetroxide (O2O4) (Bestell-Nr.O5500) Paraformaldehyd (Bestell-Nr.P G) PBS (Bestell-Nr. L182-05) Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Fa. Sigma- Aldrich, Schnelldorf Fa.Biochrom AG, Berlin Perjodpulver Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Propylenoxid (Bestell-Nr ) Solvent Blue 38-Pulver (LFB) (Bestell-Nr. S3382) Triton X-100 (Bestell-Nr ) Xylol Fa. Serva, Heidelberg Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmBH, Taukirchen Fa. Merck, Darmstadt Fa. J.T.Baker, Deventer, Niederlande (Bestell-Nr. 8080) Lösungen für die Eponeinbettung 1.) 1% Osmium: 1g O 2 O 4 wird in 50 ml a.d. über Nacht abgedunkelt gelöst und am nächsten Tag mit 0,1 M PBS verdünnt, um anschließend lichtgeschützt und kühl bis zum Gebrauch gelagert zu werden. 2.) Epon Stammlösung: 291,9 g Epon (Glycid-Ether 100) wird mit 165,8 g Methylnadic anhydride gemischt und 126,6 g 2-Dodecylsuccinic acid anhydrid zugegeben, dieses Gemisch wird ca. 1 Stunde gerührt und danach mit Parafilm verschlossen im Kühlschrank gelagert Lösungen für die Luxol Fast Blue-Färbung 1) Sulfitwasser: Zu 400 ml aqua dest. gibt man 20 ml 1 N HCL und 26 ml 10% wässrige Lösung Natriumdisulfat.

35 Material und Methoden 35 2) 0,5% Perjodsäure: 1g Perjodpulver wird in 200 ml a.d. gelöst. 3) Luxol Fast Blue: 0,5 g Solvent Blue 38-Pulver wird auf einem Magnetrührer in 500 ml 96% Alkohol gelöst und zur Konservierung 10 % Essigsäure zugesetzt Übersicht über die verwendeten Antikörper für die Immunhistochemie Tabelle1: Übersicht über eingesetzte Seren und Antikörper Serum Eingesetzte Konzentration Firma normal goat serum (Bestell-Nr.S-1000) 3% Fa. Vektor Laboratories, Burlingame USA normal rabbit serum 3% Fa. Vektor Laboratories, Burlingame USA normal rat serum (Bestell-Nr.S-5000) 3% Fa. Vektor Laboratories, Burlingame USA gt= goat= Ziege, ms= mouse = Maus, rat= Ratte

36 Material und Methoden 36 Primärer AK Klon Firma Sekundäre biotinylierte AK Konzentration Konzentration Firma PLP (Bestell-Nr. MCA839G plpc1 1:500 Fa. Serotec, Oxford UK gt α ms (Bestell-Nr. BA-9200) 1:500 Vector Laboratories, Burlingame USA MBP (Bestell-Nr. MAB382) :100 Fa. Chemicon, Temecula, USA gt α ms (Bestell-Nr. BA-9200) 1:500 Vector, Laboratories, Burlingame USA MOG Überstand von Hybridom -zellen 1:5 ein Geschenk von C.Linington gt α ms (Bestell-Nr. BA-9200) 1:500 Vector, Laboratories, Burlingame USA Antinonphosphoneurofilament SMI-32 1:1000 Fa. Sternberger monoclonals, Maryland USA gt α ms (Bestell-Nr. BA-9200) 1:500 Vector, Laboratories, Burlingame USA GFAP (Bestell-Nr. MAB360) GA5 1:200 Fa. Chemicon, Temecula, USA gt α ms (Bestell-Nr. BA-9200) 1:200 Vector, Laboratories, Burlingame USA NG2 (Bestell- Nr ) :200 Fa. Upstate, Lake Placid, USA gt α ms (Bestell-Nr. BA-9200) 1:500 Vector, Laboratories, Burlingame USA MAC-3 (Bestell-Nr ) M3/84 1:50 Fa. BD Pharmingen, San Diego, USA gt α rat 1:500 Vector, Laboratories, Burlingame USA 3.2 Computer-Software Microsoft word 2000 Microsoft Exel 2000 Sigma Plot 2001 Sigma Stat, Version 2,0 Adope Photoshop 7,0

37 Material und Methoden In vitro Untersuchungen Ziel der in vitro Untersuchungen bestand darin festzustellen, ob die Stimulation mit IFN-β in verschiedenen Konzentrationen die Proliferation und die Differenzierung von OPCs beeinflußt. Die in vitro Untersuchungen wurden an Primärzellkulturen durchgeführt, die von neugeborenen bis zwei Tage alten Sprague Dawley Ratten (CrlT:CD,von Charles River, England importiert, gezüchtet im Tierhaus der MHH) gewonnen wurden. Nach der Erstellung der Einzelzellsuspension wurden die Zellen unterschiedlich kultiviert, wodurch zum einen gemischte Gliazellkulturen und zum anderen gereinigte Oligodendrozytenvorläuferzellkulturen (OPC-Kulturen) gewonnen wurden. An den gemischten Gliazellkulturen (MGP) wurden Färbungen zum Proliferations- und Differenzierungsverhalten der Zellen durchgeführt. Im Gegensatz zu der reinen OPC- Kultur, entspricht diese Kulturform durch die Cokultivierung von OPCs mit anderen Gliazellen mehr physiologischen Bedingungen. Aufgrund der Ergebnisse der Differenzierung wurden dann im Anschluss entsprechende Untersuchungen an den gereinigten Vorläuferzellkulturen vorgenommen. Hierbei sollte der direkte Einfluss von IFN-β auf die Reifung der OPCs untersucht und indirekte Effekte, induziert durch Mikroglia und Makrophagen, ausgeschlossen werden Präparation der Pimärzellkulturen Die Präparation der Primärkulturen wurde an neugeborenen bis zwei Tage alte Sprague- Dawley Ratten, nach der Beschreibung von McCathy & de Vellis (1980) durchgeführt (McCathy und de Vellis, 1980; Stangel und Bernhard, 2003). Die Ratten wurden durch einen Nackenschnitt getötet und die Gehirne entnommen. In Petrischalen mit Hank`s Balanced Salt Solution (HBSS) und 10 % Hepes Buffer (s ) wurden die Meningen mit Hilfe eines Mikroskops (Zeiss Stemi DCR ) von den Gehirnen abpräpariert. Anschließend wurden die Gehirne zweimal in Hank`s Balanced Salt Solution mit Hepes Buffer gewaschen, bevor sie mit Hilfe einer Rasierklinge zerkleinert wurden. Diese Suspension wurde bei 1891 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Zellpellet in 5 ml 0,1% Trypsin (s ) resuspendiert und bei 37 C für 20 Min. inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 5 ml 0,001% DNase (s ), das Röhrchen wurde mehrmals geschwenkt und im Anschluss erneut bei 1891 g für 5 Min. zentrifugiert. Danach wurde der Überstand verworfen und 1ml trituating solution (S ) zugegeben. Mit unterschiedlich großen Pasteurpipetten, wurde durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren eine Einzelzellsuspension hergestellt.

38 Material und Methoden Gewinnung der gemischten Gliazellkultur Für die Kultivierung der gemischten Gliazellkulturen wurden die Zellen nach der Herstellung der Einzelzellsuspension mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer und 0,4% Trypanblau Lösung (s.3.1.4) ausgezählt. Im Anschluss wurden die Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 5 pro Vertiefung auf Poly-L-Lysine (s.3.1.4) beschichtete Glasdeckgläschen (s.3.1.4) in 24-well-Platten (s.3.1.4) ausplatiert und 20 Min. bei 37 C und 5% CO 2 inkubiert. Nachdem die Zellen adheriert waren, wurden die Wells mit 500 µl Glia-Medium (GM) mit 10% wärmeinaktiviertem fötalem Kälber Serum (FCS) (s.3.1.4) und 1% Penicillin-Streptomycin (s.3.1.4) geflutet Kultivierung der gemischten Gliazellkultur Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium durch Gliamedium ersetzt, welchem IFN-β in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt war. IFN-β (s.3.1.4) wurde in den Konzentrationen 1000, 100 und 10 U/ml eingesetzt. IFN-γ (s.3.1.4) wurde als zusätzliche Kontrolle in einer Konzentration von 100 U/ml verwendet. Das Glia-Medium (s.3.1.6) ohne Zusätze stellte in diesem Versuchsansatz die Kontrolle dar, zu der in der Auswertung alle anderen Medien verglichen wurden. CG4-Medium (s.3.1.6) fördert die Proliferation und verlangsamt die Differenzierung der OPCs (Stangel et al., 2000). Daher fungiert es bei Proliferationsversuchen als Positivkontrolle, bei Differenzierungsversuchen als Negativkontrolle. Der Mediumwechsel erfolgte alle drei Tage, insgesamt verblieben die Kulturen 7-10 Tage in Kultur. Mikroskopisch erkennbar bildete sich ein konfluenter Zellrasen aus, bestehend aus einer Astrozytenzellschicht, auf der sich sowohl Mikroglia als auch Oligodendrozytenvorläuferzellen entwickelten (Stangel und Bernhard, 2003). Im Anschluss an die Kultivierung wurden Proliferations- und Differenzierungsuntersuchungen vorgenommen Aufreinigung von Oligodendrozytenvorläuferzellen Für die Isolierung von primären Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) wurde die Einzelzellsuspension (siehe oben) auf sechs Poly-L-Lysin beschichtete Kulturflaschen (s.3.1.4) aufgeteilt und im Inkubator bei 37 C und 5% CO 2 in Gliamedium für 8 Tage belassen. Mit Hilfe eines Inkubations-Schüttlers (Edmund Bühler KS-15 control und TH15, s.3.1.1) wurde die nur lose anhaftende Mikroglia durch 30 minütiges Abschütteln entfernt und verworfen. Die Kulturflaschen wurden erneut mit 12 ml Gliamedium befüllt

39 Material und Methoden 39 und zur Wiederherstellung des CO 2 Milieus für wenige Stunden in den Brutschrank zurückgestellt. Um die OPCs zu gewinnen, wurden die Kulturen für Stunden geschüttelt. Die restliche Mikroglia, Makrophagen, Meningealzellen und Astrozyten wurden durch Anheftung an unbeschichtete Kulturflaschen für eine Stunde im Inkubator größtmöglich entfernt. Die im Überstand verbliebenen OPCs wurden gezählt und in einer Konzentration von 5x 10 4 pro Vertiefung, der 24 ger well-platten, auf die Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger verbracht. Nach 20 Min. Inkubation wurde zu den adherierten Vorläuferzellen 500 µl Medium zugegeben Kultivierung der gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen In den Versuchen mit gereinigten OPCs sollte der Einfluss des Interferon-β auf die Differenzierung untersucht werden. Aufgrund der hemmenden Wirkung des CG4- Mediums auf die Reifung der OPCs, wurde es daher als Negativkontrolle eingesetzt. N2B3-Medium fungierte als Positivkontrolle. IFNβ wurde dem N2B3-Medium (s.3.1.6) in den Konzentrationen 1000, 100 und 10 U/ml und IFNγ mit 100 U/ml zugegeben. Die Differenzierungsuntersuchungen wurden nach zwei Tagen Kultivierung im Brutschrank durchgeführt. 3.4 In vitro-versuche Poliferationsassay Untersuchungen zum Proliferationsverhalten der OPCs wurden anhand von Bromo-2`- Beoxy-uridine (BrdU) Inkorporation durchgeführt. Die Zugabe des BrdU (3.1.5) zu der gemischten Gliazellkultur erfolgte 24h vor der eigentlichen Färbung in einem Verhältnis von 1:100. Am darauf folgenden Tag wurden die Zellen im Well mit 300 µl Gliamedium gewaschen. Danach erfolgte die Zugabe des A2B5-Antikörpers (Hybridomüberstand s.3.1.5) in einer Verdünnung 1:2 für eine Stunde bei 37 C. Nach einem erneuten Waschschritt mit Gliamedium wurden die Zellen im Well mit vorgekühltem Methanol bei 20 C für 20 Min. fixiert und danach erneut mit Gliamedium gewaschen. Die DNA wurde mit 2M Salzsäure, die für eine Stunde bei 37 C zugesetzt wurde, gespalten und im Anschluss durch zweimalige Waschungen mit 0,1% Boratpuffer inaktiviert. Nach einem erneuten Waschschritt mit Gliamedium wurde der primäre Antikörper gegen BrdU in einer Verdünnung mit Gliamedium von 1:100 für eine Stunde bei 37 C zugegeben. Die Zugabe der sekundären Antikörper anti-igg konjugiertem Cy2 und anti-igm konjugiertem Cy3

40 Material und Methoden 40 (s.3.1.5) erfolgte in einem Verhältnis von 1:100 für eine Stunde bei 37 C nach einem weiteren Waschvorgang mit Gliamedium. Danach wurden die Deckgläschen vorsichtig drei mal mit Gliamedium gespült, zuletzt noch gründlich mit destilliertem Wasser, bevor sie mit Dabko (s.3.1.4) eingebettet wurden. Die Fixation der Deckgläschen wurden mit Corbit- Balsam (s.3.1.4) erzielt. Es wurden mit der 40x Vergrößerung des Leica DM LB Mikroskops, pro Objektträger, in 4-5 Gesichtsfeldern die absolute Anzahl an A2B5 positiven OPCs und die A2B5/BrdU doppelt positiven Zellen ausgezählt. In Abbildung 2 ist die Morphologie BrdU-positiver und A2B5-positiver OPCs dargestellt (s. Seite 42). Der Abbildung 3 ist der Prozentsatz der proliferierenden Vorläuferzellen von der Gesamtzahl der A2B5 positiven OPCs zu entnehmen Differenzierungsassay Um die Differenzierung der Oligodendrozyten zu beurteilen wurden Doppelfärbungen mit dem Marker A2B5 für Oligodendrozytenvorläuferzellen und dem Oligodendrozytenmarker für reife Oligodendrozyten GalC (Galactosylceramid) (s.3.1.5) durchgeführt. Diese beiden Primärantikörper wurden am 9. Tag der Kultivierung in einem Verhältnis von 1:2, nachdem die Zellen mit Gliamedium gewaschen wurden, zusammen für 30 Min. bei 37 C zugegeben. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen mit Methanol fixiert (siehe oben) und erneut gewaschen. Die sekundären Antikörper (anti-igg konjugiertes Cy2 und anti- IgM konjugiertes Cy3) wurden in einer Verdünnung von 1:100 für eine Stunde zugegeben, anschließend drei mal mit Gliamedium und ein mal mit destilliertem Wasser gespült und im Anschluss mit Dabko eingebettet. Es wurden in 5 Versuchen pro Objektträger mindestens 10 Gesichtsfelder in der 40x Vergrößerung des Leica DM LB Mikroskops ausgezählt. Die Morphologie von GalC-positiven Oligodendrozyten ist der Abbildung 2 auf Seite 42 zu entnehmen. Die absoluten Gesamtzahlen der einzelnen Medien wurden dann zueinander (A2B5 zu GalC) ins Verhältnis gesetzt. Ein geringer Wert besagt demnach, dass mehr ausgereifte Oligodendrozyten vorhanden sind als OPCs, bei einem hohen Ergebnis liegen entsprechend mehr Vorläuferzellen als reife Oligodendrozyten vor. Während der Reifung der OPCs zu Oligodendrozyten nimmt die Anzahl der Fortsätze der Zellen zu (Mastronardi et al., 2004), so dass wir durch das Auszählen der Fortsätze pro Zelle ein weiteres Kriterium für die Differenzierung der OPCs in den gemischten Gliazellkulturen erhielten. Hierzu wurden von drei unabhängigen Experimenten für jedes Medium ca. 10 Aufnahmen mit der Leica-Kamera in der 40x Vergrößerung erstellt. Zwei

41 Material und Methoden 41 unabhängige Untersucher bestimmten von den GalC- gefärbten Zellen die Anzahl der Fortsätze pro Zelle Differenzierungsassay an gereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen Aufgrund der Ergebnisse in den gemischten Gliazellkulturen und um beurteilen zu können ob Interferon-β direkt auf die Reifung der OPCs einwirkt, wurden an den gereinigten Oligodendrozyten nur immunhistologische Färbungen zur Differenzierung mit den Primärantikörpern A2B5 und GalC durchgeführt. Es wurden die selben Marker für reife und unreife Oligodendrozyten (GalC/A2B5) eingesetzt wie in gemischten Gliazellkulturen. Der Ablauf der Färbung reiner OPCs verief unterschiedlich. Die Zellen wurden bis zur Fixation im Well belassen, erst mit Gliamedium gewaschen und anschließend die Primärantikörper in einem Verhältnis 1:2 appliziert. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 37 C, wurden die Wells erneut gewaschen und anschließend bei Raumtemperatur für 12 Min. mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nachdem die Zellen mit Gliamedium gespült worden waren, erfolgte die Zugabe der Sekundärantikörper (Cy2 gekoppeltes anti-igg und Cy3 gebundenes anti-igm) für eine Stunde bei 37 C. Letztendlich wurden die mehrfach mit Gliamedium und destilliertem Wasser gewaschenen Objektträger mit Dabko und Corbit -Balsam eingebettet. Wie in den gemischten Kulturen wurde die Ratio von A2B5-positiven Zellen zu GalCpositiven Zellen pro Objektträger aus mindestens 10 Gesichtsfeldern in der 40x Vergrößerung des Leica DM LB Mikroskops ermittelt. Eine Übersicht über die Färbungen zeigt Abbildung 2.

42 Material und Methoden 42 A B C Abb.2: Übersicht zur Morphologie von A2B5-positiven (A) und BrdU-positiven (B) OPCs und reifen GalC positiven Oligodendrozyten (C) in gemischten Gliazellkulturen in der 40x Vergrößerung unterschiedlicher Gesichtsfelder Statistische Auswertung der in vitro Daten Es wurden sowohl in den gemischten Gliazellkulturen, als auch den gereinigten Oligodendrozytenkulturen pro Färbung je 5-6, für die Bestimmung der Fortsätze pro Zelle 3, voneinander unabhängige Experimente ausgewertet. Pro Objektträger wurden ca. 10 Gesichtsfelder ausgezählt. Die einzelnen Medien mit Zusätzen bzw. das CG4-Medium wurden zur Kontrolle (Gliamedium) verglichen. Bei Normalverteilung der Werte (Sigma Stat) wurde der zweiseitige students-t Test bei Gruppen mit gleicher Varianz durchgeführt. Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 als signifikant angesehen. Bei nicht normal-verteilten Werten wurde der nicht parametrische Mann Whitney-U Test (Rangsummen Test) durchgeführt. Auch hierbei wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 als signifikant berücksichtigt.

43 Material und Methoden In vivo Untersuchungen Zusätzlich zu den in vitro Versuchen wurde in dieser Arbeit die Wirkung von IFN-β in vivo anhand des Cuprizonemodells charakterisiert. Durch die Verwendung von Interferonβ-defizienten Mäusen, erwarteten wir zusätzliche Informationen über den Einfluss des Interferon-β bei der Remyelinisierung Gehirnentwicklung bei C57Bl/6-Mäusen und Interferon-β-k.o.-Mäusen Im Tierversuch setzten wir C57Bl/6 Mäuse (s.3.1.7) als Kontrollen und IFNβ-k.o.-Mäuse (s.3.1.7, Referenz: Erlandsson et al., 1998) mit dem selben genetischen Hintergrund ein. Es wurden unterschiedliche Entwicklungszeitpunkte untersucht: 0-1 Tag alte, 6 Tage alte, 21 Tage alte und 8 Wochen alte Tiere. Hierbei wurde schwerpunktmäßig die Myelinbildung betrachtet, sowie das Auftreten von Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten. Pro Zeitpunkt standen uns 5 k.o-tiere und 5 Kontrollen zur Verfügung, bei den jüngsten Tieren allerdings nur 4 Tiere pro Gruppe. Die Mäuse wurden im entsprechenden Alter getötet. In den beiden frühen Zeitpunkten erfolgte dieses per Nackenschnitt, die 21 Tage alten und 8 Wochen alten Tiere wurden mit CO 2 vergast und anschließend mit 4% Paraformaldehyd perfundiert. Die Schädelhöhle wurde durch einen Längsschnitt und zwei kleinen Transversalschnitten eröffnet und das Gehirn mit Hilfe einer Pinzette entnommen und sofort zur Fixation in 4% Paraformaldehydlösung (s.3.1.8) gelegt Durchgeführte Färbungen zur Gehirnentwicklung an Paraffinschnitten An den Paraffinschnitten wurde die Luxol Fast Blue-Färbung (LFB), als Übersichtsfärbung für den Grad der Myelinisierung, verwendet. Immunhistochemisch wurden die Myelinproteine Myelin Basisches Protein (MBP), Proteolipid Protein (PLP) und das Myelin/Oligodendrozyten Glycoprotein (MOG) untersucht, für die zellulären Beurteilungen wurde das Gliale Fibrilläre Saure Protein (GFAP) als Astrozytenmarker und das NG2 Proteoglycan (NG2) zum Nachweis von Oligodendrozytenvorläuferzellen eingesetzt (s ).

44 Material und Methoden Auswertung der Ergebnisse der vergleichenden Gehirnentwicklung Die LFB-Färbung und die immunhistochemische Färbung der Myelinproteine (PLP, MBP und MOG) so wie der Astrozyten wurden vergleichend morphologisch beurteilt. NG2-positive Zellen wurden zentral im Balken durch Auszählung mit der 40x Vergrößerung des Leica DMLB- Mikroskops von jeweils vier 0,25mm 2 großen Feldern bestimmt Interferon-β-k.o.-Mäuse im Cuprizonemodell Die IFN-β-defizienten Mäuse wurden ursprünglich mit einem Neomycin R eingefügten Zielkonstrukt hergestellt, welches eine Immunglobulin λ2 Kette als Anzeigergen beinhaltete, mit dem E14 Embryostammzellen transfiziert wurden. Zellen dieses Klons wurden dann in C57Bl/6 Blastozysten injiziert (Erlandsson L. et al., 1998; Teige I. et al., 2003). Der Versuch mit IFN-β-k.o.-Mäusen wurde in der Quarantäne des Zentralen Tierlabores der MHH durchgeführt. Es wurden 42 männliche IFN-β-k.o.-Tiere mit dem C57Bl/6- Hintergrund und 40 männliche C57Bl/6-Mäuse als Kontrollen (s.3.1.7) separat in Gruppen bis max. 6 Tiere gehalten. Zu Beginn des Versuches waren alle Tiere 8 Wochen alt. Die Mäuse wurden alle zwei Tage auf Habitus und Verhalten untersucht, und einmal die Woche gewogen. Nachdem die Tiere eine Woche lang an gemahlenes Futter gewöhnt worden waren, begann der eigentliche Versuch. Die Fütterung erfolgte über Futterautomaten an der Käfigwand und aus Petrischalen vom Boden. Bei der Fütterung vom Boden neigen die Tiere dazu das Futter zu zerstreuen, doch erwies sich diese zusätzliche Fütterungsform als sinnvoll, da sichergestellt werden sollte dass auch toxingeschwächte Tiere an die Futterquelle gelangen können. Den Tieren stand in den ersten sechs Versuchswochen Futter mit 0,2% Cuprizonegehalt ad libitum zur Verfügung. Nach sechs Wochen wurde die Fütterung auf normales Futter umgestellt und somit die Remyelinisierungsphase eingeleitet. Es wurden Tiere zu den Zeitpunkten 3, 6, 7, 9 und 12 Versuchswochen mit CO 2 und der Perfusion mit 4% Paraformaldehyd getötet. Pro Zeitpunkt wurden 8-9 Mäuse entnommen, wovon 5 Gehirne in Paraffin und 3-4 in das Kunstharz Epon eingebettet wurden. Zum 0 Wochenzeitpunkt wurden nur 4 Gehirne in Paraffin und 3 in Epon eingebettet.

45 Material und Methoden Durchgeführte Färbungen Außer der LFB-Färbung wurden immunhistochemische Färbungen für die Myelinproteine MBP, PLP und MOG durchgeführt, für die zellulären Beurteilungen wurde das Gliale Fibrilläre Saure Protein (GFAP) als Astrozytenmarker und das NG2 Proteoglycan (NG2) zum Nachweis von Oligodendrozytenvorläuferzellen eingesetzt. Zusätzlich wurde ein Marker für Mikroglia und Makrophagen, MAC-3, und für axonalen Schaden das SMI-32 für Neurofilamente mit nicht phosphorylierten Epitopen gefärbt (s ). Von den in Epon eingebetteten Gehirnen wurden die Zeitpunkte 0, 6, 7 und 12 Wochen im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover bearbeitet und geschnitten. Von jedem Zeitpunkt wurden elektronenmikroskopische Bilder erstellt, um exemplarisch die Ergebnisse der Immunhistochemie zu verifizieren. 3.6 Allgemeine Durchführungen für die vergleichende Gehirnentwicklung und das Tiermodell Einbettung in Paraffin Zur Einbettung in Paraffin wurde das Gewebe über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4 C belassen, am nächsten Tag in der Pathologie der Medizinischen Hochschule mit Hilfe eines Einbettautomaten weiter bearbeitet und letztendlich in Blöcke eingegossen. Mit dem Paraffinschneidegerät Leica RM 2245 wurden die Blöcke in Schnitte mit einer Dicke von 7 µm verarbeitet. Auf Grund der guten Reproduzierbarkeit wurden die Querschnitte im Bereich 220 bis 300 des Atlas of the Mouse Brain and Spinal Cord (Richard L.Sidmann, Jay B. Angvine, Jr. Elizabeth Taber Pierce) verwendet Einbettung in Epon Die Einbettung in Epon wurde in den Forschungswerkstätten der MHH vorgenommen. Es wurden folgende Lösungen vorbereitet: Die Gehirne wurden noch am selben Tag der Entnahme zerteilt und aus dem hinteren Bereich des Balkens, auf Höhe des Hippocampus, Balkenanteile von ca. 2 bis 3 Millimeter entnommen. Nachdem diese Proben für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einem Gemisch aus 1ml 2,5% Glutaraldehyd (s.3.1.8), 4ml Aqua bidest, 5ml Cacopuffer (s.3.1.8) fixiert worden waren, wurden sie über Nacht in 0,1% Cacopuffer (Aqua bidest 5ml und 5ml 2mol Cacopuffer) gelagert.

46 Material und Methoden 46 Am darauffolgenden Tag wurde die Einbettung fortgesetzt. Zuerst wurden die Proben in 1% Osmium (s.3.1.9) für 60 bis 90 Min. unter dem Abzug belassen (2 Teile Cacopuffer 0,2M, 1 Teil H 2 O und 1 Teil 4% O 2 O 4 ). Danach folgte die Alkoholreihe zur weiteren Entwässerung, von 25% Ethanol über 50%, 75% bis zum 90% Ethanol, die jeweils zweimal fünf Minuten angewendet wurden. Der absolute Ethanol wurde sechs mal fünf Min. eingesetzt, worauf dann für zwei mal zehn Min. Propylenoxid (s.3.1.8) zu dem entnommenen Gewebe zugegeben wurde. Während dessen wurde das Epon (s u.3.1.9) mit dem Härter DMP30 (s.3.1.8) angesetzt, geschüttelt und bis zum Gebrauch bei 40 C im Wärmeschrank stehen gelassen. Das Epon wurde mit dem Propylenoxid im Verhältnis 1:1 gemischt, zu dem Gewebe gegeben und bei 40 C für 30 Min. in den Wärmeschrank gestellt. Danach wurden die Proben bei 40 C zweimal für 45 Min. in reines Epon überführt, in den Einbettformen positioniert und letztendlich über Nacht im Wärmeschrank bei 40 C belassen. Zur Aushärtung wurden die Einbettformen am darauffolgenden Tag, für zwei weitere Tage, in einen auf 60 C eingestellten Wärmeschrank überführt Luxol Fast Blue Luxol Fast Blue ist eine spezifische Myelinfärbung, die Aufschluss gibt über den Grad der Myelinisierung des Gewebes. Myelin stellt sich blau gefärbt dar, demyelinisierte Bereiche anhand der vorhandenen Abbauprodukte rosa bis violett-gefärbt (PAS-Reaktion). Vor dem Färbevorgang wurden folgende Lösungen hergestellt: Sulfitwasser, Perjodsäure und LFB (s ). Die Färbung begann mit dem Entparaffinieren der Paraffinschnitte indem diese zweimal 10 Min. in Xylol (s.3.1.8) belassen wurden und anschließend in absoluten Alkohol und dann in 96% Alkohol überführt wurden. Danach wurden die Schnitte für 1 Stunde im Wärmeschrank, in 60 C vorgewärmtem Luxol Fast Blue gefärbt. Überschüssige Farbe wurde durch zweimaliges Waschen in 96% Alkohol entfernt und anschließend in aqua dest. gestellt. In Lithiumcarbonatlösung wurden die Schnitte durch kurzes Eintauchen entfärbt, mit zwei anschließenden Durchgängen im 70% Ethanol wurde die gewünschte Farbintensität erzielt. Danach wurde aqua dest. (a.d.) als Waschschritt eingesetzt. Die PAS-Reaktion wurde durch 8 minütiges Eintauchen in Perjodsäure (s.3.1.8), gefolgt von kurzem Spülen in a. d. eingeleitet, bevor die Schnitte für 15 Min. mit Schiff`s Reagenz (s.3.1.8) behandelt wurden. Mit fließendem Leitungswasser wurde in den folgenden 10 Min. das Bläuen der Schnitte erreicht. Nach kurzem Eintauchen in a.d. wurde

47 Material und Methoden 47 die Alkoholreihe vom 70% Ethanol über 96% bis zum absoluten Alkohol durchschritten. Nachdem die Schnitte zweimal für 10 Min. mit Xylol behandelt wurden, wurden sie mit Eukitt (s.3.1.8) eingeckt Grundsätzlicher Färbevorgang immunhistologischer Färbungen: Die Immunhistologischen Färbungen wurden in feuchten Kammern durchgeführt, um ein Austrocknen der Schnitte während der Inkubationszeiten zu verhindern. Tabelle 1 gibt Auskunft über die verwendeten Antikörper und Seren. Zu Beginn der Färbung wurden die Schnitte zwei Mal für 10 Min. mit Xylol entparaffiniert. Danach wurde die absteigende Alkoholreihe (2x 100% Ethanol 10 Min., 2x 90%, 2x 80%, 2x70% Ethanol je 5 Min.) durchschritten und die Schnitte danach in PBS gespült. Das Freilegen der Epitope erfolgte durch Kochen in Citratpuffer für 5 Min. in der Mikrowelle. Nach dem Kochen wurden die Objektträger zum Abkühlen 20 Min. stehen gelassen, dann erneut in PBS gespült bevor die Schnitte mit Hilfe eines Liquidblockers, PAP-Pens (s.3.1.8) umkreist wurden, um zu gewährleisten, dass diese in den folgenden Schritten immer gut mit Flüssigkeit bedeckt sind. Nachdem die Objektträger in der feuchten Kammer platziert wurden, erfolgte die Zugabe von 1% H 2 O 2 Lösung (s.3.1.8) für 30 Min. bei Raumtemperatur. Nach weiteren drei Waschschritten in PBS wurde der Hintergrund mit 3% Serum (s ) für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Um noch einen Rest des Serums auf den Schnitten zu belassen, wurden diese nur abgeklopft, bevor der primäre Antikörper, der in PBS mit 0,1% Triton (s.3.1.8) gelöst wurde, appliziert wurde. Danach wurden die Gewebeschnitte über Nacht bei 4 C inkubiert. Am zweiten Tag wurde erneut drei Mal mit PBS gewaschen, bevor der sekundäre biotinylierte Antikörper auf die Schnitte gegeben wurde und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubierte. Zwischen den folgenden Schritten wurde jeweils drei Mal mit PBS gespült. Als nächstes wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur der Avidin-Biotin-Komplex (ABC) (s.3.1.8) hinzugegeben. Bei der folgenden Zugabe des DAB (s.3.1.8) katalysiert die im ABC- Komplex enthaltene Peroxidase in Gegenwart von 5% H 2 O 2 die Umwandlung eines phenolischen Substrates in dessen unlösliche Form. Durch diese Reaktion wurde die Färbung der Schnitte bewirkt. Die Farbreaktion wurde bei Erreichen der gewünschten Farbintensität (nach ca. 10 Min.) durch dreimaliges Waschen in PBS gestoppt. Eine Verstärkung der Braunfärbung wurde im Anschluss durch Behandlung mit 0,04% Osmium erzielt (20 Sec.). Erneut wurde die Reaktion durch Waschungen in PBS beendet und eine Gegenfärbung mit Hämalaun (s.3.1.8) angeschlossen. Nachdem die Alkoholreihe in

48 Material und Methoden 48 umgekehrter Reihenfolge durchlaufen wurde, erfolgte die Einbettung der Schnitte mit Eukitt. 3.7 Auswertung der Daten in vivo Auswertung der Gewichtsverläufe Das Gewicht der Tiere wurde einmal wöchentlich für Kontrollen und k.o.-tiere getrennt ermittelt. Für die beiden Gruppen wurde der Mittelwert pro Woche errechnet und die Standardabweichung bestimmt. Die Beurteilung signifikanter Unterschiede zwischen den Gruppen wurde durch den students-ttest und den nicht parametrische Mann Whitney-U Test (Rangsummen Test) durchgeführt. Als signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 angenommen Myelinbeurteilung Die LFB-Färbung und die immunhistochemische Färbung der Myelinproteine (PLP, MBP und MOG) wurden durch drei unabhängige, geblindete Untersucher, anhand eines Scorings von 0-3 beurteilt. Hierbei stellte ein Myelinisierungsgrad von 3 das Maximum der Demyelinisierung und ein Score von 0 die vollständige Myelinisierug (bzw. unbehandelte Mäuse) dar. Von diesen drei Werten pro Zeitpunkt wurde dann der Mittelwert pro Versuchszeitpunkt, sowohl für Kontrollen als auch für die k.o.-tiere ermittelt und die Standardabweichung (S.D.) bestimmt. Zur Beurteilung signifikanter Unterschiede zwischen den Kontrollen und den IFN-β-k.o.-Tieren wurde der nicht parametrische Mann Whitney-U Test (Rangsummen Test) durchgeführt. Als signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 berücksichtigt Auswertung der elektronenmikroskopischen Bilder Es wurde die G-Ratio, sprich das Verhältnis von Axon mit Myelin zu dem reinen Axon, und zum anderen die Anzahl der myelinisierten zu den unmyelinisierten Axonen bestimmt. Von den jeweils 3 Kontrolltieren und den 3 IFN-β-k.o.-Tieren des 7-Wochenzeitpunktes wurden in den elektronenmikroskopischen Aufnahmen in der 8000-fachen Vergrößerung ca. 500 Axone pro Mäusegehirn ausgewertet. Für die statistische Auswertung wurde der nicht parametrische Mann Whitney-U Test (Rangsummen Test) herangezogen. Als signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 berücksichtigt.

49 Material und Methoden Auszählung der Oligodendrozytenvorläuferzellen (NG2) NG2-positive Zellen wurden sowohl im Balken als auch im subventrikulären Bereich des Ventrikulus tertius bestimmt. Zentral im Balken und unterhalb des Ventrikels wurden jeweils 4 Felder in einer Größe von 0,25mm 2 ausgezählt Auszählung der Astrozyten (GFAP) Für die Beurteilung der GFAP-positiv gefärbten Zellen im Cuprizonemodell wurden zwei Felder (0,0625mm 2 ) zentral im Balken und 4 Felder (0,0625mm 2 ) am Rand des Corpus callosum ausgezählt. In der Auswertung sind diese Bereiche zusammengefasst Auszählung der Mikroglia (MAC-3) Für den Rand des Balkens wurden sechs Felder (0,0625mm 2 ), in der Mitte des Balkens zwei Felder (0,0625mm 2 ) ausgezählt. Beide Bereiche wurden getrennt voneinander ausgewertet Statistik für die NG2-, GFAP- und MAC-3 Färbung Verglichen wurden jeweils die Werte der Kontrolltiere zu den Werten der IFN-β-k.o.-Tiere eines Zeitpunktes. Zur Beurteilung signifikanter Unterschiede zwischen den nicht normalverteilten Werten wurde der nicht parametrische Mann Whitney-U Test durchgeführt. Als signifikant wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p< 0,05 berücksichtigt.

50 Ergebnisse 50 4 Ergebnisse 4.1 In vitro Ergebnisse IFN-β hat keinen Effekt auf die Proliferation von OPCs in gemischten Gliakulturen Für die Remyelinisierung von Entmarkungs-Läsionen ist unter anderem eine ausreichende Proliferation von OPCs notwendig. Um weitere Informationen über die Rolle von IFN-β in diesem komplexen Vorgang zu erhalten wurde getestet, ob durch Zugabe von IFN-β zu gemischten Gliakulturen, ein Einfluss von IFN-β auf das Proliferationsverhalten der OPCs vorliegt. Anhand von BrdU-Inkorporation konnte die Proliferation der OPCs bestimmt werden, ermittelt wurde der prozentuale Anteil der BrdU-positiven Zellen in der Population der A2B5-positiven OPCs. Gliamedium ohne IFN-β wurde als Kontrolle verwendet. CG4-Medium diente in diesem Versuchsansatz als Positivkontrolle (85,5%±8,6), da es die Zellen in einem proliferierenden Stadium mit nur langsamer Differenzierung hält. Die Zugabe von IFN-β in den Konzentrationen 10, 100, und 1000 U/ml zum Medium zeigte im Vergleich zu Gliamedium ohne Zusätze (69,2%±3,8) keine signifikanten Unterschiede. Für diese Konzentrationen ergaben sich Werte von 70,9%±8,7 (10 U/ml IFN-β); 67,8%±10,0 (100 U/ml IFN-β) und 60,5%±20,6 (1000 U/ml IFN-β) proliferierenden OPCs. Ein ähnliches Ergebnis lieferte die Zugabe von 100 U/ml IFN-γ, welches als weitere Kontrolle verwendet wurde, mit einem Proliferationsgrad von 64,8%±13,5. Zusammengefasst zeigte sich, dass IFN-β keinen Effekt auf die Proliferation von OPCs in gemischten Gliazellkulturen hat (Abb.3).

51 Ergebnisse Proliferationsindex [% A2B5/BrdU +/+ Zellen] Positivkontrolle Kontrolle IFN-γ IFN-β β 10 U/ml IFN-β β 100 U/ml IFN-β β 1000 U/ml Abb. 3: IFN-β in den Konzentrationen 10, 100 und 1000 U/ml hatte keinen Einfluss auf die Proliferation von Oligodendrozytenvorläuferzellen in gemischten Gliazellkulturen im Vergleich mit dem Kontrollmedium (GM). Angegeben ist die prozentuale Anzahl an proliferierenden, BrdU-positiven Zellen in der Population der A2B5 positiven Oligodendrozytenvorläuferzellen. CG4- Medium diente als Positivkontrolle IFN-β hemmt die Differenzierung von OPCs in gemischten Gliazellkulturen Um den Effekt von INF-β auf die Reifung der OPCs zu myelinformenden Oligodendrozyten zu untersuchen, wurde das Verhältnis von Vorläuferzellen zu reifen Oligodendrozyten ermittelt. Der Einfluss von IFN-β auf die Differenzierung von OPCs wurde zuerst an gemischten Gliazellkulturen untersucht. Diese Cokultur entspricht im Gegensatz zu den reinen Vorläuferkulturen aufgrund der vorhandenen Astrozyten und Mikroglia mehr den physiologischen Bedingungen im lebenden Organismus. Die Kontrolle (GM) ergab einen relativ geringen Wert von 3,87±0,95 für das Verhältnis A2B5-positiven- Zellen zu GalC-positiven-Zellen im Vergleich mit der Negativkontrolle, die einen Differenzierungsindex von 10,04±5,67 aufwies. Die Zugabe von INF-β führte zu einer Zunahme von A2B5 positiven Zellen im Verhältnis zu den GalC positiven Zellen in allen eingesetzten Konzentrationen des INF-β im Vergleich mit dem Gliamedium. 100 und 1000 U/ml wiesen eine statistische Signifikanz mit einem Differenzierungsindex von 7,38±1,0 (p= 0,0006) und 7,50±1,28 (p= 0,006) auf. IFN-γ erreicht mit einem Differenzierungsindex von 7,69± 4,64 einen ähnlich hohen Wert wie IFN-β in den Konzentrationen 100 und 1000

52 Ergebnisse 52 U/ml, es lag jedoch keine statistische Signifikanz vor. Der Einsatz von 10 U/ml ergab einen geringeren Differenzierungsindex von 6,20±3,04 (Abb. 4). Zusammenfassend konnte eine Hemmung der Differenzierung der Vorläuferzellen zu reifen myelinformenden Oligodendrozyten in MGP festgestellt werden. 18 Differenzierungsindex [A2B5/GalC Ratio] Negativkontrolle Kontrolle IFN-γ IFN-β 10 U/ml IFN-β β 100 U/ml IFN-β β 1000 U/ml Abb. 4: Einfluss verschiedener Konzentrationen von IFN-β auf die Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen in gemischten Gliakulturen. Angegeben ist die Ratio von Vorläuferzellen zu differenzierten Zellen. IFN-β in den Konzentrationen 100 U/ml (p=0,0006) und 1000 U/ml (p=0,006) erwies sich als statistisch signifikant zum Gliamedium (GM). Das CG4-Medium diente als Negativkontrolle in diesem Versuchssetting. Bei der Differenzierung der OPCs zu reifen Oligodendrozyten kommt es unter anderem zu einer Änderung der Morphologie der Zellen im Sinne einer Zunahme der Zellfortsätze (Mastronardi et al., 2004). Um die Ergebnisse der Differenzierung in MGP zu bestätigen, nutzten wir diesen Aspekt und bestimmten die Anzahl der Fortsätze pro Oligodendrozyt (F/Z) in GalC gefärbten MGPs. Die Anzahl der Fortsätze pro GalC-positiver Zelle in mit IFN-β behandelten Kulturen war im Vergleich zur Kontrollkultur (GM) vermindert. Dies bestätigt, dass weniger ausdifferenzierte Zellen vorlagen. Die Werte für IFN-β in den

53 Ergebnisse 53 Konzentrationen 100 U/ml und 1000 U/ml erwiesen sich mit 2,2± 0,13 und 2,35± 0,34 F/Z geringer als das Kontrollmedium mit 3,2± 0,42 F/Z und geringfügig höher als das CG4- Medium mit 2,15±0,57 F/Z. Interferon-β in einer Konzentration von 10 U/ml und Interferon-γ wiesen beide 2,6 F/Z auf (Abb.5). Die Standardabweichung betrug für 10 U/ml ±0,30 und für Interferon-γ ±1, Fortsätze / Zelle Negativkontrolle Kontrolle INF-γ IFN-β 10 U/ml IFN-β β 100 U/ml IFN-β 1000 U/ml Abb. 5: Die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von IFN-β auf die Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen in gemischten Gliakulturen, dargestellt anhand der Anzahl der Fortsätze pro Oligodendrozyt, n= 3. Das Gliamedium ist die Positivkontrolle zu der die zugesetzten Konzentrationen von IFN-β verglichen wurden. Als Negativkontrolle wurde das CG4 Medium verwendet.

54 Ergebnisse IFN-β zeigte keinen direkten Effekt auf die Differenzierung von gereinigten OPCs An isolierten gereinigten OPCs wurde untersucht, ob die Stimulation von IFN-ß einen direkten Einfluss auf die beobachtete verminderte Differenzierung von Vorläuferzellen hat oder die Effekte über Gliazellen wie z.b. Astrozyten oder Mikrogliazellen beeinflusst werden. In diesem Versuchsaufbau stellt das N2B3-Medium die Kontrolle und das CG4- Medium die Negativkontrolle dar. Es zeigte sich, dass kein direkter Effekt des IFN-ß auf die Differenzierung der OPCs festgestellt werden konnte. Im Vergleich mit Kulturen, die mit N2B3-Medium behandelt wurden und einen Differenzierungsquotienten von 2,44±0,80 A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-Zellen ergaben, zeigte die Stimulierung von OPCs mit IFN-β in den Konzentrationen 10, 100 und 1000 U/ml mit einem Verhältnis von 3,0±0,67; 3,1±0,87 und 3,2± 0,89 A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-Zellen, keinen signifikanten Unterschied. Auch IFN-γ, hatte keinen Einfluss auf die Differenzierung der OPCs, die Ratio für diese Stimulation der Zellen ergab 3,11±1,13. Für die Kultivierung der OPCs mit CG4- Medium als Negativkontrolle konnte ein Differenzierungsindex von 9,94±5,17 A2B5-positiven-Zellen zu GalC-positiven-Zellen erhoben werden, siehe Abb.6. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die beobachteten hemmenden Effekte des IFN-β bei der Differenzierung von OPCs zu reifen Oligodendrozyten nicht direkt auf die OPCs sondern indirekt über andere Gliazellen vermittelt werden.

55 Ergebnisse Differenzierungsindex [A2B5/GalC Ratio] Negativkontrolle Kontrolle IFN-γ IFN-β 10 U/ml IFN-β β 100 U/ml IFN-β 1000 U/ml Abb.6: Die Stimulierung mit IFN-β zeigte keine Wirkung auf die Differenzierung von Oligodendrozytenvorläuferzellen in isolierten gereinigten Vorläuferzellkulturen, verglichen mit dem Gliamedium. Angegeben ist das Verhältnis von Vorläuferzellen (A2B5-Positive Zellen) zu differenzierten Zellen (GalC-positive Zellen). Das CG4- Medium stellt die Negativkontrolle dar. 4.2 In vivo Ergebnisse Vergleichende Untersuchungen zur Gehirnentwicklung bei C57Bl/6-Mäusen und IFNβ-k.o.-Mäusen Die Gehirnentwicklung von C57Bl/6-Mäusen als Kontrollen und IFNβ-k.o.-Mäusen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0-1, 6 und 21 Tage sowie 8 Wochen post partum) betrachtet, um sicherzustellen, dass beide Gruppen keine gravierenden Unterschiede in der Entwicklung aufweisen und somit gleiche Voraussetzungen für die Durchführung des Cuprizonemodells vorliegen. Hierbei war schwerpunktmäßig die Myelinbildung von Interesse, sowie das Auftreten von Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten.

56 Ergebnisse Untersuchung der Myelinbildung Die Myelinbildung wurde anhand der Übersichtsfärbung mit LFB und spezifischen Markern für die Myelinproteine PLP, MBP und MOG charakterisiert. Die Übersichtsfärbung LFB zeigte, dass ab 21 Tagen post partum sowohl bei den Kontrolltieren als auch bei den IFNβ-k.o.-Tieren am Rande des Balkens in der Nähe der Ventriculi lateralis die Myelinisierung einsetzte. Es war zwischen beiden Gruppen kein gravierender Unterschied erkennbar. Bei den 8 Wochen alten Mäusen beider Gruppen stellte sich der Balken vollständig myelinisiert dar. Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch Färbungen für PLP, MBP und MOG. Kurz nach der Geburt (0-1Tag post partum) sind in beiden Tiergruppen bei keiner der Färbungen für die Myelinbestandteile PLP, MBP und MOG Anzeichen der Myelinbildung nachweisbar. Bei zwei genetisch veränderten Tieren kam es im Alter von 6 Tagen zum Beginn der Bildung von MBP-positiven Myelinbestandteilen. Bei allen anderen Tieren fiel die spezifische Anfärbung von MBP negativ aus. Im Gegensatz dazu färbten sich im Alter von 21 Tagen Fasern von PLP und MBP sowohl bei den IFN-β-k.o.-Tieren als auch bei den Kontrolltieren gleichermaßen im Corpus callosum an. MOG ließ sich im Vergleich mit PLP und MBP zu diesem Untersuchungszeitpunkt schwächer anfärben, zeigte aber ebenfalls keinen Unterschied zwischen den Tiergruppen (s. Abb.7). Mit 8 Wochen, entsprechend dem Alter der im Tiermodell verwendeten Mäuse, wiesen sowohl genetisch veränderte Tiere als auch die Kontrolltiere in allen durchgeführten Färbungen eine vollständige Myelinisierung des Corpus callosum auf. Während der Entwicklung beider Tiergruppen lagen somit keine wesentlichen Unterschiede in der Myelinbildung vor. In beiden Tiergruppen ist das Corpus callosum zum Zeitpunkt des Versuchsbeginns vollständig myelinisiert.

57 Ergebnisse 57 Kontrolle Interferon-β-k.o. MOG MBP PLP Abb.7 Vergleich des Corpus callosum 21 Tage alter Kontrollmäuse und IFN-β-k.o.-Mäuse in der MOG-, MBP- und PLP -Färbung. Beide Tiergruppen zeigten gleiche Ausprägung der Myelinbildung. 10xVergrößerung, der angegebene Balken entspricht 0,1mm.

58 Ergebnisse Entwicklung der Astrozyten Die Auswertung für den Astrozytenmarker GFAP erfolgte vergleichend morphologisch. Erst ab dem Alter von 21 Tagen sind in beiden untersuchten Gruppen einzelne Astrozyten anfärbbar. Im Alter von 8 Wochen wurden für die Kontrollen Werte von insgesamt 264±111,24 Zellen/mm 2 und für die IFNβ-k.o.-Tiere von 232±66,45 Zellen/mm 2 erhoben. Diese Auswertung beinhaltet Bereiche zentral im Balken und auch im Balkenrand (siehe 3.7.5). Beide Gruppen zeigen somit in der Gehirnentwicklung eine gleiche Ausprägung des Astrozytenmarkers GFAP Untersuchung der Oligodendrozytenvorläuferzellen Für die Färbung der Oligodendrozytenvorläuferzellen wurden bei allen untersuchten Entwicklungszeitpunkten die NG2-positiven Zellen/mm 2 in der Mitte des Corpus callosum ausgezählt. Dabei ergab sich ein synchroner Verlauf der Kurven für die untersuchten Tiergruppen, wobei die Kontrolltiere immer geringfügig über den Werten der IFN-β-k.o.- Tiere lagen (Abb. 8.). Kurz nach der Geburt waren bei den Kontrolltieren 720±16,0 Zellen/mm 2 und bei den k.o.-mäusen 656±169,33 Zellen/mm 2 vorhanden. Im weiteren Verlauf nahmen die Zellzahlen ab, so dass im Alter von 6 Tagen 536±153,74 Zellen/mm 2 bei den Kontrollen und 496±181,49 Zellen/mm 2 bei den k.o.-mäusen gezählt werden konnten. Im Alter von 21 Tagen fielen die Zellzahlen weiter bis auf 380±90,86 Zellen/mm 2 (Kontrollen) und 340±102,06 Zellen/mm 2 (k.o.-tiere) ab und erreichen im Alter von 8 Wochen den geringsten Wert. Zu diesem Zeitpunkt wiesen die Kontrolltiere mit 104,0±146,35 Zellen/mm 2 fast doppelt so viele Zellen/mm 2 auf wie die k.o.-tiere mit 48±96,0 Zellen/mm 2, es lag jedoch keine statistische Signifikanz vor (p=0,343).

59 Ergebnisse Anzahl der NG2-positiven Zellen / mm Tage 6 Tage 21 Tage 56 Tage Zeitpunkte der Gehirnentname Abb. 8: Anzahl der NG2-positiven Zellen/mm 2 im Corpus callosum während der Gehirnentwicklung zu den Zeitpunkten 0, 6 und 21 Tage sowie 56 Tage (=8 Wochen) post partum. Gefüllte Kreise entsprechen den Kontrollen, leere Kreise den IFN-β-k.o.-Mäusen. Insgesamt wurden keine wesentlichen Unterschiede in der Gehirnentwicklung im Hinblick auf die Myelinbildung, sowie das Auftreten von OPCs und Astrozyten festgestellt, beide Gruppen hatten gleiche Vorraussetzungen für den Einsatz im toxischen Tiermodell. 4.3 Ergebnisse von IFN-β-k.o.-Tieren im Cuprizonemodell Gewichtsverläufe Als klinischer Parameter wurde einmal wöchentlich das Gewicht der Kontrollen und IFNk.o.-Tiere ermittelt. Das Ausgangsgewicht der IFN-β-k.o.-Tiere lag statistisch signifikant (p=0,044) über dem Gewicht der Kontrolltiere, bei einem Mittelwert von 26,16±2,11g im Vergleich zu 24,28±1,44g. Unter der Toxingabe kam es zu erwarteten Gewichtsverlusten, die bis zur 3. Woche bei beiden Gruppen annähernd gleichen Verlauf zeigten und einschließlich bis zur 2.Woche signifikant unterschiedlich blieben (1.Woche: p=0,023, 2.Woche: p=0,025). In der vierten Versuchswoche wiesen die Gruppen annähernd gleiche Werte auf, divergierten dann in der fünften Woche wieder, um in der sechsten Woche, dem Zeitpunkt der maximalen Demyelinisierung, wieder abzufallen auf 20,08±2,87g bei den k.o.-mäusen und 19,33±2,17g bei den Kontrollen. Nach dem Absetzen des Cuprizone

60 Ergebnisse 60 erfolgte eine rasche Gewichtszunahme in beiden Gruppen, die bei den Kontrollen 7,99g und bei den k.o.-tieren 6,72g betrug (Kontrollen 27,32±2,00g; k.o.-tiere 26,8±1,03g). In den folgenden zwei Wochen sank das Gewicht bei beiden Gruppen wieder geringfügig (Kontrollen um 1,74g und k.o.-tiere um 0,56g) und zeigte dann steigende Tendenz, um am Ende des Versuches gleiche Werte mit 29,2g (±1,20 bei den Kontrollen und ±1,31 bei den IFN-β-k.o.-Tiere) aufzuweisen. Allgemein kann man in der Abbildung 8 erkennen, dass der Gewichtsverlauf beider Populationen in einigen Punkten geringgradig divergiert in der Tendenz jedoch gleichen Verlauf aufweist p = 0,044 p = 0,023 Gewicht [g] p = 0, Versuchswochen Abb.9: Vergleich der Gewichtsverläufe in [g] von Kontrollen und IFN-β-k.o.-Tieren über einen Zeitraum von 12 Wochen. Die Kontrollen sind als gefüllte Kreise dargestellt, IFN-βk.o.-Tiere als leere Kreise. Die Remyelinisierungsphase ab der 6. Versuchswoche ist grau unterlegt. Wie erwartet konnte das Minimalgewicht während des Versuches in der 6. Woche ermittelt werden, dieser Befund tritt zusammen mit dem Maximum der Demyelinisierung auf. Beide Tiergruppen zeigten ähnliche Gewichtsverluste.

61 Ergebnisse Unterschiede im Habitus und Verhalten zwischen Kontrollen und IFN-β-k.o.- Mäusen Im Habitus und Verhalten zeigten beide Tiergruppen keine wesentlichen Unterschiede. Ab der dritten Woche erschien das Fell der Tiere nicht mehr so glatt und glänzend wie zu Beginn des Versuches und die Tiere wiesen eine geringfügig verlangsamte Motorik auf. Diese Beobachtungen blieben bis zum Absetzen des Toxins bestehen, nach Umstellung der Diät auf Normalfutter kam es jedoch in der 7. Woche zur Reversion und Normalisierung dieser Befunde Ergebnisse der Demyelinisierung und Remyelinisierung bei IFNβ-k.o.-Mäuse und Kontrolltieren Der Grad der Myelinisierung wurde durch die Färbung mit LFB und immunhistochemisch mit den Markern PLP, MBP und MOG bestimmt. Alle Färbungen wurden von drei unabhängigen geblindeten Personen anhand einer Skala von 0-3 ausgewertet, wobei ein Wert von 3 für die maximale Demyelinisierung steht. In der Tabelle und den Abbildungen ist der Mittelwert der drei Auswertungen angegeben. Innerhalb der ersten sechs Wochen kam es zur toxinbedingten Demyelinisierung des Corpus callosum. Innerhalb der ersten drei Wochen des Versuchs zeigten sich bei allen Färbungen starke Myelinverluste in beiden Tiergruppen. Zu diesem Zeitpunkt wiesen in der MBP-Färbung und der LFB-Färbung im Vergleich mit der MOG- und PLP-Färbung die genetisch veränderten Tiere einen geringeren Myelinisierungsgrad auf als die Kontrolltiere. Dieser Unterschied ist in der LFB-Färbung mit einem Myelinisierungsgrad von 1,47±0,83 für die IFNβ-k.o.-Mäuse und 2,2±0,41 für die Kontrollen signifikant (p= 0,019), dargestellt in den Abbildungen 10 und 11. Bei allen Färbungen lag bei beiden Tiergruppen das Maximum des Myelinverlustes in der sechsten Versuchswoche. Hierbei wiesen, bis auf die Färbung mit dem Marker MBP, die k.o.-tiere in allen Färbungen einen geringeren Wert als die Kontrollen auf. Für den Marker MOG ergab sich, mit Werten von 2,43±0,73 für die genetisch veränderten Tiere und 3,0±0,00 für die Kontrollen, ein statistisch signifikanter Unterschied mit p=0,03 (Abb.14 und 15).

62 Ergebnisse 62 Nach dem Absetzen des Toxins kam es bei allen Tieren in der 7. Woche zur Remyelinisierung. Hierbei fiel auf, dass in allen Färbungen außer für den Marker MBP (Abb.14) die k.o.-tiere gegenüber den Kontrolltieren signifikant schneller remyelinisierten. Der Myelinisierungsgrad lag in der 7. Versuchswoche in der LFB- Färbung für die IFNβ-k.o.-Mäuse bei 1,07±0,70 und den Kontrolltieren bei 1,67±0,49 mit p=0,031 (Abb.10 und 11). Für die IFNβ-k.o.-Mäuse ergab sich in der PLP-Färbung ein Wert von 1,33±0,62 und für die Kontrollmäuse von 2,3±0,65 (p=0,003)( Abb.12 und 13); sowie in der MOG-Färbung für die genetisch veränderten Mäuse ein Myelinisierungsgrad von 1,13±0,61 und für die Kontrollen von 2,13±0,58 (p=0,001) (Abbildung 15 und 16). Beide Tiergruppen zeigten annähernd synchrone Myelinbildung im weiteren Verlauf der Remyelinisierungsphase. Die Ausgangswerte konnten jedoch in der 12. Woche nicht erreicht werden. Des weiteren ist festzustellen, dass das Myelin-Oligodendrozyten- Glykoprotein (MOG) im Vergleich mit PLP und MBP langsamere Myelinbildungstendenz nach dem Absetzen des Cuprizone aufwies. Im Vergleich mit den Kontrollen bilden die k.o.-tiere jedoch schneller MOG-anfärbbare Fasern. Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehen. Es lässt sich aus den Ergebnissen der Myelinisierung folgern, dass die k.o.-tiere eine geringere Demyelinisierungstendenz in der dritten Woche des Versuches aufwiesen, sich zum Demyelinisierungsmaximum an die Kontrollen annäherten jedoch in der ersten Woche nach dem Absetzen des demyelinisierenden Agens schneller als die Kontrolltiere remyelinisierten.

63 Ergebnisse 63 LFB PLP Kontrolle IFNβ-k.o. Kontrolle IFNβ-k.o. 0 0,25±0,45 0,50±0,67 0,08±0,29 0,08±0,29 3 2,2±0,41 1,47±0,83 1,5±0,46 1,47±0,70 6 2,87±0,35 2,6±0,83 2,87±0,35 2,67±0,49 7 1,67±0,49 1,07±0,70 2,3±0,65 1,33±0,62 9 0,6±0,51 0,73±0,46 1,67±0,49 2,1±0, ,07±0,59 0,93±0,59 1,47±1,19 1,27±0,84 Versuchswochen Versuchswochen MBP MOG Kontrolle IFNβ-k.o. Kontrolle IFNβ-k.o. 0 0,17±0,39 0,38±0,48 0,25±0,45 0,21±0,40 3 1,93±0,92 1,57±0,90 1,27±0,53 1,33±0,70 6 2,13±0,64 2,33±0,75 3,0±0,00 2,43±0,73 7 0,75±0,64 0,93±0,80 2,13±0,58 1,13±0,61 9 0,77±0,75 1,23±0,82 2,03±0,64 1,63±0, ,08±0,79 0,83±0,65 1,5±0,71 1,27±0,56 Tabelle 2: Dargestellt sind die Mittelwerte aus drei geblindeten Auswertungen für die Myelinfärbungen LFB, PLP, MBP und MOG. Ein Myelinisierungsgrad von 3 entspricht dem Maximum der Demyelinisierung des Corpus callosum, ein Wert von 0 dem Minimum bez. der vollständigen Myelinisierung. Hell unterlegt ist der Zeitraum der Toxingabe (bis zur 6. Versuchswoche), dunkel unterlegt stellt sich die Remyelinisierungsphase dar. Signifikante Unterschiede mit p 0,05 sind mit einem Stern gekennzeichnet.

64 Ergebnisse 64 A Kontrollen IFN-β-k.o. B C 6 Wo. 3 Wo. D E Abb. 10: A zeigt den Balken vor Versuchsbeginn in der LFB-Färbung. Die IFN-β-k.o.- Mäuse (C) wiesen zum 3 Wochenzeitpunkt eine geringere Demyelinisierung und in der frühen Remyelinisierungphase (7 Wochen: E) bereits mehr Myelin, als die Kontrolltiere (3 Wochen: B, 7 Wochen: D, 0 Wochen: A). Der angegebene Balken entspricht 0,1mm. Die längs verlaufenden Fasern (untere Bereich des Balkens) bleiben dunkler gefärbt und wurden nicht mit in die Beurteilung einbezogen.

65 Ergebnisse p = 0,019 Myelinisierungsgrad 2 1 p = 0, W 3W 6W 7W 9W 12W Versuchswochen Abb. 11: Verlauf der Myelinisierung dargestellt anhand des Scorings der Übersichtsfärbung LFB. Angegeben ist der Score von 0 (Maximum der Myelinisierung) bis 3 (Minimum der Myelinisierung). Die Unterschiede in der 3. und 7. Woche zwischen Kontrollen (gefüllte Kreise) und IFN-β-k.o.-Tiere (leere Kreise) erwiesen sich als signifikant. Die Remyelinisierungsphase ab der 6. Versuchswoche ist grau unterlegt.

66 Ergebnisse 66 A Kontrollen IFN-β-k.o. B C Abb. 12: (A) zeigt das Corpus callosum vor der Cuprizonegabe. In der PLP-Färbung ist der Unterschied zwischen Kontrollmäusen (B) und schneller remyelinisierenden IFNβ-k.o.- Mäusen (C) zum 7 Wochenzeitpunkt dargestellt. Der angegebene Balken entspricht 0,1mm.

67 Ergebnisse 67 3,5 3,0 p = 0,003 Myelinisierungsgrad 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5 0W 3W 6W 7W 9W 12W Versuchswochen Abb. 13: Die Färbung des Markers PLP zeigte eine statistische signifikant langsamere Remyelinisierung der Kontrollen (gefüllte Kreise) im Vergleich zu den IFN-β-k.o.-Tieren (leere Kreise) in der frühen Remyelinisierungsphase. Angegeben ist der Score von 0 (Maximum der Myelinisierung) bis 3 (Minimum der Myelinisierung). Grau unterlegt ist die Phase der Remyelinisierung. 3,5 3,0 2,5 Myelinisierungsgrad 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5 0W 3W 6W 7W 9W 12W Versuchswochen Abb. 14: Verlauf der Myelinisierung dargestellt anhand der Myelinfärbung für das MBP. Angegeben ist der Score von 0 (Maximum der Myelinisierung) bis 3 (Minimum der Myelinisierung). Kontrollen sind als gefüllte Kreise dargestellt, IFN-β-k.o.-Tiere als leere Kreise. Die Remyelinisierungsphase ab der 6. Versuchswoche ist grau unterlegt.

68 Ergebnisse 68 A Kontrollen IFN-β-k.o. B C 7 Wo. 6 Wo. D E Abb. 15 Immunhistochemische Färbung von MOG. (A) zeigt die Ausprägung des Markers an unbehandelten Tieren. Die IFN-β-k.o.- Mäuse wiesen eine geringere Demyelinisierung zum 6 (C) und 7 (E) Wochenzeitpunkt auf, als die Kontrolltiere (6 Wochen: B und 7 Wochen: D). Der angegebene Balken entspricht 0,1mm.

69 Ergebnisse 69 3,5 p = 0,03 3,0 p = 0,001 Myelinisierungsgrad 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5 0W 3W 6W 7W 9W 12W Versuchswochen Abb. 16: Verlauf der Myelinisierung dargestellt anhand der Myelinfärbung für MOG. Angegeben ist der Score von 0 (Maximum der Myelinisierung) bis 3 (Minimum der Myelinisierung). Grau unterlegt ist die Phase der Remyelinisierung. Die verminderte Demyelinisierung in der 6. Versuchswoche und die schnellere Remyelinisierung in der 7. Woche bei den IFN-β-k.o.- Mäusen (leere Kreise) im Vergleich mit den Wildtyp-Mäusen (gefüllte Kreise) erwies sich als statistisch signifikant Elektronenmikroskopische Ergebnisse Um die immunhistochemischen Ergebnisse zu bestätigen, wurden die in Epon eingebetteten Proben elektronenmikroskopisch beurteilt. Zur Auswertung wurden die unbehandelten Tiere, sowie der 6- und 12-Wochenzeitpunkt ausgewählt. Den Semidünnschnitten war zu entnehmen, dass zum 6 Wochenzeitpunkt (Abb. 17, C/D), im Gegensatz zu den unbehandelten Mäusen (Abb. 17, A/B) das Corpus callosum in beiden Gruppen demyelinisiert vorlag. Die Remyelinisierung ist erkennbar in den Gewebeproben der 12. Woche (Abb. 17, G/H). Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den IFN-βk.o.-Tieren konnten nicht festgestellt werden. Somit bestätigten die elektronenmikroskopischen Untersuchungen die Ergebnisse der Myelinfärbung, nach Absetzen des Toxins in der sechsten Versuchswoche kam es bis zur 12. Woche zu Remyelinisierungsvorgängen in beiden Tiergruppen.

70 Ergebnisse 70 Zusätzlich wurde aufgrund der Ergebnisse der Myelinfärbungen und der Oligodendrozytenvorläuferzellenfärbung NG2 der 7 Wochenzeitpunkt ausgewertet. Die G- Ratio zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen beiden Tiergruppen, doch die Anzahl der myelinisierten Axone war in den IFN-β-k.o.-Tieren mit einem Mittelwert von 63,80±4,52 signifikant höher als in den Kontrolltieren mit 54,52±3,23 (p= 0,044) (Abb. 17, E/F u. Abb.18). Abb. 17: In den elektonenmikroskopischen Aufnahmen zum 0 Wochen Zeitpunkt (A: Kontrolltiere, B: IFN-β-k.o.-Tiere), dem 6 Wochenzeitpunkt (C: Kontrolltiere, D: IFN-βk.o.-Tiere) und dem Versuchsende mit 12 Wochen (G: Kontrolltiere, H: IFN-β-k.o.-Tiere) ist erkennbar, dass der Balken bis zur sechsten Woche unter Cuprizonegabe demyelinisiert und nach Absetzten des Toxins remyelinisiert. Zum 7 Wochenzeitpunkt lagen bei den IFNβ-k.o.-Tiere (F) signifikant mehr Axone myelinisiert vor als bei den Kontrolltieren (E). (Alle Aufnahmen wurden in der 8000 fachen Vergrößerung erstellt)

71 Ergebnisse 71 Kontrollen Interferon-β-k.o. A B C D E F G H

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